巨大芽孢杆菌表达外源蛋白的特点及其研究进展
中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2008,28(4):93~97
巨大芽孢杆菌表达外源蛋白的特点及其研究进展
牟琳1王红宁2*邹立扣1
(1四川农业大学生命科学学院雅安625014)(2四川大学生命科学学院动物疾病防控生物工程研究中心成都610064)
摘要巨大芽孢杆菌是一种很有潜力的分泌型基因工程宿主菌,现已广泛应用于工业和学术研
究领域,它具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等优点。综述了其自身的优点、
表达载体的特点、巨大芽孢杆菌的转化方法、外源蛋白的表达、高效表达的策略以及表达系统的
应用。
关键词巨大芽孢杆菌外源蛋白高效表达
中图分类号Q789
收稿日期:20071124修回日期:20071227*国家十五 重点科技攻关资助项目(2002BA514A12)**通讯作者,电子信箱:whongning@163.com巨大芽孢杆菌表达系统是一种很好的表达外源基
因的系统。由于其分布广泛,生化功能多样,以及能表
达、分泌、加工外源蛋白而不降解外源蛋白,巨大芽孢
杆菌越来越多地作为表达外源基因的宿主菌,在工业
以及学术研究领域得到了广泛的应用。
1巨大芽孢杆菌概述
巨大芽孢杆菌体型巨大,超过60m3(2.5!2.5!
10),是大肠杆菌体积的100倍以上[1]。其能依靠多种
碳源生长,因而分布十分广泛。同时,巨大芽孢杆菌能
降解一些顽固的难降解的杀虫剂[2,3],因此对环境具有十分重要的作用。一些巨大芽孢杆菌的蛋白质具有重要的作用。例
如:其细胞色素P450单加氧酶系同真核细胞色素P
450单加氧酶系相似,在许多疾病中发挥着类似的作
用。另外,在工业上,巨大芽孢杆菌分泌的酶应用也十
分广泛,如淀粉酶应用于面包生产、青霉素酰胺酶应用
于合成新型人工抗生素等。很多基因在该菌中都得到
了较好的表达及分泌。
2巨大芽孢杆菌在表达外源蛋白中的优点
2.1能利用多种碳源巨大芽孢杆菌能利用多种碳源,营养要求低,生长快。在许多生态环境中都存在着巨大芽孢杆菌,例如
肉类加工厂的废弃物中,石化产品的排出物中都有巨
大芽孢杆菌,另外,巨大芽孢杆菌在28~37∀都能很好
地生长,它的这些特点能有效降低培养成本,便于工业
化生产。
2.2蛋白质表达产量高,稳定性好与其它芽孢杆菌相比,巨大芽孢杆菌不具有碱性
蛋白酶,表达的外源蛋白不会被降解,重组质粒稳定,
不易丢失[4]。此外,巨大芽孢杆菌细胞壁的组成简单,
只含有肽聚糖和磷壁质,因此在分泌的蛋白质产品中
不会混杂有内毒素(热源性脂多糖),因此外源蛋白产
量大,适用于工业大规模的蛋白质生产。
2.3分泌量大且分泌的蛋白易纯化在巨大芽孢杆菌中表达的蛋白既可以存在于胞
内,又可以存在于胞外。由于其只有一层细胞膜,因而
可以大量分泌蛋白至培养基中,蛋白跨越细胞膜后,被
加工和直接释放到培养基中以活性结构生成而不发生
聚集,避免了复性的困难[5]。产物与大量的细胞蛋白
分离,回收和纯化蛋白较为简单。
2.4良好的发酵基础和生产技术巨大芽孢杆菌发酵工艺和产物回收技术较成熟,
用作外源蛋白的分泌型宿主菌,具有很大的潜力。巨
大芽孢杆菌在工业上被用于生产蛋白酶、淀粉酶等。
在相对简单的培养基中能生长到很高的密度。细胞的
生长特性和生理学性质都被广泛、深入研究。中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo.l28No.42008
3巨大芽孢杆菌表达载体
表达载体包括启动子、外源基因克隆位点、分泌信
号、终止子、筛选标记、复制起点、信号肽序列等。为了
便于操作,用于转化适合巨大芽孢杆菌宿主细胞的表
达载体均为大肠杆菌和巨大芽孢杆菌的穿梭 质
粒[6],先在大肠杆菌中复制扩增,然后被导入巨大芽孢
杆菌宿主细胞。它是由来自巨大芽孢杆菌的部分基因
序列和大肠杆菌的部分基因序列所组成。其大肠杆菌
部分主要包括可以在大肠杆菌中复制的起始序列(ori)
和特定的抗性基因序列。这两部分主要是作为在大肠
杆菌宿主中的增殖和筛选组分。巨大芽孢杆菌部分包
括:巨大芽孢杆菌转化子的筛选组分以及编码特定蛋
白的基因启动子和终止子序列。后两者之间为多克隆
位点。现在使用得比较普遍的载体是pHIS1522和
pHIS1525,它们都来源于Rygus和Hillen的pWH1520
载体[7,8],是由芽孢杆菌质粒pBC16和大肠杆菌质粒
pBR322两者构成的穿梭质粒。下面将简述载体
pHIS1522和PHIS1525的特点。
3.1木糖启动子1991年,Rygus与Hillen发现了位于巨大芽孢杆菌
基因组上的木糖诱导的启动子PxylA。在木糖存在情
况下,木糖异构酶基因xylA在PxylA控制下的表达比
木糖不存在时提高了200倍[9]。在重组质粒上采用木
糖启动子,在木糖存在情况下,目的基因在巨大芽孢杆
菌中的表达比加入木糖之前能提高130~350倍[10]。利用木糖启动子诱导基因表达的机理是:在木糖
存在的条件下,木糖阻遏子会从启动子上释放出来从
而使转录开始。这使外源蛋白在巨大芽孢杆菌中的表
达得到了很好的调控[10]。目前,木糖启动子系统已被
成功地用于许多异源原核及真核蛋白在巨大芽孢杆菌
中的胞内或胞外表达[9,11~15]。
3.2多克隆位点和组氨酸标签在木糖启动子的下游,具有多克隆位点,包括
BamHI、SacI、KpnI等共15种限制性内切酶的酶切位
点,方便目的基因的插入。载体pHIS1522和pHIS1525
的多克隆位点有所不同。多克隆位点下游具有组氨酸
标签,能编码连续的6个组氨酸,易于目的蛋白的纯化
和探测。
3.3抗性基因载体pHIS1522和PHIS1525分别具有两种抗性基因:氨苄抗性基因和四环素抗性基因。其中,氨苄抗性
基因属于大肠杆菌中的筛选组分,四环素抗性基因则
属于巨大芽孢杆菌中的筛选组分。这种载体存在的一
个弊端就是抗性基因的释放会产生耐药性菌株,存在
