雷公藤红素诱导CM一T细胞凋亡的机制研究E6
雷公藤的药理作用研究进展
雷公藤的药理作用研究进展胡德俊;彭泽燕;何东初【摘要】雷公藤是一种化学成分复杂的中草药,随着基础和临床研究的深入,其药理作用的研究内容也日益丰富.雷公藤具有抗炎、调节免疫、镇痛、抗动脉粥样硬化、抗排异、抗肿瘤、抗生育、抗支原体、抗艾滋病毒、保护神经、保护肾脏、保护关节软骨等多种药理作用.该文综述了雷公藤的药理作用研究进展,为雷公藤的进一步研究提供理论基础,为雷公藤的临床合理应用提供参考.【期刊名称】《医药导报》【年(卷),期】2018(037)005【总页数】7页(P586-592)【关键词】雷公藤;药理作用;合理用药【作者】胡德俊;彭泽燕;何东初【作者单位】湖北省咸丰县中医院风湿科,咸丰445600;中国人民解放军武汉总医院中西医结合科,武汉430070;中国人民解放军武汉总医院中西医结合科,武汉430070【正文语种】中文【中图分类】R282.71;R285.6雷公藤(Tripterygium Wilfordii)的药用部位为卫矛科植物雷公藤的根，其别名众多，常用的有断肠草、钩吻。
其性寒，味苦，有大毒，归属心、肝、胃、肾四经。
雷公藤具有清热解毒、祛风除湿、舒筋活血通络、消肿止痛、杀虫止痒的功效。
临床常用于治疗类风湿关节炎、急慢性肾小球肾炎等自身免疫性疾病，以及牛皮癣、湿疹等皮肤病，近年来也用于肿瘤的治疗。
现代药理学研究表明：雷公藤治疗上述疾病的机制是通过调节免疫、抗炎等作用实现的。
但其具体作用靶点不明确，仍需进一步探究，笔者综述了雷公藤药理作用的研究进展。
1 化学成分雷公藤的化学成分十分复杂，目前已从雷公藤属植物中分离出380余种成分，就雷公藤一味中药分离出来的化学单体就高达70多种，包含生物碱类，萜类(二萜类、三萜类、倍半萜)以及糖类，其活性成分大部分为萜类物质和生物碱类[1]。
近年来新兴的网络药理学也被用于雷公藤药理的研究，利用计算机模拟直观展示了雷公藤治疗类风湿关节炎的多成分、多靶点、多途径作用。
雷公藤主要活性成分对黑色素瘤细胞作用的研究进展
中国循证医学杂志，2015，15（2）：206-214. [3] 陈如平，李红宇，王昌兴.雷公藤对类风湿性关节炎的影响[J].河
南，付海燕，等.雷公藤内酯醇诱导人脉络膜黑色
雷公藤红素（Celastrol）是植物雷公藤中第一个被提取出的 化合物。近年来大量研究发现其药理作用包括免疫抑制，抗纤维 化，抗血管生成等。雷公藤红素因而被视作众多疾病的潜在治疗 方式，研究热度逐年递增。抗肿瘤机制研究方面，Ming等[8]发现 雷公藤红素与替莫唑胺（TMZ）合用能够增强针对黑色素瘤的抗 肿瘤作用，而黑色素瘤本身对TMZ并不敏感。雷公藤红素与TMZ 协同抑制黑色素瘤细胞的增殖，能够提高泛素化蛋白质的水平，
雷公藤内酯醇（Triptolide），又称雷公藤甲素，为雷公藤提 取物中机制研究最明确、生物活性最强的化合物。李潮[4]等研究 发现雷公藤内酯醇可能通过调节Bax及Bcl-2通路进而诱导人脉络 膜黑色素瘤株OCM-1凋亡。同时，研究表明与细胞凋亡途径关系 密切的caspase-3[5]可能参与了雷公藤内酯醇引起OCM-1细胞株凋 亡的过程。陶玥[6]等证实了雷公藤内酯醇可以抑制人黑色素瘤M14 细胞的增殖活性，可能与其抑制了细胞DNA合成有关。雷公藤内 酯醇可使M14细胞染色质固缩，核深染并出现凋亡小体，因而可 证实药物对细胞的凋亡作用。张亚美[7]等实验证实雷公藤内酯醇 除了可使人黑色素瘤A375细胞凋亡以外，还可产生保护性的内质 网应激性反应。药物可激活ERS下游3条信号通路，诱导细胞凋 亡。除黑色素瘤以外，已有研究表明雷公藤内酯醇也被广泛用于 自身免疫性皮肤病的治疗。 2 雷公藤红素
雷公藤（Tripterygium wilfordii. Hook.f.）为卫矛科雷公藤属木 质藤本植物，从中已分离提取到超过数百种化合物。大量研究表 明其不同活性成分具有抗炎、抗病毒、免疫抑制、抗肿瘤等作 用。恶性黑色素瘤（Malignant Melanoma）为一种恶性程度极高的 皮肤肿瘤，病死率高，侵袭力强，预后极差。因其对放化疗不敏 感，中药活性成分研究成为当下热门。该文主要整理雷公藤活性 成分环氧化二萜内酯化合物雷公藤内酯醇、三萜烯类化合物雷公 藤红素、雷公藤甲素衍生物氯内酯醇对恶性黑色素瘤细胞增殖、 凋亡、迁移与侵袭等的作用机制，进行以下综述。 1 雷公藤内酯醇
雷公藤红素治疗类风湿关节炎的研究进展
