细胞因子检测
细胞因子检测
1.细胞增殖法
原理： 一些细胞因子可专一刺激某些细胞增殖，而且 细胞增殖的程度与这些细胞因子活性呈正相关。
如：IL-2 —— T细胞， IL-3 ——肥大细胞，IL-6 ——浆细胞。 这些只依赖某种细胞因子才能生长的细胞系称为 依赖细胞株。
如人IL-2对鼠T细胞有生长支持作用 一定数量鼠T细胞+ 每孔分别加不同剂量的IL-2
IL-6诱导肝细胞产生-抗用相关试验来检测 验干扰素含量。
血凝素生成抑制试验：
小鼠脑脊髓心肌炎病毒可感染人肺癌A549细胞，该病毒 在生长过程中可产生血凝素，使人O型RBC凝集
试验管：A549细胞（已长好） 加一定量干扰素 培
养一定时间 加病毒
第十四章 细胞因子检测 P150
一.细胞因子检测应注意的问题
1.欲了解机体免疫功能，应检测多项细胞因子， 如细胞免疫应测IL-2、TFN-γ等
2.局部取标本：细胞因子由局部细胞产生，在 血液中浓度极低，最好取局部体液或细胞
3.动态检测比较，如疾病的复发期、缓解期、 恢复期
4.同一细胞因子选用多种方法联合检测，各种 方法检测结果不一定平衡
二.检测方法（P161）
生物学方法 免疫学方法 分子生物学方法
（一）生物学方法
原理：根据不同细胞因子生物学活性（功能) 不同而设计的方法
如IL-2可促进T淋巴细胞生长； TNF可杀肿瘤细胞； CSF可刺激造血细胞形成集落； IFN可保护细胞免受病毒攻击。
具体方法：
细胞增殖法 靶细胞杀伤法 诱导的产物分析法 细胞病变抑制法
利用细胞因子基因探针检测特定的细胞因子 mRNA表达的技术
常用方法：斑点杂交、逆转录PCR、 Northern blot、细胞或组织原位杂交等
《细胞因子的检测》课件
干细胞分泌的细胞因子具有促进组织再生和修复的作用，可用于治 疗多种疾病。
基因治疗
通过将具有治疗作用的基因导入细胞，调控细胞因子的表达，达到治 疗遗传性疾病和罕见病的目的。
04
细胞因子检测的挑战与展望
检测灵敏度与特异性
检测灵敏度
提高检测方法的灵敏度，降低检测限，以便更早地发现细胞 因子的存在。
挑战
面临的挑战包括如何提高检测方法的 实用性和可靠性，以及如何降低检测 成本，使其更易于在临床推广应用。
05
案例分析
案例一：肿瘤细胞因子检测
总结词
肿瘤细胞因子检测是利用细胞因子作为生物标志物，对肿瘤进行早期诊断、病情监测和疗效评估的方 法。
详细描述
肿瘤细胞因子检测通过检测肿瘤细胞分泌的细胞因子，如肿瘤坏死因子、白介素等，来判断肿瘤的存 在、发展阶段和预后情况。该方法具有无创、灵敏度高、特异性强等优点，有助于提高肿瘤的诊断准 确性和治疗效果。
案例三：感染性疾病细胞因子检测
总结词
感染性疾病细胞因子检测是利用细胞因子作 为生物标志物，对感染性疾病进行诊断和病 情监测的方法。
详细描述
感染性疾病细胞因子检测通过检测患者体内 异常升高的细胞因子，如白介素-1、白介素 -6等，来判断感染性疾病的类型和严重程度 。该方法有助于早期发现感染源，为患者提 供及时有效的治疗，同时有助于评估治疗效 果和预后情况。
药物研发
药物筛选
通过检测细胞因子水平的变化，可以筛选出具有潜在治疗作用的 候选药物。
药物疗效评估
在药物研发过程中，检测细胞因子水平的变化可以评估药物的疗 效和作用机制。
个体化治疗
根据患者细胞因子表达水平的差异，可以制定个体化的治疗方案 ，提高治疗效果。
细胞因子检测与临床意义
细胞因子检测与临床意义细胞因子种类包括：白细胞介素、干扰素、趋化因子、肿瘤坏死因子、转化生长因子β 家族、集落刺激因子或生长因子。
细胞因子检测临床应用：1.脓毒症目的：评估全身炎症反应综合征的状态检测因子：TNF-a、IIL-1、IL-6、IL-12、IL-8、MIF、sCD74、HMGB1等IL-6临界值为52.6 pg/mL时可诊断败血症，当其超过348.92 pg/mL时可诊断败血症休克，且28天病死率明显增高。
TNF-α随着脓毒症疾病进展而升高，TNF-α的高表达提示患者预后不良。
IL-8是强烈的中性粒细胞趋化因子，在早期预测脓毒症有重要价值，其诊断敏感度和阴性预测值均比PCT高。
IL-8还可以预示脓毒症患者存在多器官功能障碍可能，可作为脓毒症患者的死亡风险指标。
IL-10是机体关键的抗炎性细胞因子，IL-10升高与脓毒症不良预后相关，持续高表达的IL-10反映脓毒症处于免疫抑制状态。
HMGB1可促进促炎性细胞因子的释放，诱导中性粒细胞、DC等细胞活化。
HMGB1水平与脓毒症休克患者预后密切相关，HMGB1水平越高，患者的预后越差，HMGB1可作为脓毒症病情变化的重要监测指标。
巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是一种具有多效炎症介质功能的细胞因子，包括抑制巨噬细胞迁移、化学趋化作用及促进白细胞在炎症部位募集。
脓毒症及脓毒症休克患者血清中MIF浓度显著升高，并与疾病严重程度相关。
2.感染炎症因子IL-6、TNF-α和抗炎因子IL-10等可用于急性感染的早期诊断、评价病情严重程度及判断预后。
IL-6的升高早于CRP和PCT，其持续时间长，2h达到高峰。
IL-6＞1000ug/L，提示预后不良。
IFN-γ：病毒感染患者主要升高的细胞因子，IFN-γ显著升高、伴随IL-6、IL-1β、IL-8、IL-10和TNF-α等因子升高，多提示为病毒感染。
IL-6和IL-10＞正常值的10倍以上，考虑革兰阴性菌感染。
细胞因子7项检测的说明
细胞因子7项检测的说明1. 什么是细胞因子检测？好啦，今天咱们来聊聊一个听起来挺高大上的话题——细胞因子检测。
别担心，不用背什么复杂的术语，咱们就像在茶馆聊天一样，轻松愉快。
细胞因子，简单来说就是咱们身体里的一些小信使，它们帮助调节免疫系统，像个小精灵一样，在体内穿梭，传递信息。
细胞因子检测就像是给这些小精灵做个体检，看看它们的状态如何，能不能把咱们的免疫系统调得更加给力。
1.1 检测的意义说到检测的意义，简直就是一部大片啊！想象一下，你在打游戏，突然屏幕上出现了一个小提示：“你的角色状态不佳，快去补给！”这就是细胞因子检测的作用。
通过检测，我们可以了解到身体的免疫反应是否正常，是否存在潜在的疾病，甚至可以提前预判一些问题，像个神预言家一样，给咱们的健康把把关。
1.2 细胞因子的种类细胞因子可多了，七项检测听上去就像一场音乐会，里面有主唱、吉他手、鼓手等等。
它们分别是：肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL1、IL2、IL6、IL10），还有干扰素（IFN）。
每一项都有自己的特点，像不同乐器演奏出的旋律，合在一起才能奏响健康的交响曲。
2. 检测的过程说到检测，很多人会担心，啊呀，要抽血吗？对的，没错，细胞因子检测确实是需要抽血的，听起来有点紧张，但实际上，抽血就像是捡个小便宜，可能有点疼，但为了健康，值得啊。
首先，你得去医院或者诊所，前台的小姑娘会给你登记，像是在填一份VIP通行证，接着就是护士小姐姐出场，温柔地告诉你，稍微捏一下拳头，深呼吸，不用太紧张哦。
然后就抽一管血，咕咚一下，搞定！2.1 检测结果解读等着结果的时候，就像等快递，心里七上八下的。
结果出来后，你可能会看到一些数据，别慌，这些数字就像考试卷上的分数，医生会根据你的情况来给你解读。
比如说，如果某项细胞因子的水平偏高，那可能说明你的身体在和某种疾病作斗争，或者免疫系统在“开会”呢。
如果一切正常，那就恭喜你，继续保持健康的生活方式，咱们要做个“健康达人”！2.2 注意事项不过，做检测也有一些小窍门，首先，最好提前预约，不然一到医院就像去赶集，热闹得很。
10种常用细胞因子检测方法盘点
10种常用细胞因子检测方法盘点细胞因子是一类在细胞间相互作用中发挥重要作用的蛋白质，对免疫调节、炎症反应、细胞增殖和分化等过程起着关键的调控作用。
因此，检测细胞因子的水平对于研究疾病发病机制、诊断和治疗具有重要意义。
以下是常用的10种细胞因子检测方法盘点：1. 酶联免疫吸附法（ELISA），ELISA是一种常用的细胞因子检测方法，通过将待检测的细胞因子与特异性抗体结合，然后用酶标记的二抗结合，最后通过底物染色来检测细胞因子的含量。
2. 免疫荧光法（IF），IF方法利用激光共聚焦显微镜观察标记的抗体与细胞因子结合的情况，适用于定量和定位分析。
3. 流式细胞术（FCM），FCM结合荧光标记的抗体，可以对多种细胞因子进行快速、高通量的检测和分析。
4. 生物传感器技术，生物传感器技术结合了生物学和传感器学的优势，可以实现对细胞因子的高灵敏度、高选择性检测。
5. 蛋白质芯片技术，蛋白质芯片技术可以同时检测多种细胞因子的含量，具有高通量、高灵敏度的特点。
6. 质谱法，质谱法可以通过检测细胞因子的质荷比来定量和鉴定细胞因子。
7. 生物学功能法，生物学功能法通过观察细胞因子对细胞生物学功能的影响来间接检测细胞因子的活性。
8. 核酸杂交技术，核酸杂交技术可以通过检测细胞因子的mRNA水平来间接反映细胞因子的表达水平。
9. 免疫印迹法（Western blot），Western blot可以用于检测细胞因子的蛋白质水平，结合特异性抗体可以实现对细胞因子的定量分析。
10. 细胞因子生物学活性检测，通过细胞因子对细胞增殖、分化、凋亡等生物学活性的影响来检测细胞因子的活性水平。