着安全隐患,这也是许多基因工程所用载体共有的一
个弊端。近年来相关研究者也提出了一些提高标记基
因安全性的策略:利用无争议的生物安全标记基因,例
如绿色荧光蛋白基因等;利用无选择标记基因的转化
系统等。
4巨大芽孢杆菌的转化
巨大芽孢杆菌是革兰氏阳性菌,其转化方法与大
肠杆菌等革兰氏阴性菌不同,一般有原生质体转化法
和电击转化法。
4.1原生质体转化法[16]
巨大芽孢杆菌的原生质体转化法是由PEG6000
介导的。首先需要溶菌酶的作用将巨大芽孢杆菌处理
为原生质体,继而将构建好的携带外源基因的质粒转
化进巨大芽孢杆菌中。当质粒进入巨大芽孢杆菌原生
质体中后,需要再生培养基使其形态功能恢复,同时需
要筛选培养基对转化子进行筛选。因此原生质体转化
法比较复杂。
4.2电击转化法对于革兰氏阳性菌巨大芽孢杆菌来说,电击转化
法是最简单快速且转化效率高的一种转化方法。电击
转化芽孢杆菌虽没有像大肠杆菌一样的转化效率,但
此方法能有效地将DNA引入巨大芽孢杆菌中。Alejandro等[17]用电击转化短芽孢杆菌时,发现在
电压6000V到15000V的条件下都能转化成功,随着
电压的提高,存活率从92%下降到58%,转化率从1.5!101上升到5.87!103转化子/gDNA。
5外源蛋白在巨大芽孢杆菌中的表达
5.1信号肽外源蛋白的分泌需要信号肽引导表达蛋白沿一定
途径分泌至细胞外。几乎所有的分泌蛋白在合成时都
带有信号肽,信号肽在其分泌过程中发挥重要的作用:
(1)促进新生蛋白的折叠;(2)是转运元件识别和连接的
靶子;(3)与转运成分相互作用,介导蛋白多肽的转运。芽孢杆菌分泌蛋白的信号肽与大肠杆菌的一样,
也由N区(带正电荷),H区(8个以上疏水残基)和C
区(极性氨基酸)三部分组成。但前者信号肽的N区通942008,28(4)牟琳等:巨大芽孢杆菌表达外源蛋白的特点及其研究进展
常比后者带有更多正电荷[18]。一般地,来自芽孢杆菌
的分泌蛋白能转运到大肠杆菌的周质腔中,而来自大
肠杆菌分泌蛋白的信号肽很少能在芽孢杆菌中起作
用[19]。这表明芽孢杆菌分泌元件对信号肽某一结构有
特殊的要求。鉴于此,芽孢杆菌表达外源基因的信号
肽主要来自芽孢杆菌本身和其他革兰氏阳性细菌的分
泌蛋白[20]。载体pHIS1525上有一段信号肽序列,其编码枯草
芽孢杆菌的一种胞外酯酶lipA,它能引导目的蛋白分
泌到细胞外。
5.2外源蛋白表达步骤外源蛋白在巨大芽孢杆菌中表达包含4个步骤:
(1)将编码外源蛋白的DNA序列克隆进含有巨大芽孢
杆菌启动子和转录终止序列的表达框中;(2)转化及在
宿主中稳定维持此DNA融合产物;(3)外源蛋白在特
定培养条件下合成;(4)外源蛋白的纯化及其与天然产
物的比较。一般而言,所使用的启动子必须是可调控
的,这样,可以在诱导前维持培养基以一种非表达模
式,从而降低了在生长阶段选择非表达突变细胞的机
会。这种不利选择通常会在外源蛋白高度表达给细胞
造成重负时,及外源蛋白表现毒性时发生。
6在巨大芽孢杆菌中高效表达外源蛋白的
策略
6.1选择合适的受体系统不同的表达载体具有不同的特异性启动子和终止
子,要使外源基因在巨大芽孢杆菌中得到高效表达必
需高效启动转录。Yang等[21]利用4种不同的巨大芽
孢杆菌宿主菌研究其对外源基因表达的影响,结果表
明,菌株YYBm1(不含胞外蛋白酶NprM,木糖利用缺陷
性)比菌株MS941(不含胞外蛋白酶NprM,但能利用木
糖)更有效表达目的基因。同时还利用木糖缺陷性菌
株WH323(含有胞外蛋白酶NprM,木糖利用缺陷性)提
高了异源基因的表达。因此,根据表达载体的特性选
择合适的巨大芽孢杆菌受体系统尤为重要。目前使用
较广泛的是巨大芽孢杆菌WH320。 半乳糖苷酶、葡
萄糖脱氢酶、变旋酶等都在WH320中得到了很高的
表达[10]。
6.2提高表达载体在细胞中的拷贝数外源基因在细胞中的拷贝数会影响相应mRNA的
拷贝数,对于非整合型质粒来说,增加表达载体在细胞中的拷贝数能提高外源基因转录的mRNA总量,从而可以提高外源蛋白的表达量。然而,并非所有高拷贝
的转化子都能产生高的表达量,特别在分泌表达时,这
可能是由于高水平表达阻断分泌途径所致。
6.3优化发酵条件采用不同的培养基配方,例如变换碳源、氮源,变
换培养基各成分的比例等;通过提高菌株的生物量来
提高外源蛋白表达量。影响巨大芽孢杆菌生长的外界
因素主要包括:(1)培养基组成。适当的培养基能使菌
株生长更好,大大增加了生物量,使表达量也相应大大
提高。(2)诱导前菌体OD值。巨大芽孢杆菌中蛋白
表达分2个阶段:一是生长阶段,在含甘油的培养基培
养菌体;二是诱导表达阶段,加入木糖到培养基中诱导
表达。一般来说,OD600值越高,生物量越大,则总的表
达量亦应该越高.但是OD600值越高培养基中氧和营养
供给越受限制,而且外源蛋白的溶解性、稳定性、毒性
都会对菌体产生影响。因此,高密度并不一定意味着
高表达。另外接种量、培养时间、诱导时间、培养温度、
诱导剂浓度、通气量、pH等发酵条件的优化对于提高
枯草芽孢杆菌的介绍
目 录
第一章 芽孢杆菌的简要介绍 ............................................................................................ 1 第一节 芽孢杆菌种类 ............................................................................................... 1 第二节 芽孢杆菌表达系统发展简史 .......................................................................... 2 第二章 枯草芽孢杆菌的转化系统 ..................................................................................... 