雷公藤红素治疗类风湿关节炎的研究进展作者：刘梦亚赵向峰来源：《风湿病与关节炎》2020年第01期【摘要】雷公藤红素是近年研究较多的一种中药提取物，已知其对炎症、自身免疫性疾病、癌症、糖尿病、动脉粥样硬化等均有疗效，尤其对类风湿关节炎效果显著。
检索近3年来国内外发表的有关雷公藤红素治疗类风湿关节炎的文献，并对其进行归纳、整理，对雷公藤红素治疗类风湿关节炎的研究进展进行综述。
【关键词】关节炎，类风湿;雷公藤红素;综述雷公藤是一种传统中草药，又名断肠草、黄藤根等，主产于浙江、江苏、安徽、福建等地，性味苦、辛，寒，有大毒，归肝肾经，具有祛风湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒的功效，常用于治疗风湿痹证、麻风、顽癣、湿疹、疥疮、疔疮肿毒等[1]。
目前为止，雷公藤中的化合物包括46种二萜、20种三萜、21种生物碱类化合物，以及其他小分子物质，雷公藤红素（Celastrol）是从中提取出来的一种三萜类化合物，其含量丰富且具有临床应用前景[1-2]。
目前，已有学者证明，雷公藤红素具有多种药理活性，可用于抗肿瘤、抗炎、糖尿病的治疗等[3-5]。
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性、全身性自身免疫性疾病，其基本病理改变是滑膜炎、血管翳的形成，并逐渐出现关节软骨和骨的破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。
RA病因及发病机制尚不清楚，有研究证实，其与环境、遗传及免疫系统紊乱相关[6]。
活化的T细胞浸润滑膜为其发病的主要机制，活化的T细胞通过分泌细胞因子等吸引其他类型的细胞如中性粒细胞、巨噬细胞和成纤维细胞到局部，这些细胞与各种效应分子（如前列腺素、蛋白水解酶和其他破骨因子等）形成了炎症微环境并诱导关节炎症和软骨破坏;破骨细胞通过分泌基质降解酶，如基质金属蛋白酶（MMPs）和组织蛋白酶K来破坏骨组织，并最终导致关节的畸形及功能的丧失[7-8]。
早在2011年就有雷公藤红素用于治疗关节炎小鼠的报道[9]，近几年来又有不少研究者致力于雷公藤红素作用于RA机制的研究。
雷公藤红素促进人类乳腺癌MDA-MB-453细胞HER2蛋白降解及诱导凋亡的机制
雷公藤红素促进人类乳腺癌MDA-MB-453细胞HER2蛋白降解及诱导凋亡的机制闫燕艳;符立梧【摘要】[Objective] To investigate the mechanism of celastrol degradating HER2 protein and inducing cell apoptosis in MDA-MB-453 cells. [Methods] The cytotoxicity of celastrol to MDA-MB-453 cells was measured by MTT assay. Apoptotic morphology was observed after Hoechst 33258 staining. Sub-C1 DNA peak was analyzed by flow cytometry to quantify the degree of apoptosis. Changes of apoptotic related proteins were analyzed by Western blot. Subcellular distribution of HER2 was observed under fluorescence microscopy by immunoQuorescence assay. [Results] Celastrol exhibited potent cytotoxicity in HER2-overexpressing MDA-MB-453 cells, and IC50 was (5.22 ± 0.29) u.mol/L. After MDA-MB-453 tells were treated with different concentrations of celastrol for 24 h, typical apoptotic bodies, increasing sub-Cl DNA peak and activation of Caspase-3 and Parp were detected in a dose-dependent manner. It was noteworthy that immunofluorescence study with anti-HER2 antibody