以上是常用的10种细胞因子检测方法，它们各自具有特定的优势和局限性，在实际应用中可以根据需要选择合适的方法进行检测分析。
细胞因子检测
细胞因子检测
细胞因子检测是一种重要的生物医学检测方法，用于分析生物体内不同细胞产
生的特定蛋白质分子。
细胞因子是一类能调节细胞功能的蛋白质，广泛参与调节免疫反应、细胞增殖和凋亡等生物过程。
通过检测细胞因子的水平，可以帮助医生诊断疾病、评估疗效，以及指导个体化治疗方案的制定。
在细胞因子检测中，常用的方法包括酶联免疫吸附法（ELISA）、流式细胞术、蛋白质芯片技术等。
ELISA是一种常见的定量检测方法，通过将待检测样本加入带
有特异性抗体的酶标记物后，再加入底物使酶发色，通过颜色的变化来反映细胞因子的含量。
流式细胞术主要通过将单个细胞悬浮液通过激光进行检测，可以同时检测多种细胞因子，并分析不同细胞亚群之间的作用关系。
蛋白质芯片技术是一种高通量的检测方法，可同时检测多种细胞因子及其相互作用。
细胞因子检测在临床应用中有着广泛的价值。
例如，在肿瘤治疗中，细胞因子
检测可以评估肿瘤微环境中细胞因子的分泌水平，及时调整治疗方案。
在自身免疫性疾病中，细胞因子检测可以帮助医生了解患者免疫炎症状态，指导用药选择。
在感染性疾病中，细胞因子检测可以帮助快速诊断病原体感染，加快治疗进程。
总的来说，细胞因子检测作为一种重要的生物医学检测方法，为疾病的诊断、
治疗和监测提供了重要的信息。
随着技术的不断进步，相信细胞因子检测将在未来发挥更为重要的作用，为个体化医疗和疾病预防提供更多可能性。
细胞因子九项检测科普
细胞因子九项检测科普什么是细胞因子细胞因子是一类介导细胞间相互作用的蛋白质，它们可以作为信号分子在细胞和细胞之间进行通讯。
细胞因子在机体的免疫反应、炎症反应以及许多其他生理过程中发挥重要的调节作用。
不同类型的细胞产生不同种类的细胞因子，比如肿瘤坏死因子、白细胞介素等。
为什么需要进行细胞因子九项检测细胞因子九项检测是通过检测某些关键细胞因子的水平，来评估机体的免疫状态和炎症程度的一种检测方法。
这些细胞因子的水平变化与很多疾病的发生和发展密切相关，包括慢性炎症性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等。
进行细胞因子九项检测可以帮助临床医生更好地了解疾病的病理过程、判断疾病的严重程度以及制定更合理的治疗方案。
此外，对于某些疾病的预后判断和效果评价也具有一定的参考价值。
细胞因子九项检测包括哪些指标细胞因子九项检测通常包括以下几个重要的指标：1.白细胞介素-2（IL-2）：它是一种重要的T细胞生长因子，对免疫系统的调节具有重要作用。
2.白细胞介素-4（IL-4）：它是一种重要的T细胞细胞因子，能够促进B细胞的增殖和抗体产生。
3.白细胞介素-6（IL-6）：它是一种重要的炎症介质，能够促进炎症反应的发生和发展。
4.白细胞介素-8（IL-8）：它是一种重要的趋化因子，在炎症反应中发挥重要作用。
5.白细胞介素-10（IL-10）：它是一种重要的免疫抑制因子，能够抑制炎症反应和免疫系统的活性。
6.肿瘤坏死因子-α（TNF-α）：它是一种重要的炎症介质，参与许多炎症性疾病的发生和发展。
7.干扰素-γ（IFN-γ）：它是一种重要的免疫调节因子，能够促进宿主免疫系统的抗病毒和抗肿瘤反应。
8.变态反应因子（IgE）：它是一种抗体，参与机体的过敏反应。
9.血清白细胞介素-17（sIL-17）：它是一种炎症介质，与自身免疫性疾病的发生和发展密切相关。
细胞因子九项检测的应用领域细胞因子九项检测在许多疾病的诊断和治疗中具有重要的应用价值。
以下是一些常见领域：1. 免疫性疾病细胞因子九项检测可以帮助医生评估免疫性疾病的炎症程度和免疫状态，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。
细胞因子检测方法
细胞因子检测方法细胞因子是一类存在于细胞内的小分子蛋白质，它们在细胞间扮演着重要的信号传递和调节作用。
细胞因子的产生和释放常常与某些疾病的发生和发展密切相关。
因此，对细胞因子的检测成为了许多疾病的诊断和治疗的重要手段之一。
本文将介绍几种常用的细胞因子检测方法。
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的细胞因子检测方法。
该方法通过专门的ELISA 试剂盒，利用特异性的抗体对目标细胞因子进行检测。
ELISA方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点，可以用于检测多种细胞因子，如白细胞介素、肿瘤坏死因子等。
二、流式细胞术流式细胞术（Flow Cytometry）是一种通过检测细胞表面或细胞内标记物来分析和鉴定细胞的方法。