3 第一种方法：电转化 ................................................................................................. 3 第二种方法：Spizizen转化 ........................................................................................ 3 第三种方法：原生质体法(Takashi).............................................................................. 4 第四种方法：原生质体转化之二................................................................................ 4 第五种转化方法：质粒混合法（BGSC推荐）............................................................. 5 第三章 芽孢杆菌表达系统发展简史 ................................................................................. 6 第一节 芽孢杆菌表达系统的优点（相对于大肠杆菌） .............................................. 7 第二节 芽孢杆菌的缺点 ............................................................................................ 7 第三节 助表达系统 ................................................................................................... 7 第四节 芽孢杆菌基因表达的主要特点 ....................................................................... 7 第四章 枯草芽孢杆菌转录翻译系统 ................................................................................. 8 第一节：转录系统..................................................................................................... 9 第二节：翻译系统..................................................................................................... 9 第五章 芽孢杆菌常用的宿主和载体 ............................................................................... 10 第六章 芽孢杆菌表达系统应用实例 ............................................................................... 11 1 中国 .................................................................................................................... 11 2 日本 .................................................................................................................... 12 3 加拿大................................................................................................................. 12 第七章 芽孢杆菌其他产品 ............................................................................................. 13 第一节 核苷类产品 ................................................................................................. 13 第二节 核黄素 ........................................................................................................ 13 第三节 微生物制剂/益生菌 ..................................................................................... 13 第八章 结语 .................................................................................................................. 14 附录一. 芽孢杆菌的相关经典文章 .................................................................................. 14 附录二. 枯草芽孢杆菌相关数据库 .................................................................................. 15 致谢及参考文献 ............................................................................................................. 15 1 第一章 芽孢杆菌的简要介绍