showed that celastrol disturbed the subcellular distribution of HER2, with decreased location in the plasma membrane. [Conclusion] Celastrol induced MDA-MB-453 cancer cells apoptosis in a dose-dependent manner. Subcellular redistribution of HER2 maybe involved in HER2 protein degradation by celastrol.%[目的]研究雷公藤红素促进人类乳腺癌MDA-MB-453细胞HER2蛋白降解及诱导凋亡的机制.[方法]MTT法检测雷公藤红素对MDA-MB-453的细胞毒作用；Hoechst 33258染色荧光显微镜观察细胞凋亡形态学改变；PI单染流式细胞术检测细胞凋亡率；Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白变化；免疫荧光检测HER2蛋白在细胞中的定位变化.[结果]雷公藤红素对MDA-MB-453有强大的细胞毒作用,IC50为(5.22±0.29)μmol/L;该化合物可浓度依赖性地诱导MDA-MB-453细胞发生凋亡,出现典型的凋亡小体、sub-G1改变及细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Parp的裂解活化.值得一提的是,雷公藤红素作用后,Western Blot检测到HER2蛋白明显降低,并且原先主要表达在细胞膜上的HER2蛋白发生了异位.[结论]雷公藤红素浓度依赖性地诱导MDA-MB-453细胞发生凋亡,并且促进HER2蛋白降解,这可能与改变了HER2蛋白在细胞中的定位有关系.【期刊名称】《中山大学学报（医学科学版）》【年(卷),期】2012(033)004【总页数】5页(P471-475)【关键词】雷公藤红素;HER2;细胞凋亡;蛋白异位【作者】闫燕艳;符立梧【作者单位】山西大同大学医学院药理教研室,山西大同037009;华南肿瘤学国家重点实验室//中山大学肿瘤防治中心,广东广州510060【正文语种】中文【中图分类】R73-36+1HER2受体是EGFR受体家族成员中的第2号，在许多上皮肿瘤，尤其是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和鼻咽癌中过度表达［1］。
雷公藤红素治疗类风湿关节炎的研究进展
雷公藤红素治疗类风湿关节炎的研究进展
雷公藤红素是一种从雷公藤中提取的天然植物化合物，被广泛应用于中药领域。
它具有抗炎、镇痛、免疫调节等多种药理作用，因此被用于治疗类风湿关节炎等炎症性疾病。
本文将探讨雷公藤红素在治疗类风湿关节炎方面的研究进展。
类风湿关节炎是一种常见的慢性自身免疫性关节炎，临床表现为关节肿痛、关节功能障碍等症状。
目前的治疗方法包括非甾体类抗炎药、激素、免疫抑制剂等，但长期使用这些药物会产生一系列严重的副作用。
寻找一种效果明显且副作用较小的治疗方法是十分重要的。
近年来，许多研究都对雷公藤红素进行了临床试验和实验室实验，并取得了一些令人鼓舞的结果。
一项回顾性研究发现，雷公藤红素治疗类风湿关节炎患者的炎症指标明显下降，关节疼痛和功能改善。
一项动物实验显示，雷公藤红素可以显著减少关节炎大鼠的关节肿胀和炎性细胞浸润，并降低炎症介质的表达水平。
还有一些研究探讨了雷公藤红素与其他药物的联合应用。
一项临床试验发现，将雷公藤红素与甲氨蝶呤这种免疫抑制剂联合使用可以显著改善类风湿关节炎患者的疾病活动性和生活质量。
一项实验室研究发现，雷公藤红素与丙戊酸钠结合可以显著抑制炎症细胞的活化，减少关节炎的发展。
雷公藤的药理作用及毒性研究进展
雷公藤的药理作用及毒性研究进展张倩;彭广操;朱明军【摘要】雷公藤作为一种传统中药，所含化学成分复杂，具有多种药理活性，是目前国内外研究的热点天然药物之一。
无论是中药雷公藤还是其制剂在临床上都有广泛的应用。
本研究综述近年来雷公藤药理作用的最新研究进展，旨在阐述雷公藤类药物的发展前景。
【期刊名称】《中西医结合心脑血管病杂志》【年(卷),期】2016(014)015【总页数】2页(P1753-1754)【关键词】雷公藤;药理作用;毒性;制剂;研究进展【作者】张倩;彭广操;朱明军【作者单位】河南中医学院河南郑州 450000;河南中医学院第一附属医院;河南中医学院第一附属医院【正文语种】中文【中图分类】R289.5雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.F.)为卫矛科植物雷公藤的根，味苦、辛，性寒，有毒。