在细胞因子检测中，可以通过标记抗体来检测细胞表面的特定细胞因子。
流式细胞术具有高通量、高灵敏度、多参数等优点，可以同时检测多种细胞因子的表达水平，并对细胞因子的分布、数量等进行分析。
三、PCR方法聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种常用的分子生物学技术，可以通过扩增目标DNA片段来检测细胞因子的基因表达水平。
PCR方法可以通过设计特异性引物，扩增细胞因子基因的特定区域，并通过凝胶电泳等方法来检测扩增产物的存在与否。
PCR方法具有高灵敏度、高特异性等优点，可以用于定量和定性分析细胞因子的表达水平。
四、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术（Protein Microarray）是一种高通量的蛋白质检测技术，可以同时检测多种细胞因子。
蛋白质芯片技术通过将不同的细胞因子蛋白固定在芯片上，然后与标记有荧光物质的样品中的细胞因子进行特异性结合，最后通过荧光扫描仪来检测荧光信号的强度，从而获得细胞因子的表达水平。
蛋白质芯片技术具有高通量、高灵敏度等优点，可以用于筛选和鉴定细胞因子。
细胞因子检测方法的选择与比较
细胞因子检测方法的选择与比较细胞因子检测是一项广泛应用于生物医学研究和临床诊断的重要技术。
细胞因子是一类具有调节和介导细胞间相互作用的分子物质，包括细胞生长因子、细胞因子、趋化因子等。
细胞因子检测方法的选择对于科学研究和临床诊断的准确性和可靠性起着重要作用。
本文将对细胞因子检测方法的选择与比较进行讨论。
1. 酶联免疫吸附实验（ELISA）酶联免疫吸附实验是一种常用的细胞因子检测方法。
它基于特异性抗体对目标细胞因子的识别，通过酶标记反应产生可观察的颜色或荧光信号来定量细胞因子的含量。
ELISA方法具有高灵敏度和高特异性的优点，可以检测多种细胞因子。
然而，ELISA方法需要专业实验室设备和相关试剂，并且操作复杂，需要一定的技术训练。
2. 流式细胞术流式细胞术是一种光电传感技术，可以同时检测多种细胞因子的分泌水平和细胞表面标志物。
通过将标记有特异抗体的荧光染料与细胞进行共孵育，利用流式细胞术仪器测量染色细胞的荧光强度，并进一步定量细胞因子的含量。
流式细胞术相对于ELISA具有更高的灵敏度和速度，特别适用于高通量筛选和单细胞分析。
然而，流式细胞术需要更高的仪器和设备投入，并且相比于ELISA，其检测结果的可靠性还有待改进。
3. CBA流式细胞阵列CBA流式细胞阵列（Cytometric Bead Array）是一种常用于检测多种细胞因子的新型技术。
它结合了ELISA和流式细胞术的优势，通过将具有不同荧光标记的微粒与抗体反应，进而进行细胞因子的定量分析。
CBA流式细胞阵列具有高灵敏度、高通量和多参数分析的优势，可以同时检测多种细胞因子的含量。
然而，该方法的适用范围受限于可用的抗体和荧光标记物的选择。
4. PCR方法PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的核酸检测技术，可以应用于细胞因子的检测。
PCR方法通过扩增目标细胞因子的DNA片段，进而定量细胞因子的表达水平。
PCR具有高灵敏度和高特异性的优势，尤其适用于低表达水平细胞因子的检测。
细胞因子8项检测方法
细胞因子8项检测方法英文回答：Cytokine 8-Plex Panel.Cytokines are signaling molecules that regulate immune responses. The Cytokine 8-Plex Panel measures the levels of eight cytokines in a single sample. The cytokines included in the panel are:Interferon gamma (IFNγ)。
Interleukin-1beta (IL-1β)。
Interleukin-2 (IL-2)。
Interleukin-4 (IL-4)。
Interleukin-6 (IL-6)。
Interleukin-8 (IL-8)。
Interleukin-10 (IL-10)。
Tumor necrosis factor alpha (TNFα)。