凝结芽孢杆菌的特性及其研究进展
凝结芽孢杆菌的特性及其研究进展
凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是一种革兰氏阳性的芽孢形成细菌，属于杆菌科（Bacillaceae），目前已知共有七个亚种。凝结芽孢杆菌具有很强的耐热性和耐酸性，能够在极端环境下存活，并且在正常温度下能够通过芽孢形式进行传播和传染。凝结芽孢杆菌能够产生大量的亚麻酸，是一种重要的生物制药原料。以下将对凝结芽孢杆菌的特性和研究进展进行详细介绍。
1.耐热性和耐酸性：凝结芽孢杆菌能够在高温和极酸环境下存活，这使得它可以应用于各种工业过程和产品中，如食品加工、药物生产等。
2.产孢能力强：凝结芽孢杆菌可以形成芽孢，在恶劣环境下保护自身，并且利用芽孢进行生物传播。
3.亚麻酸产生能力：凝结芽孢杆菌可以通过发酵过程产生大量的亚麻酸，亚麻酸是一种多不饱和脂肪酸，具有很高的营养价值。
4.益生菌能力：凝结芽孢杆菌具有益生菌特性，可以抑制有害菌的生长，促进肠道健康。
1.凝结芽孢杆菌的分类和系统进化：通过分子生物学方法，研究者对凝结芽孢杆菌进行了分类和系统发育研究，探索了不同亚种之间的关系。
2.产酶能力的研究：凝结芽孢杆菌具有较强的酶活性，可以产生多种酶，如纤维素酶、蛋白酶等，这些酶在工业生产中有很大的应用潜力。
3.发酵工艺的优化：为了提高凝结芽孢杆菌的亚麻酸产量，研究者通过优化发酵工艺参数，如培养基成分、发酵温度、pH值等，来提高产酸效果。 4.抗生素产生能力的研究：凝结芽孢杆菌可以产生多种抗生素，如肽类抗生素、青霉素等，对天然抗生素的研究与开发具有重要意义。
5.基因工程研究：通过基因工程技术，可以对凝结芽孢杆菌进行基因修饰，改变其代谢途径，通过增加或减少特定酶的活性来改进其产酸性能。
综上所述，凝结芽孢杆菌具有耐酸耐热、产孢能力强、亚麻酸和抗生素产生能力等特性，在食品工业、生物制药和医学领域具有重要的应用潜力。目前的研究主要集中在分类和系统发育、酶活性研究、发酵工艺优化、抗生素产生和基因工程方面。随着对凝结芽孢杆菌的深入研究，相信它在各个领域中的应用前景会更加广阔。
酸性普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶在大肠杆菌中分泌表达研究
酸性普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶在大肠杆菌中分泌表达研究
栗亚美;陈阿娜;杨艳坤;白仲虎
【摘 要】来自于酸性普鲁兰芽孢杆菌的普鲁兰酶，由于分子量较大，在大肠杆菌中难以实现高效分泌表达。为研究其在E．coli中高效分泌表达策略，构建了带信号肽的pET－28a（＋）-pelB-pul13A质粒，通过发酵过程控制及向发酵培养基中添加促分泌物质，系统地优化了分泌表达策略。通过分子改造，带信号肽的表达系统实现了低水平的分泌性表达；进一步通过优化培养基、诱导温度、IPTG浓度、诱导时机及11种培养基添加物，促进普鲁兰酶最大限度的分泌到周质空间。实验结果显示，连上pelB信号肽的pull3A在TB／SB培养基中，通过优化的诱导条件（ IPTG浓度0.1 mmol ／L，诱导温度20℃，诱导时机为接种后5 h），在诱导20 h时加入0.03％SDS，周质空间酶活达到最大值102.5 U／mL。在此基础上，探究了化学添加剂对大肠杆菌细胞膜及膜通透性的影响，并应用优化后的系统实现了乙酰胆碱酯酶和单域抗体的分泌表达。为大分子蛋白在大肠杆菌中分泌表达提供参考。%The pullulanase of Bacillus acidopullulyticus has low secretory
expression level as a macromolecule .For pullulanase secreto-ry in
recombination Eschreichia coli BL21(DE3), BL21(DE3)-pET-28a(+)-pelB-pul
13A with PelB signal peptide was constructed , then fermentation
optimization and medium additives were employed for better
secretory .Through the construction of recombinant strain BL21(DE3) with
原位整合型枯草芽孢杆菌芽孢表面展示载体的构建
原位整合型枯草芽孢杆菌芽孢表面展示载体的构建
杨亚威;杨明明;龚月生
【摘 要】为证明原位整合能否用于枯草芽孢杆菌芽孢表面展示外源蛋白,本研究将芽孢衣壳蛋白CotB、CotZ的编码序列(不含终止密码子),与绿色荧光蛋白基因重组,构建含有融合片段cotB-gfp和cotZ-gfp的原位整合型表面展示载体pEYW25、pEYW26;将上述质粒分别转入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis PY79)获得重组菌株BSYW25和BSYW26.荧光显微镜下观察上述重组菌的芽孢,只有BSYW26能检测到荧光,Western blot结果显示BSYW26的芽孢外壳蛋白中含有GFP.结果表明原位整合作为一种新的表面展示方法能够应用于枯草芽孢杆菌芽孢表面展示.