《本草纲目拾遗》记载“出江西者力大，土人采之毒鱼，烦蚌螺之类亦死，其行爆裂”。
归心、肝、肾经。
功效祛风通络、除湿止痛、解毒杀虫。
用于湿热结节、癌瘤积毒，临床常辨证用药用于治疗多种自身免疫性疾病、肿瘤及各种皮肤病等[1-3]。
在治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、急慢性肾小球肾炎、牛皮癣[4]、湿疹等方面的临床疗效显著。
现代药理研究表明其治疗上述疾病的主要机制是通过免疫调节、抗炎、抗细胞增殖[5]等。
至今已从雷公藤中分离出70多种化学单体[6]，包括二萜类、生物碱类、三萜类、倍半萜类等，其中主要成分为二萜类，其中的雷公藤甲素(又称雷公藤内酯醇)被认为是雷公藤多甙的主要活性成分。
其次为生物碱类。
其主要药理作用总结如下。
1.1 免疫抑制雷公藤的免疫抑制作用具有独特、广谱的特点，在治疗自身免疫性疾病中，对机体细胞免疫、体液免疫，对促炎性细胞因子白细胞介素(IL-2)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，γ-干扰素(IFN-γ)和抗炎性细胞因子(IL-4，IL-6，IL-10)均有一定的抑制作用[7]。
雷公藤红素对体外培养变应性接触性皮炎小鼠淋巴细胞凋亡及Caspase-8表达的影响
雷公藤红素对体外培养变应性接触性皮炎小鼠淋巴细胞凋亡及Caspase-8表达的影响陈保疆【期刊名称】《吉林医学》【年(卷),期】2011(032)016【摘要】目的：为了探讨雷公藤红素对变应性接触性皮炎（ACD）小鼠体外培养淋巴细胞凋亡及Caspase-8表达的影响。
方法：以二硝基氯苯制作ACD小鼠模型,体外培养淋巴细胞,雷公藤红素作用48 h后,采用流式细胞仪检测细胞凋亡及Caspase-8浓度。
结果：不同浓度红素对体外培养ACD淋巴细胞凋亡细胞比率均高于对照组;其中中、高浓度组凋亡细胞比率高于低浓度组且具有统计学意义（P 分别〈0.05和0.01）,对ACD淋巴细胞Caspase-8表达与对照组比较差异均具有统计学意义（P分别〈0.05和0.01）。
结论：雷公藤红素可以通过升高ACD小鼠淋巴细胞内Caspase-8浓度,从而诱导淋巴细胞的凋亡。
【总页数】2页(P3173-3174)【作者】陈保疆【作者单位】天津市泰达医院皮肤科,天津300457【正文语种】中文【中图分类】R735.7【相关文献】1.凉血止痒合剂对变应性接触性皮炎小鼠IL-10和IFN-γ表达的影响 [J], 杨瑾;杨雪松2.雷公藤多苷对变应性接触性皮炎小鼠干扰素诱导蛋白10 及其受体表达的影响[J], 李艳华;许建;张振刚;于腾;杜琳3.右美托咪定对感染性休克大鼠脾脏及胸腺caspase-3、caspase-8、caspase-9表达及淋巴细胞凋亡的影响 [J], 姬斌;秦培顺;南洋;黄葱葱;李军4.雷公藤红素对体外培养变应性接触性皮炎小鼠淋巴细胞凋亡及Caspase-8表达的影响 [J], 陈保疆5.雷公藤甲素对体外培养的变应性接触性皮炎小鼠Th细胞Fas表达的影响 [J], 陈保疆;王萍;李晓莉;张玉环因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
雷公藤红素对白血病HL-60和Jurkat细胞增殖及凋亡的影响
雷公藤红素对白血病HL-60和Jurkat细胞增殖及凋亡的影响张晓玲;李爱萍;环飞;秦珩;段金廒【期刊名称】《中国药科大学学报》【年(卷),期】2015(46)1【摘要】探讨雷公藤红素对人急性髓性白血病HL-60细胞、急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞增殖及凋亡的影响。
采用MTT法、Annexin V-FITC/PI双染法、PI 染色法、透射电镜观察不同浓度雷公藤红素作用于两种细胞后对其生长增殖、凋亡、周期及形态等方面的影响。
结果表明雷公藤红素能显著抑制HL-60细胞、Jurkat细胞的增殖,降低其存活率。
给药24 h后,半抑制浓度(IC50)分别为(0.46±1.05)μmol/L和(0.88±1.13)μmol/L。
以剂量依赖方式诱导两种细胞凋亡,细胞周期分布G1期比例增加,S期比例降低(P<0.05),且伴有典型的细胞凋亡形态学改变。