The Cytokine 8-Plex Panel can be used to assess immune function and to diagnose and monitor a variety of diseases, including:Autoimmune diseases.Inflammatory diseases.Infectious diseases.Cancer.The panel is typically performed on blood samples, but it can also be performed on other body fluids, such as cerebrospinal fluid or synovial fluid.Methodology.The Cytokine 8-Plex Panel is performed using amultiplex immunoassay. Multiplex immunoassays are assays that can measure multiple analytes in a single sample. The assays are typically performed using a bead-based platform.In a bead-based multiplex immunoassay, each bead is coated with a capture antibody specific for one of the target analytes. The sample is then incubated with the beads, and the target analytes bind to the capture antibodies. The beads are then washed to remove unbound sample, and a detection antibody is added. The detection antibody is labeled with a fluorescent dye, and it binds to the target analytes that are bound to the capture antibodies. The beads are then washed again, and the fluorescence of each bead is measured. The fluorescence of each bead is proportional to the concentration of the corresponding target analyte in the sample.中文回答：细胞因子8项检测方法。
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细胞因子检测细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质分泌的蛋白质,在体内广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞的增殖与凋亡等重要生理活动,•在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中均起重要作用。
某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达减少,从而参与疾病的发病及病理过程。
1、免疫学检测法其基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。
•如免疫斑点法、ELISA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。
2.、生物学测定法其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株(即靶细胞)•的促增殖作用,以增殖细胞中的DNA的合成或酶活性为指标,间接推算出细胞因子的活性单位,如对IL-1、IL-2等细胞因子活性的检测。
亦可根据某些细胞因子对特定靶细胞的杀伤效应或对病毒的抑制作用进行测定,如对肿瘤坏死因子及干扰素的生物活性测定。
3、分子生物学测定法目前采用的技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交和PCR等。
通过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRNA量,推算出细胞因子的合成量。
一、IL-1的检测(生物活性测定)产生IL-1的细胞种类很多,其中最主要的为单核-巨噬细胞。