【期刊名称】《家畜生态学报》
【年(卷),期】2018(039)010
【总页数】6页(P10-15)
【关键词】芽孢;原位整合;表面展示
【作 者】杨亚威;杨明明;龚月生
【作者单位】西北农林科技大学 动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学 动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学 动物科技学院,陕西杨凌712100
【正文语种】中 文
【中图分类】S811.5
枯草芽孢杆菌虽为益生菌[1]，但其在动物肠道中停留时间短暂且易被机体降解，而芽孢能有效抵抗胃肠道中的酸碱环境，因此延长芽孢在肠道中的停留时间能够有效地发挥枯草芽孢杆菌的益生特性。
在环境恶劣，营养缺乏等极端条件下，枯草芽孢杆菌属的营养细胞会形成一种休眠体，即芽孢。枯草芽孢杆菌的芽孢包括中心内核和几种蛋白层结构，内核主要由高度失水的基因组构成，蛋白层结构由至少70种蛋白质组成，由内到外分为皮质层、基底层、芽孢内壳、芽孢外壳和crust层[2](图1)。
图1 芽孢外壳结构示意图Fig.1 Structure diagram of spore coat
芽孢用钌红染色后在电镜下能观察到crust层[3]，外壳蛋白层主要有保护芽孢的作用，使其免受各种蛋白酶、有毒物质和恶劣环境因子等的影响。
蜡样芽孢杆菌特征性蛋白的分离与纯化
蜡样芽孢杆菌特征性蛋白的分离与纯化
吴海清;陈庆森
【摘 要】蜡样芽孢杆菌是一种致病性病原菌,能引起胃肠感染和非胃肠感染.本研究从实验室分离的蜡样芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌1.026 0、巨大芽孢杆菌1.015 1、蕈状芽孢杆菌1.085 6和苏云金芽孢杆菌1.101 4这五株菌中提取蛋白,利用SDS-PAGE方法纯化,并测定出蜡样芽孢杆菌有3种分子量约为28.5、26.5和20.0
KDa的特征性蛋白,而苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和簟状芽孢杆菌则没有此特征性蛋白.
【期刊名称】《天津农学院学报》
【年(卷),期】2011(018)002
【总页数】3页(P20-22)
【关键词】蜡样芽孢杆菌;特征性蛋白;SDS-PAGE
【作 者】吴海清;陈庆森
【作者单位】天津农学院食品科学系,天津300384;天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津300134
【正文语种】中 文
【中图分类】TS207.4
蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus)是一种好氧产孢子的杆形菌，它们广泛存在于土壤、灰尘和水中。Bacillus cereus的最低生长温度约为4～5℃，最高生长温度约为48～50℃。允许生长的pH值范围为4．9～9．3，营养体生长的最小水分活度在0．912 ～0．950。它们的孢子具有典型的耐热性［1］。蜡样芽孢杆菌可产生致吐肠毒素和致腹泻肠毒素，前者耐热，是引起食物中毒的主要成分［2］。本文旨在从蜡样芽孢杆菌中提取出特征性蛋白，为可疑蜡样芽孢杆菌的快速检测奠定基础。
1 实验材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 主要化学试剂
丙烯酰胺、N－N＇－甲叉双丙烯酰胺、SDS、TEMED、Tris、过硫酸铵、β－巯基乙醇、甘油、甘氨酸、溴酚蓝、盐酸、甲醇、乙醇、冰醋酸、考马斯亮蓝G－250及pH 7．2的PBS缓冲液。
1．1．2 实验菌种
本实验室分离鉴定的蜡样芽孢杆菌。
蜡样芽孢杆菌1．026 0(Bacillus cereus 1．206 0)菌株，购自中国微生物菌种保藏中心。
纤维素酶基因工程菌pHBM_End培养条件的研究[1]
![纤维素酶基因工程菌pHBM_End培养条件的研究[1]](https://360docs-1393072327.cos.ap-beijing.myqcloud.com/ae73998db9d528ea81c77944.webp)
中国饲料２００８年第１７期
基金项目：四川省教育厅自然科学科研项目（２００５Ａ０３０）＊通讯作者纤维素酶是一类能够降解纤维素，使之生成纤维二糖和葡萄糖等一系列酶的总称，按各酶功能的不同可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶三大类（谢占玲和吴润，２００４），在协同作用下它们可以将纤维素物质彻底水解成葡萄糖，进而发酵产生乙醇，解决能源再生以及环境污染等问题。目前，纤维素酶成本高及酶活力低严重制约其在生产中的广泛应用。为解决这个问题，一方面需要筛选高产量和高酶活力的纤维素酶产生菌，另一方面就是通过现代的基因工程手段，构建高效表达的基因工程菌，或通过对已知的纤维素酶进行分子改造以提高其比活力。由于筛选原始菌株工作量大，且产量一般情况下较基因工程菌低，所以构建高效表达的基因工程菌是降低纤维素酶成本、提高产量的有效手段。目前，国内外鲜见在巨大芽孢杆菌中表达内切葡聚糖酶的报道。本试验以工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ为研究对象，对其产酶条件进行优化，通过优化培养条件以进一步提高表达量，为实现基因工程菌产业化奠定基础。１材料与方法１．１菌种来源四川农业大学生命科学与理学院生物化学与分子生物学实验室自行构建保存的基因工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ。１．２培养基ＬＢ培养基：１％胰蛋白胨，１％Ｎａ－Ｃｌ，０．５％酵母浸出粉，ｐＨ７．０～７．５；配制固体培养基时需加入１．５％～２．０％的琼脂粉；配制抗生素培养基时需加入四环素（终浓度为１０μｇ／ｍＬ）。ＬＢ－ＣＭＣ培养基：在ＬＢ培养基中加入０．５％的羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）。１．３生物量测定将培养液稀释２５倍，用７２１－型分光光度计在６００ｎｍ下测定光密度，以未接种的培养基等量稀释液作对照。１．４酶活力测定参照郑淑霞等（２００４）方法。以１ｍＬ１％（ｍ／Ｖ）羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）溶液为底物，加入０．