雷公藤红素能显著抑制HL-60细胞、Jurkat细胞的生长增殖,并诱导细胞凋亡。
【总页数】5页(P89-93)【关键词】雷公藤红素;HL-60细胞;Jurkat细胞;凋亡【作者】张晓玲;李爱萍;环飞;秦珩;段金廒【作者单位】南京医科大学公共卫生学院;南京医科大学江苏省医药农药兽药安全性评价与研究中心;南京中医药大学中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心【正文语种】中文【中图分类】R965【相关文献】1.雷公藤红素对人早幼粒细胞白血病NB4细胞增殖和凋亡的影响 [J], 王涤;赵万红;雷鸣;郑雅宏2.雷公藤甲素通过抑制逆转录病毒HERV-K Np9基因转录诱导人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡 [J], 陈将华;郑维威;姜旭东;陆晓雅;徐荣臻3.雷公藤甲素对白血病HL-60和Jurkat细胞增殖及凋亡的影响 [J], 环飞;胡艳辉;秦珩;张晓玲4.雷公藤红素诱导人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡及其机制的研究 [J], 徐银海;严杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
雷公藤药理作用及临床应用研究进展
世界最新医学信息文摘 2019年第19卷第18期15投稿邮箱：sjzxyx88@雷公藤药理作用及临床应用研究进展朱胜楠，张靖，贾路路，谭亲友△（桂林医学院药学院，广西 桂林）摘要：雷公藤具有抗炎、免疫抑制、抗生育、抗肿瘤、抗菌、止痛作用,为目前临床研究热点,但因其毒副作用大阻碍了其临床应用,笔者主要阅读了近5年有关雷公藤药理作用及临床应用方面的国内外资料,发现近年雷公藤研究热点在肿瘤、免疫抗炎、神经退行性疾病等方面。
笔者总结了近年国内外对雷公藤活性成分,药理作用、机制,临床应用以及不良反应方面的最新成果,通过多方面阐述,使对雷公藤有更全面的了解，促进其在临床上更安全有效的使用。
关键词：雷公藤；药理作用；临床应用；进展中图分类号：R285.5 文献标识码：A DOI: 10.19613/ki.1671-3141.2019.18.008本文引用格式：朱胜楠，张靖，贾路路，等.雷公藤药理作用及临床应用研究进展[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(18):15-16.0引言《中药大辞典》等典籍记载雷公藤正名“雷公藤”,异名“震龙根、蒸龙草、断肠草、红紫根、黄腊藤”等，最早见于《本草纲目拾遗》。
明代兰茂所著《滇南本草》(1476年)中,以“紫金皮”异名描述昆明山海棠为:“味辛、性温、有毒。
”清代吴其潜所撰(1848年)《植物名实图考》描述雷公藤为:“江西、湖南极多,通呼为水莽子,根尤毒,长至尺余,俗日水莽兜,亦曰黄藤,浸水如雄黄色,气极臭。
”现代药理研究表明雷公藤具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤、抗生育、抗病毒、神经组织保护等作用。
通过阅读近年文献，笔者发现近期临床上对雷公藤的研究着重在抗肿瘤、抗炎、抗免疫抑制作用和抗神经性退变方面[1，2]。
1 药理作用与机制1.1 抗炎据文献报道，具有免疫调节和抗炎作用的雷公藤单体成分有雷公藤新碱、雷公藤春碱、雷公藤碱戊、雷公藤内酯酮、去甲泽拉木醛、雷公藤甲素、雷公藤红素、雷醇内酯等[3]。
雷公藤的毒副作用及在肾病中的合理应用
雷公藤的毒副作用及在肾病中的合理应用【摘要】雷公藤为我国传统中药，因其具有较强的抗炎、免疫抑制以及足细胞保护作用，已被广泛应用于多种原发和继发性肾脏疾病，尤其在临床治疗棘手的难治性肾病综合征领域，如：膜性肾病、局灶节段肾小球硬化症、糖尿病肾病、过敏性紫癜性肾炎和狼疮肾炎等，展现出独特优势而令人瞩目。
但目前仍有不少临床医生对该药的认识存在较大偏差，或畏惧毒性避而不用、或追求疗效疏于监测，影响了该药的正确使用。
因此，认识雷公藤的药理及毒副作用，掌握正确的防范措施及合理应用方法，将有助于减少药物的不良反应，充分发挥其临床疗效。
【关键词】雷公藤;毒副作用;肾脏疾病味苦、辛，性凉，大毒，为卫矛科植物雷公藤根的去根皮木质部，具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒的功效［1］。
雷公，原为神话中司雷之神，借以为名，以示其毒性之烈，又有断肠草之别名。