IL-1可分为IL-1α(•也称酸性IL-1,pI=5.0)和IL-1β(中性IL-1,pI=7.0)。
两者的分子量和生物活性相似,•只能用抗体检测方法才能区别,常用的生物学测定法对两者都适用。
IL-1•的生物学活性广泛,其检测方法亦较多,包括有小鼠胸腺细胞增殖法、D10G 4.1细胞增殖法及L929细胞增殖法等。
IL-1反应细胞增殖可以通过活性染料染色,显微镜直接计数,3H-TdR或125I-UdR的DNA掺入量或以活性细胞代谢率为指标来表示。
本试验介绍L929细胞增殖MTT比色法。
（一）IL-1的诱生体外试验可用LPS等有丝分裂原诱导单核-巨噬细胞产生IL-1,或用P388D1(鼠),THP-1(人)细胞株制备IL-1。
本试验以小鼠巨噬细胞制备IL-1。
1、取6～10周龄BALB/c或C57BL/6小鼠,雌雄均可,拉颈处死后用酒精消毒。
2、用带9号针头的5ml注射器腹腔注入5ml冷的含5％小牛血清的Hanks液(5•％•NBS-HBSS),轻揉腹部吸出腹腔液体(内含腹腔细胞),反复抽吸几次。
3、1500r/min离心8min,洗细胞2次。
4、将腹腔细胞用含10％小牛血清的RPMI-1640液(10％NBS-RPMI-1640)配成2×106/ml,加到24孔平底培养板,1ml/孔,置5％CO2,37℃温箱孵育2h。
5、每孔用5％NBS-HBSS洗3次,弃去未粘附细胞,贴壁细胞为巨噬细胞单层。
6、将LPS(10μg/ml)加入巨噬细胞单层,每孔1ml,培养4h；加入10％NBS-1640 •1ml继续培养至48h,收集上清液,置-20℃冰箱保存,待测IL-1活性及含量。
（二）L929细胞增殖MTT比色法MTT比色分析法的原理是利用四甲基偶氮唑盐[3-(4.5-dimethylthiazol-2-y1)-•2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下,被还原成兰黑色的MTT-甲,形成MTT-甲的量与细胞增殖程度呈正相关。
•故通过测定细胞形成MTT-甲量,可间接定量分析细胞的增殖情况,具体步骤如下:1、将生长成单层的L929细胞用0.25％胰酶消化2～3min。
除去消化液后,用10% FCS的RPMI-1640将L929细胞配成1×105/ml,加入96孔细胞培养板中,每孔100μl。
2、取100μl不同稀释度的IL-1标准品和待测品,分别加入各孔中,每孔设3个复孔•,置37℃,5% CO2温箱孵育56h。
3、用PBS溶解MTT为5mg/ml,用0.22μm膜滤器除菌及杂质。
4、上述培养体系取出后,每孔加入10μl MTT(5mg/ml),37℃继续培养4h。
5、从每孔吸出100μl上清弃去,加酸化异丙醇或加DMSO 100μl/孔,•充分混匀以溶解底物。
酸性条件使培养液中酚红指示剂变为黄色,以利于对MTT-甲转化物的测定。
6、将微量测定板置室温数分钟,保证转变的底物结晶被溶解。
7、用酶标光度计以检测波长为570nm,参考波长为630nm分别测量OD值。
测定应在酸化异丙醇加入后1h内完成。
OD570nm－OD 630nm,再减去培养液对照的OD值。
8、用IL-1标准品各稀释度IL-1含量(X)和各稀释度对应的OD值(Y)作直线回归,按上述概率单位分析法计算待测样品IL-2的活性单位(u/ml)。
（三）注意事项1、IL-1诱生剂的浓度,培养条件和细胞浓度对结果均有明显影响,•应进行预试验以确定最佳实验条件。
2、培养器皿和研磨条件：24孔培养板培养细胞活率较高,但生长稍慢。
玻璃瓶培养有时会因玻璃质量和清洗不净引起细胞死亡,故应注意采取相应措施。
•大量培养时用大容量瓶比较方便,可减少操作中的污染。
研磨组织可用玻璃匀浆器、不锈钢网。
二、TNF的检测(免疫学测定法,双抗体ELISA夹心法)（一）原理选用两种针对rHuTNF-α分子不同表位的单克隆抗体,一种单克隆抗体作为包被抗体,另一种单克隆抗体作为酶标抗体,如果待测样品中含有TNF-α,则形成抗体-TNF-α-酶标抗体复合物,通过酶催化底物显色,亦可根据标准品OD 值绘制标准曲线,•从标准曲线上查出待检标本中TNF-α的含量。
（二）材料和试剂1、包被抗体: 使用时用包被缓冲液作适当稀释。
2、酶标抗体: 使用时用稀释液作适当稀释。
3、标准品: rHuTNF-α(10ng/ml),使用时用稀释液作倍比稀释。
4、阴性对照液(未免疫鼠Ig)。
5、ABTS底物:2,2'-Azino-bis-(3-ehtylbenzthiozoline 6-sulfonic acid)•,•2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯呆-6磺酸)。