１ｍＬ适当稀释的酶液并混匀，置水浴锅中５０℃静置保温３０ｍｉｎ，然后加入２．５ｍＬ二硝基水杨酸钠（ＤＮＳ）溶液，混匀后置１００℃煮沸５ｍｉｎ，取出后用流水冷却至室温，定容至５ｍＬ，最后在５３０ｎｍ波长处测得各管溶液的吸光值并计算酶活力。对照先加ＤＮＳ，后加酶液，其余步骤不变。在上述条件下，１ｍＬ原酶液每分钟催化底物产生相当于１μｇ葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（Ｕ／ｍＬ）。１．５种龄（Ｘ１）对产酶的影响从平板上挑取一纤维素酶基因工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ培养条件的研究四川农业大学生命科学与理学院韩学易陈惠＊胥兵阮景军［摘要］对基因工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ培养条件优化的研究结果表明：２５０ｍＬ三角瓶中装入５０ｍＬＬＢ培养基（含有１０μｇ／ｍＬＴｅｔ），按５％的接种量接种种龄为１２ｈ的液体种子，培养４ｈ后加入终浓度为０．２％的木糖进行诱导，９ｈ后上清液中酶活可达８８９Ｕ／ｍＬ，是出发菌株Ｃ－３６（７９．２Ｕ／ｍＬ）的１１．２２倍。［关键词］巨大芽孢杆菌；内切葡聚糖酶；培养条件［中图分类号］Ｓ８１６．３２［文献标识码］Ａ［文章编号］１００４－３３１４（２００８）１７－００１４－０４［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＴｈｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｔｒａｉｎｐＨＢＭ－Ｅｎｄｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｃｕｌｔｕｒｅｗｅｒｅ：ｖｏｌｕｍｅ５０ｍＬ，ｔｈｅｓｅｅｄａｇｅ１２ｈ，ｔｈｅｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｒａｔｅ５％，ｔｈｅｉｎｄｕｃｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ０．２％，ａｎｄｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｉｍｅ９ｈ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅｉｓｕｐｔｏ８８９Ｕ／ｍＬｗｈｉｃｈｉｓａｂｏｕｔ１１．２２ｔｉｍｅｓｏｆｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｓｔｒａｉｎ（７９．２Ｕ／ｍＬ）．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ＢａｃｉｌｌｕｓＭｅｇａｔｅｒｉｕｍ；ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ；ｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ１４中国饲料２００８年第１７期
芽孢杆菌研究进展及其在水产养殖中的应用
芽孢杆菌研究进展及其在水产养殖中的应用
摘要 该文主要介绍芽孢杆菌的常用种类、生物学功能及其在水产养殖中的应用，以为芽孢杆菌的利用提供参考。
关键词 芽孢杆茵；生物学功能}应用；水产养殖
随着社会经济的不断发展，人们对水产养殖产品的需求越来越大，水产养殖逐步向工业化、规模化养殖的方向发展。高密度的养殖模式、抗生素的滥用、喹乙醇等禁用添加剂的非法使用也对水产养殖业健康发展造成了严重的危害。残留毒素、污染生态环境、威胁人体健康等负面影响成为整个行业健康发展的瓶颈。近年来，微生态制剂在畜牧兽医、人类健康等方面的推广应用，大量实验和生产实践证实微生态制剂的应用疗效，其在水产行业中的应用也越来越受人们的重视。微生态制剂具有绿色、环保等优点，在养殖中微生态制剂可以用来解决水产养殖污染和病害的问题。自然界广泛分布着芽孢杆菌，能产生多种酶，是动植物微生态系统优势种群之一，在水产养殖中发挥着重要的作用。
1 芽孢杆菌使用种类
生物制剂的研发和使用过程中最重要的问题是确保其使用的安全性。美国食品药品管理局(FDA)在1989年发布的允许使用的菌株有43种，芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和凝结芽孢杆菌(B.coagulans)。2008年，我国农业部公布的《饲料添加剂品种目录》中，允许直接投喂动物的微生物添加剂有15种，其中芽孢杆菌有地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌2种。随着国内外研究的深入，允许使用的芽孢杆菌种类越来越多，相继研发出了生物学特性更加优异的新菌种，如环状芽孢杆菌(B.circulans)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、芽孢乳杆菌(Lactobacillus
sporogens)、纳豆芽孢杆菌(B.natto)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、巨大芽孢杆菌(B.megeterium)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)和东洋芽孢杆菌(B.toyoi)等，这些新菌株的发现壮大了芽孢杆菌添加剂的数量，为养殖行业的健康稳定发展提供了技术支持。
巨大芽孢杆菌表达外源蛋白的特点及其研究进展
中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（４）：９３－９７
巨大芽孢杆菌表达外源蛋白的特点及其研究进展
牟琳１王红宁２＋邹立扣１
（１四川农业大学生命科学学院雅安６２５０１４）（２四川大学生命科学学院动物疾病防控生物工程研究中心成都６１００６４）
摘要巨大芽孢杆菌是一种很有潜力的分泌型基因工程宿主茵，现已广泛应用于工业和学术研
究领域，它具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等优点。综述了其自身的优点、
表达载体的特点、巨大芽孢杆茵的转化方法、外源蛋白的表达、高效表达的策略以及表达系统的
应用。
关键词巨大芽孢杆菌外源蛋白高效表达
中图分类号Ｑ７８９
巨大芽孢杆菌表达系统是一种很好的表达外源基