不少临床医生因惧其毒性敬而远之，然大毒者大效也，现代研究证实其具有抗炎、免疫抑制和抗肿瘤等多种作用，在风湿免疫性疾病和肾脏病领域，尤其是难治性肾病中都显现出其独特的疗效［2］。
因此，全面了解雷公藤的药理及毒副作用对临床合理应用十分重要。
一、雷公藤成分分析雷公藤成分有生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类及糖类等100多种。
其中主要活性成分为生物碱类和二萜类，毒副作用主要来自二萜类化合物，其次为生物碱。
雷公藤二萜类成分中研究比较清楚且最广泛的是环氧二萜类成分，该类成分具有相同的母核-环氧二萜内酯，其代表成分是雷公藤内酯醇、雷公藤内酯二醇、雷公藤氯内酯醇、山海棠二萜内酯和13-外-19-正-迈诺氧化物-18-羧酸等。
三萜类化合物则可分为齐墩果烷型和木栓烷型，该类成分中很多具有三萜羧酸结构，代表成分有雷公藤红素、雷公藤内酯甲等。
生物碱类成分按结构分为半萜生物碱和精眯类生物碱，代表成分有雷公藤特碱、雷公藤次碱、雷公藤定碱、雷公藤晋碱、雷公藤碱戊等。
其中在肾脏疾病中应用最多的是雷公藤内酯醇（二萜类）和雷公藤红素（三萜类），故以下主要围绕这两种成分展开讨论。
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‘上海免疫学杂志）２ｏｏ３年第２３卷第３期 ・ ｌ８７・ 雷公藤红素诱导ＣＥＭ一６Ｔ细胞凋亡的机制研究 ｊｇ－－笑 ，张登海 ，张玲珍 ，孔宪涛 （１．上海第二医科大学附属新华医院上海儿童医学中心，上海２０００９２；２．同济大学附属上海东方医院，上海２００１￣； ３．第二军医大学附属长征医院实验科，上海２００００３，△同为第一作者）
摘要：在已经证明雷公藤红素能诱导人Ｔ淋巴细胞株ＣＥＭ．６Ｔ细胞凋亡的基础上，进一步探讨此凋亡过程的机制。本项目 研究雷公藤红素诱导ＣＥＭ．６Ｔ细胞凋亡过程中Ｆａｓ／ＦａｓＬ、ＩＣＥ ｍＲＮＡ的变化以及ＩＣＥ抑制剂、磷酸酶抑制剂对凋亡的影响。 结果发现（１）ＣＥＭ．６Ｔ细胞表达Ｆａｓ，不表达ＦａｓＬ，雷公藤红素处理不能改变这一情况；（２）雷公藤红素不能改变ＩＣＥ ｍＲＮＡ 的表达水平，但ＩＣＥ抑制剂Ａｃ．ＹＶＡＤ．ＣＨＯ能使雷公藤红素诱导ＣＥＭ．６Ｔ的凋亡率下降；（３）１．５￣ｏｔ／Ｌ磷酸酶抑制剂ｏｌ－￣ｈｄｃ ａｃｉｄ能使凋亡率下降。提示雷公藤红素诱导ＣＥＭ－６Ｔ细胞凋亡不依赖Ｆａｓ／ＦａｓＬ，而与细胞内原已存在的ＩＣＥ有关，蛋白去磷 酸化参与了此凋亡过程。 关键词：雷公藤红素；淋巴细胞；凋亡 中圈分类号：Ｒ２８２．７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０１．２４７８（２００３）０３．０１８７．０３
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ＣＥＭ－６Ｔ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｔｒｉｐｔｅｒｉｎｅ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｔｒｉｐｔｅｒｉｎｅ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＣＥＭ．６Ｔ。ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｆ￣／ＦａｓＬ，ＩＣＥ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＩＣＥ ｉｎ－ ｈｉｂｉｔｏｒ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｉｔ Ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ Ｆａｓ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＣＥＭ．６Ｔ ｃｅｌｌｓ。ｗｈｉｌｅ ｎｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦａｓＬ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｏｎ ｔｈｅｓｅ ｃｅｌｌｓ．ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｂｅ ａｌｔｅｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｔｒｉｐｔｅｒｉｎｅ．