6、96孔ELISA板。
7、0.15mol/L,pH7.4 PBS:配其它液体用。
8、包被缓冲液: 0.05mol/L,pH9.6 Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
9、洗涤液: 0.05％Tween 20-PBS。
10、稀释液:4％PEG-洗涤液(用于稀释标准品和酶标抗体)。
11、底物缓冲液:0.1mol/L,pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。
12、3％H2O2。
13、血清、枸缘酸盐或EDTA抗酸血浆、其它体液及细胞培养上清均可检测,•后者应作适当稀释。
14、ELISA读数仪等。
（三）操作步骤1、包被将稀释好的包被抗体加入ELISA板,100μl/孔,4％放置24h或48h。
2、加待检标本洗涤液冲洗ELISA板3次,加待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品,100μl/孔,37％,1h.标准品稀释方法:取标准品150μl(10ng/ml)倍比稀释7个浓度:5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml和78pg/ml。
3、加酶标抗体:洗板3次,加入稀释好的酶标抗体,100μl/孔,37℃,1h。
4、显色:洗板3次,加入配好的ABTS显色液,100μl/孔,室温或37℃显色15～30min。
5、ELISA读数仪测410nm处OD值,绘制标准曲线。
6、从标准曲线查得待测样品中的TNF-α含量。
四、注意事项1、血清或血浆中残存凝块或红细胞须经离心去除,勿用溶血或脂肪过多的血清。
2、标本在2～8℃可储存3天,超过3天应放入-20℃或-70℃,避免反复冻融.3、分别用加样器头吸取各份标本,避免相互交叉。
4、叠氮钠(NaN3)对辣根过氧化物酶(HRP)有灭活作用,在本实验系统中应避免使用。
5、底物显色液必须临用时配制,双氧水应放置在2～8℃,保存6个月以内。
附: 试剂配制1. 0.15mol/L,pH7.4 PBSKH2PO4 0.2gNa2HPO4·12H2O 2.9gNaCl 8.0gKCl 0.2g双蒸水加至100ml 2. 包被缓冲液Na2CO3 1.59g NaHCO3 2.93g双蒸水加至1000ml 3. 洗涤液PBS 1000ml Tween 20 0.5ml 4. 稀释液洗涤液100ml鸡蛋清0.6mlPEG (聚乙二醇,MW6000) 2.0g NaCl 2.9g5. 底物缓冲液Na2HPO4·12H2O 1.79g拧檬酸1.29g双蒸水加至100ml6. ABS显色液ABTS 5mg底物缓冲液10ml3％H2O2 20μl三、IL-2的检测(基因的检测)细胞因子基因的检测包括对其DNA的检测和mRNA表达的检测,常用的方法有Southern印迹,斑点印迹,PCR,原位杂交及原位PCR等,Northern印迹及RT-PCR。
本文介绍IL-2mRNA的测定(斑点杂交法)。
将RNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上,可用手工操作点样,•也可用斑点式点样器点样,再与特异性探针进行杂交。
•本法可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析。
由于其操作比Northern印迹简单、迅速,所需样品量少,且可在同一张膜上同时进行多个样品的检测,故很适合于临床应用。
亦可用于DNA的检测。
但其缺点是不能鉴定所测基因的分子量。
（一）主要试剂1. RNA提取试剂:TRIZOL试剂(Gibcol,No.15596-026),DEPC水(Fluka,No.980210)2. 质粒提取试剂盒:(Promega:Wizard Minipreps DNA,No.117)3. DNA片段提取试剂盒:(La Jolla)4. 地高辛标记和检测试剂盒:(Boerhinger Mannheim,No.1093657)5. IL-2 DNA探针6. 其他试剂（1) STE溶液0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)（2) 溶液Ⅰ50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris.Cl(pH 8.0)10mmol/L EDTA(pH 8.0)可配100ml,高压灭菌15min,贮存于4℃（3) 溶液Ⅱ0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液稀释) 1%SDS (配20%贮存液)盖紧瓶盖,颠倒离心瓶数次,以充分混匀内容物.