因的系统。由于其分布广泛，生化功能多样，以及能表达、分泌、加工外源蛋白而不降解外源蛋白，巨大芽孢
杆菌越来越多地作为表达外源基因的宿主菌，在工业以及学术研究领域得到了广泛的应用。
１巨大芽孢杆菌概述
巨大芽孢杆菌体型巨大，超过６０斗ｍ３（２．５×２．５×ｌＯ），是大肠杆菌体积的１００倍以上¨ｏ。其能依靠多种碳源生长，因而分布十分广泛。同时，巨大芽孢杆菌能降解一些顽固的难降解的杀虫剂∞’３３，因此对环境具有
十分重要的作用。一些巨大芽孢杆菌的蛋白质具有重要的作用。例
如：其细胞色素Ｐ－４５０单加氧酶系同真核细胞色素Ｐ一４５０单加氧酶系相似，在许多疾病中发挥着类似的作用。另外，在工业上，巨大芽孢杆菌分泌的酶应用也十
分广泛，如淀粉酶应用于面包生产、青霉素酰胺酶应用
于合成新型人工抗生素等。很多基因在该菌中都得到了较好的表达及分泌。
２巨大芽孢杆菌在表达外源蛋白中的优点
２．１能利用多种碳源巨大芽孢杆菌能利用多种碳源，营养要求低，生长
收稿日期：２００７．１１彩修回１３期：２００７—１２－２７・国家“十五”重点科技攻关资助项目（２００２ＢＡ５１４Ａ・１２）・十通讯作者，电子信箱：ｗｈｏｎｇｎｉｎｇ＠１６３．ｃｏｒｎ快。在许多生态环境中都存在着巨大芽孢杆菌，例如
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究
一、本文概述
本文旨在深入研究枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法，以及质粒转化技术在枯草芽孢杆菌中的应用。文章首先将对枯草芽孢杆菌的生物学特性进行简要介绍，包括其生理结构、生长环境及其在生物技术领域的重要地位。随后，将详细阐述感受态细胞制备的原理和步骤，包括细胞的诱导、处理和保存等关键环节，并对不同方法进行比较分析，以找出最佳制备条件。
在此基础上，本文将深入探讨质粒转化技术在枯草芽孢杆菌中的应用。质粒转化作为一种高效的基因转移手段，对于枯草芽孢杆菌的遗传改造和功能研究具有重要意义。文章将详细介绍质粒转化技术的操作流程，包括质粒的选择、转化条件的优化以及转化效率的评价等方面。
本文还将对枯草芽孢杆菌感受态细胞制备及质粒转化方法的应用前景进行展望。随着生物技术的不断发展，这些方法在基因工程、生物制药、环境修复等领域的应用潜力将逐渐显现。通过本文的研究，旨在为相关领域提供可靠的技术支持和实践指导。 二、枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备
制备枯草芽孢杆菌感受态细胞是质粒转化的关键步骤之一，它涉及到细胞的生长、处理和储存等多个环节。以下是详细的制备过程：
菌种复苏与活化：从低温保存的菌种库中取出枯草芽孢杆菌菌种，在LB固体培养基上进行划线接种，然后将其置于37℃恒温培养箱中倒置培养，待菌落长出后，挑选单个菌落进行活化。
种子液制备：将活化后的菌落接种到LB液体培养基中，以一定的转速（如200rpm）在37℃下振荡培养，直至达到对数生长期。
感受态细胞制备：将种子液按照一定比例接种到新鲜的LB液体培养基中，继续培养至OD600达到4~6。然后，将培养液转移到预冷的离心管中，冰浴10分钟，以4℃、4000rpm的条件离心10分钟，收集菌体。
细胞处理：去除上清液，用预冷的感受态细胞洗涤液轻轻悬浮菌体，冰浴10分钟，再次离心收集菌体。重复此步骤一次，以彻底去除培养基中的盐分。
枯草芽孢杆菌的介绍-第二版本
枯草芽孢杆菌的介绍
完成者：河岸hkfced（/hkfced）
完成时间：2012-3-23
版本：第二版本
目 录
第一章 芽孢杆菌的简要介绍 ............................................................................................ 1 第一节 芽孢杆菌种类 ............................................................................................... 1 第二节 芽孢杆菌的表达系统发展简史 ....................................................................... 2 第二章 枯草芽孢杆菌的转化系统 ..................................................................................... 3 第一节：常见转化方法.............................................................................................. 3 1 化学转化法..................................................................................................... 3 2 电转化............................................................................................................ 3 3 原生质体转化 ................................................................................................. 3 4 碱金属离子转化.............................................................................................. 4 5 质粒的其它转移方式....................................................................................... 4 第二节：标准操作..................................................................................................... 4 第一种方法：电转化 .......................................................................................... 