Ｂｏｔｈ ＩＣＥ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ａｃ． ＹＶＡＤ－ＣＨ０ ａｎｄ １．５ ｍｏｌ／Ｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｍｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｋａｄａｉｃ ａｃｉｄ ｃ０ｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｍｔｅｓ ｏｆ ＣＥＭ．６Ｔ ｃｅｉｌｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｔｒｉｐｔｅｒｉｎｅ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＣＥＭ．６Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｓ Ｆａｓ／ＦａｓＬ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｕｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｅ－ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ＩＣＥ．Ｉｔ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｍｉｇｈｔ ｐａｒｔｉｃｉ— ｐａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｒｉｐｔｅｒｉｎｅ；ＣＥＭ．６Ｔ ｃｅｌｌ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
雷公藤红素是雷公藤单体之一，属三萜类色 素，分子式为Ｃ２９Ｈ３８０４，相对分子质量为４５０ ０００。 ２０世纪８０年代研究显示雷公藤红素具有抑制免疫 反应和抗炎症作用…，９０年代我们的研究发现雷 公藤红素能十分有效地诱导肥大细胞凋亡，且其诱 导肥大细胞凋亡与其调节凋亡相关基因Ｂｃ１．２家族 的表达和改变细胞内钙离子浓度有关［２“】。２００２ 年我们又报道该物质在可有效地诱导淋巴细胞系 ＣＥＭ一６Ｔ细胞凋亡。为探讨此凋亡过程中的调节机 制进行本项研究。 收稿日期：２００２－０６－２５：修回日期：２００２－０８．１３ 基金项目：上海市青年科技启明星资助项目（Ｎｏ．００ＱＢＩ４００７） 作者筒介：鲍一笑（ｔ９６４－），男，浙江人，副主任医师，博士，主 要从事哮喘的发病机制和治疗基础研究。 １材料与方法 １．１材料人Ｔ细胞株ＣＥＭ．６Ｔ（中国科学院上海 分院细胞库）；雷公藤红素（复旦大学上海医学院）； ＲＰＭＩ １６４０（ＧＩＢＣＯ）；抗人Ｆａｓ，ＦａｓＬ单抗以及相 应的二抗（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）；ＩＣＥ抑制剂Ａｃ．ＹＶＡＤ．ＣＨＯ （华顺公司）；蛋白酶抑制剂ｏｋａｄａｉｃ ａｃｉｄ（ＯＡ） （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）；ＡＭＶ逆转录试剂盒 （Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（华美公司）；ＰＣＲ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）；扩增相关基因引物 （中国科学院上海分院生化所合成）；ＩＣＥ；Ｐ１：５’ ＡＴＧ ＧＣＣ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＴＣ ＣＴＧ ＡＡＧ３’，Ｐ２：５’ＴＴＡ