于室温放置5～10min（4) 溶液Ⅲ5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L ,对乙酸根是5mol/L（5) 含相应抗生素的LB培养基（6) 氯霉素(0.25g/2ml)--->终浓度170μg/ml（7) 溶菌酶(10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl pH8.0) 1ml （8) 无水乙醇(部分-20℃预冷).异丙醇.75%乙醇(部分4℃预冷)（9) TE缓冲液(pH8.0)（10)5mol/L LiCl 1.5ml（11)RNA酶,RPMI-1640,胎牛血清(FCS),ConA(刀豆蛋白A)等（12)500μl 含13%(W/V)聚乙二醇(PEG 800)的1.6mol/L NaCl（13）3mol/L NaAc、饱和酚、氯仿:异戊醇(24:1)（二）主要仪器CO2培养箱:美国Forma Scientific产品;无菌操作台:苏州净化设备公司产品;图象处理分析仪:同济医大太阳公司产品;低温高速离心机:上海离心机械研究所.（三）IL-2质粒DNA探针的大量制备1、含IL-2质粒DNA探针的提取取含IL-2质粒DNA的单个菌落置两个25ml LB培养基(含100μg/ml Amp)↓37℃220r/min 振摇过夜(约16h)取10ml菌液加200ml LB培养液(含100μg/ml Amp)↓37℃150r/min 振摇4h加氯霉素(终浓度170μg/ml)↓37℃220r/min 振摇3h菌液倒入300ml离心管中离心↓4℃5000r/min×10min离心弃上清除去残液(吸水纸无菌)每管加40ml STE溶液(冰预冷)悬浮细菌后,用移液管转入到50ml离心管中↓4℃5000r×15min离心弃上清,加5ml溶液Ⅰ(冰预冷)悬浮细菌,加1ml新配制(pH8.0)的溶菌酶(10mg/ml)↓轻摇,室温静置5min加10ml溶液Ⅱ,盖上盖子,将离心管小心颠倒数次混匀液体,不要用旋涡振荡器↓冰浴10min,且勿摇动加7.5ml溶液Ⅲ(冰预冷),轻振荡离心管数次使之混合↓冰浴20～30min,使沉淀完全,4℃12000r/min×20min离心取上清到另一50ml离心管中,加0.6体积异丙醇,混匀,室温静置15min↓室温5000r/min×15min离心弃上清用75%乙醇洗涤沉淀一次(不将沉淀悬浮),倒出乙醇,倒置吸水纸上,使乙醇挥发用1.5mlTE(pH8.0)将沉淀溶解,加等体积冰预冷的5M LiCl,混匀后置冰浴10min↓4℃12000r/min×10min离心取上清至新EP管, 加等体积的异丙醇(约3ml),充分混匀,室温静置15min↓室温12000rmin×10min离心(回收沉淀的核酸)小心去上清,将管倒置以使最后残留的液滴流尽,用75%乙醇洗涤沉淀,流尽乙醇,•用吸纸吸去附于管壁的液滴,将管倒置在纸巾上数分钟,以使最后残余的痕量乙醇蒸发用500μl TE(pH8.0)溶解DNA沉淀,移至新EP管中,加入RNA酶(终浓度100μg/ml)↓37℃水浴30min加等体积(500μl)含13%(W/V)PEG(800)的1.6mol/L NaCl,充分混合↓4℃12000r/min×5min离心吸去上清,用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀加等体积饱和酚(400μl)混合↓12000r/min×10min离心吸上层水相移至另一EP管,加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)剧烈混匀呈乳白状↓12000r/min×10min离心吸上层水相移至另一EP管,加等体积氯仿:异戊醇(24:1)混匀↓12000r/min×10min离心吸上层水相移至新EP管(硅化),加入0.1体积的3mol/L NaAc(pH5.2)和2体积的-20℃预冷的无水乙醇,混匀(可见沉淀出现),置-20℃2h或0℃20min↓4℃12000r/min×15min离心弃上清,加75%乙醇(4℃预冷)200μl,稍加振荡,离心洗涤2次↓4℃12000r/min×5min离心去上清敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽溶沉淀于11μl TE溶液中↓↓取1μl电泳其余进行酶切2.、经0.7％琼脂凝胶电泳,确定有质粒DNA后,用XhoI进行酶切。