4 第二种方法：Spizizen转化 ................................................................................. 5 第三种方法：原生质体法(Takashi)....................................................................... 5 第四种方法：原生质体转化之二......................................................................... 6 第五种转化方法：质粒混合法（BGSC推荐）...................................................... 7 第三章 芽孢杆菌的表达系统 ............................................................................................ 8 第一节 芽孢杆菌表达系统的优点（相对于大肠杆菌） .............................................. 8 第二节 芽孢杆菌的缺点 ............................................................................................ 9 第三节 助表达系统 ................................................................................................... 9 第四节 芽孢杆菌基因表达的主要特点 ....................................................................... 9 第四章 枯草芽孢杆菌的转录翻译系统 .............................................................................. 9 第一节：转录系统................................................................................................... 10 第二节：翻译系统................................................................................................... 11 第五章 芽孢杆菌常用的宿主和载体 ............................................................................... 12 第六章 芽孢杆菌应用实例 ............................................................................................. 13 1 中国 .................................................................................................................... 13 2 日本 .................................................................................................................... 13 3 加拿大................................................................................................................. 14 第七章 芽孢杆菌的产品 ................................................................................................. 14 第一节 核苷类产品 ................................................................................................. 14 第二节 核黄素 ........................................................................................................ 14 第三节 微生物制剂/益生菌 ..................................................................................... 15 第四节 工业酶制剂 ................................................................................................. 15 第八章 结语 .................................................................................................................. 15 附录一. 芽孢杆菌的相关经典文章 .................................................................................. 16 附录二. 枯草芽孢杆菌相关数据库 .................................................................................. 16 致谢及参考文献 ............................................................................................................. 17 1 第一章 芽孢杆菌的简要介绍