瓣 麓 潞 群 砌 瓣 一～～～一 ＜上海免疫学杂志＞２啷年第２３卷第３期 ＡＴＧ ＴＣＣ ＴＧＧ ＧＡＡ ＧＡＧ ＧＴＡ３’（扩增产物长度 １ ２１９ ｂｐ）；内参照ｐ．ａｅｔｉｎ ＤＮＡ引物序列：Ｐ１：５’ Ｉ１ＧＣ ｒＡＴ ＣＣＡ ＧＧＣ ＴＧＴ ＧＣＴ Ａ＇ｒ３’，Ｐ２：５’ＧＡＴ ＧＧＡ ＧＴｒ ＧＡＡ ＧＧＴ ＡＧＴ ＴＴ３’。流式细胞仪（Ｃｏｕｌｔｅｒ ＸＬ）；二氧化碳培养箱（Ｈｅｒｅｕｓ）；倒置显微镜 （Ｏｌｙｍｐｕｓ）；显微摄影系统（Ｎｉｋｏｎ）。 １．２方法 １．２．１细胞培养ＣＥＭ．６Ｔ细胞在ＲＰＭＩ １６４０完全 培养基中，于５％ｃ０２和３７℃下传代培养。将细胞 密度调整为１ Ｘ １０６／ｍｌ。加入不同浓度的雷公藤红 素或培养不同的时间，收集细胞进行检测。 １．２．２ Ｆａｓ和ＦａｓＬ蛋白检测 １ Ｘ ｌＯ６／ｍｌ ＣＥＭ．６Ｔ 细胞加入０．５￣ｍｏｌ／Ｌ雷公藤红素培养１８ ｈ，收集细 胞，ＰＢＳ清洗，加入抗Ｆａｓ或ＦａｓＬ单抗，４℃，４５ ｍｉｎ后，加入二抗，再反应４５ ｍｉｎ，流式细胞仪检 测。 １．２．３ Ａｅ．ＹＶＡＤ．ＣＨＯ对雷公藤红素诱导ＣＥＭ．６Ｔ 细胞凋亡的影响 一组加入０．５￣ｍｏｌ／Ｌ雷公藤红 素，另一组先加入Ａｅ．ＹＶＡＤ．ＣＨＯ（终浓度为７５ ｔｍａｏｌ／Ｌ），然后加入雷公藤红素，共育１８ ｈ，进行 细胞凋亡检测。 １．２．４ ＯＡ对雷公藤红素诱导细胞凋亡的影响 在 加入０．５￣ｍｏｌ／Ｌ雷公藤红素基础上，加入或不加 入ＯＡ（终浓度分别为１．５ ｎｍｏｌ／Ｌ和１．５｜｜ｍｏｌ／Ｌ）， 共育１８ ｈ，进行细胞凋亡检测。 １．２．５细胞凋亡检测 采用Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ标记联合ＰＩ 染色流式细胞仪检测ｒ５】。 １．２．６ ＲＴ．ＰＣＲ及产物的检测 １．２．６．１ 总ＲＮＡ抽提 采用经典的ＡＧＰＣ法抽提 ＲＮＡ。 １．２．６．２ ＲＴ ３ ｌ的总ＲＮＡ加入２０ 反转录体系 中，于４２℃反应１ ｈ，煮沸５ ｍｉｎ终止反应。生成 的反转录产品保存于．７０￣Ｃ备用。 １．２．６．３ ＰＣＲ ６ 的逆转录产品，加入４０ ｌ ＰＣＲ 反应体系中，９４℃变性３ ｍｉｎ后，按不同的热循环 参数在ＰＣＲ仪上进行反应。结束反应后。在７２℃ 充分复性７ ｍｉｎ，产物保存于．２０￣Ｃ。扩增ｐ．ａｅｔｉｎ循 环参数：９４ｏＣ，３０ ｓ；５６ｏＣ，４０ ｓ；７２ｏＣ，４０ ｓ；２８ 个循环。扩增ＩＣＥ循环参数：９４ｏＣ，５０ ｓ；６０ｏＣ。 ７０ ｓ；７２ｏＣ，６０ ｓ；２８个循环。 １．２．６．４ ＰＣＲ产物检测 取ＰＣＲ产物２０｜｜ｌ，上样 于１．５％琼脂糖凝胶（含溴乙锭），电泳至Ｍａｒｋｅｒ充 分展开，用密度扫描仪对特异性条带进行密度扫 描，各基因扫描获得的光密度值（Ａ）用同一标本ｐ． ａｅｔｉｎ Ａ值校正，以未加药样本基因Ａ值为１００％， 加药样本基因相对Ａ值的计算公式是：加药样本 基因对Ａ值＝（加药样本基因Ａ值／加药样本 ａｃｔｉｎ基因Ａ值）／（未加药样本基因Ａ值／未加药样 本８．ａｃｔｉｎ基因Ａ值）Ｘ １００ｏｋ。 １．３统计学方法数据以牙－ｉ－ｓ，ｔ检验。
２ 结果 ２．１ 雷公藤红素对ＣＥＭ．６Ｔ细胞表达Ｆａｓ／ＦａｓＬ的 影响 ＣＥＭ．６Ｔ细胞均白发表达Ｆａｓ，不表达ＦａｓＬ， ０．５ ｍｏｌ／Ｌ雷公藤红素作用１８ ｈ，不能使ＣＥＭ．６Ｔ 细胞表达ＦａｓＬ，对Ｆａｓ的表达水平也无影响。 ２．２雷公藤红素对ＣＥＭ．６Ｔ细胞ＩＣＥ ｍＲＮＡ表达的 影响 雷公藤红素作用后ＣＥＭ．６Ｔ细胞ＩＣＥ ｍＲＮＡ 表达的相对Ａ值为１０４％±６％，与对照组（定为 １００％）无差异。 ２．３ ＩＣＥ抑制剂Ａｅ．ＹＶＡＤ．ＣＨＯ对雷公藤红素诱导 ＣＥＭ－６Ｔ细胞凋亡的影响０．５￣ｍｏｌ／Ｌ雷公藤红素 作用１８ ｈ，细胞的凋亡率为３０．３９％±１．８４％，先 加入Ａｅ．ＹＶＡＤ．ＣＨＯ，再加入０．５￣ｍｏｌ／Ｌ雷公藤红 素作用１８ ｈ，细胞的凋亡率下降为２０．１８％± １．１９％，二组相比有显著性差异（ｔ＝１０．４２，Ｐ＜ ０．Ｏ１，ｔ／，＝５）。 ２．４ ＯＡ对雷公藤红素诱导ＣＥＭ．６Ｔ细胞凋亡的影 响０．５ ｍｏｌ／Ｌ雷公藤红素诱导ＣＥＭ．６Ｔ细胞凋亡 率为３０．３９％±１．８４％，同时加入１．５ ｎｍｏｌ／Ｌ ＯＡ， 凋亡率为３２．５５％±２．５４％（ｔ＝１．５４，Ｐ＞０．０５，ｔ／， ＝５）。同时加入１．５￣ｔｍｏｌ／Ｌ ＯＡ，凋亡率为 １３．２８％±１．２５％，后者与单加雷公藤红素时的凋 亡率相比有显著性差异（ｔ：１９．３７，Ｐ＜０．０５，ｔ／，＝５ ），提示１．５￣ｍｏｌ／Ｌ ＯＡ能抑制ＣＥＭ．６Ｔ细胞的凋 亡。
３讨论 雷公藤红素诱导ＣＥＭ．６Ｔ细胞凋亡业已得到证 实，至于其通过何种途径引起细胞凋亡是一个值得 探讨的问题。引起细胞凋亡的途径很多，不同的凋 亡模式有不同的途径。通过对常见凋亡途径Ｆａｓ， ＩＣＥ，蛋白磷酸化／去磷酸化的初步研究，获得了雷 公藤红素诱导ＣＥＭ．６Ｔ细胞凋亡机制的初步认识。 Ｆａｓ是一种糖基化转膜蛋白，广泛表达于多种 细胞如胸腺细胞，外周血成熟Ｔ细胞。Ｆａｓ的天然