植物病原菌诱导表达载体构建及在烟草中的瞬时表达研究
植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统是指通过基因转化技术在植物细胞中瞬间表达外源基因，从而实现外源基因的快速表达和高效产量的一种技术。
它有许多实际应用，比如快速获得大量重组蛋白、研究基因功能、制造新型药物等。
以下是植物瞬时表达系统的研究进展。
在选择宿主植物方面，研究展示了多种植物可以作为瞬时表达系统的宿主。
传统上选择的宿主植物是烟草，因为它易于操作且具有高效的基因转化能力。
近年来，研究人员也开始尝试将其他植物作为宿主，比如拟南芥、玉米、水稻等。
这些植物具有各自的优势，可以根据实际需求进行选择。
在构建表达载体方面，研究人员不断改进和优化表达载体的结构和功能。
目前，最常用的表达载体是冠状病毒相关的表达载体。
这些载体具有高效的基因转化能力和表达稳定性，并且可以适应不同植物宿主。
一些研究也尝试使用信使RNA（mRNA）作为表达载体，因为mRNA具有瞬间表达的能力，可以大大提高外源基因的表达水平。
在转化方法方面，研究人员提出了多种高效的转化方法。
常用的转化方法有冲击转化法、乙酰胆碱转化法、霉菌转导子转化法等。
这些转化方法都可以快速获得基因转化后的植株，并且能够在短时间内实现外源基因的高效表达。
在基因表达调控方面，研究人员通过改变转化载体的启动子、植物激素的供应等方法，进一步提高外源基因的表达水平。
一些研究中使用了强启动子来替换原有载体的启动子，从而显著提高了表达量。
研究人员还利用遗传工程手段调控植物自身基因的表达水平，进一步提高外源基因的表达效率。
随着科学技术的不断发展，植物瞬时表达系统的研究进展得到了显著的提升。
研究人员通过选择适宜的宿主植物、改进表达载体的结构和功能、优化转化方法以及调控基因表达等手段，提高了外源基因的表达水平和产量。
这对于快速获得大量重组蛋白、研究基因功能以及制造新型药物等具有重要意义，并为相关研究的进一步开展提供了强有力的支撑。
植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统（plant transient expression system）是指利用植物细胞暂时转化技术，将外源基因转为至植物体内的高效表达系统。
与其他表达系统（如大肠杆菌、哺乳动物细胞等）相比，植物瞬时表达系统具有以下优势：快速性、低成本、无病原性、可大规模生产等。
近年来，植物瞬时表达系统已经成为植物基因工程领域的研究热点之一。
下面将从基本原理、转化技术、应用以及存在的问题等方面进行综述。
一、基本原理植物瞬时表达系统利用植物组织或细胞中的转化技术（如农杆菌介导转化、雨生病毒等），将外源基因导入植物细胞内。
然后，利用植物体内的植物病毒启动子将外源基因与病毒RNA一同表达，从而实现外源基因的高效表达。
该系统具有以下特点：1）能够同时表达多个外源基因；2）表达水平高且可调控；3）表达时间短暂，MEMS（minutes to hours）级别；4）可以用于植物体内和植物细胞水平的瞬时表达。
二、转化技术1.农杆菌介导转化农杆菌介导转化是当前应用最广泛的一种植物瞬时表达系统。
其基本原理是将外源基因插入至农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）植物病原性质粒中，将农杆菌与目标植物细胞接种在一起，通过寄生菌的病理学作用将外源基因成功转化至目标植物细胞中。
该技术具有操作简单、转化效率高等优点。
但是由于农杆菌介导转化仅对部分植物有效，而且对于一些重要物种仍然存在难以克服的技术难题。
2.雨生病毒技术雨生病毒技术是利用雨生病毒有效传播的能力，将外源基因转入植物细胞，然后利用植物体内的病毒启动子进行表达。
由于雨生病毒非常小，可以在分子水平广泛传播，故该技术具有操作简单、适用范围广等优点。
然而，该技术的载体转化量有限，不适用于大规模生产。
三、应用1.基因功能定位植物瞬时表达系统在基因功能定位方面开拓了新的思路。
通过转化不同的融合蛋白并观察它们在植物细胞内的定位，可以快速确认目标蛋白的亚细胞定位，从而为基因功能的深入研究提供良好的方向。
烟草瞬时转化
-----WORD格式--可编辑--专业资料-----本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：A、实验步骤：1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。
*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。
3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。
4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。
5、重复步骤4。
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。
7、室温放置1~4小时8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。
*使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。
B、试剂：Induction medium：MES-KOH PH 5.7 10nMMgCl210mMAS 200uM推荐提前配制母液1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。
用高压灭菌的超纯水稀释。
C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。
严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。
D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。
过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。
利用TMV病毒载体在烟草中瞬时表达rPA(Reteplase)
利用TMV病毒载体在烟草中瞬时表达rPA(Reteplase)雒丽娜;王盛【摘要】构建了携带有人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA (Reteplase)的烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus,TMV)瞬时表达载体PJL TRBO-rPA,并转入农杆菌GV3101中.利用农杆菌渗滤接种技术在烟草本氏烟(Nicotiana benthamiana)中进行表达.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(western blotting)和纤维蛋白琼脂糖平板(fibrin-agarose plate assay,FAPA)法检测分析.结果表明,在烟草中成功地表达出了有活性的rPA.为在植物中生产Reteplase提供了一条可能的途径.%Tobacco Mosaic Virus RNA-based transient expression vectors containing the truncated Human Tissue Plasminogen Activator (Reteplase) was constructed and transformed into Agrobacterium GV3101. The recombinant Agrobacteria were delivered into tobacco plants (Nicotiana benthamiana) by means of an Agrobacterium-mediated transient transformation assay. The efficiency was evaluated by SDS-PAGE, western blotting and Fibrin-agarose plate assay (FAPA). Those results showed that bio-active rPA was successfully expressed in the tobacco leaves and proposed that the plant virus RNA-based expression system will be a useful tool for expressing Reteplase in plants for production purposes.【期刊名称】《宁夏大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(033)001【总页数】4页(P58-61)【关键词】人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA(Reteplase);烟草花叶病毒;瞬时表达载体【作者】雒丽娜;王盛【作者单位】宁夏大学生命科学学院,宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,宁夏银川 750021【正文语种】中文【中图分类】S432.41急性心肌梗死、脑梗死等血栓、栓塞性疾病的致残率和致死率都很高，严重威胁着人类健康及生命［1］.临床上，以溶血栓为主的溶栓药物疗法是治疗血栓疾病的主要方法，其作用机理是通过激活无活性的纤溶酶原转变成纤溶酶，催化血栓主要基质纤维蛋白水解，使血管再通［2］.重组的rPA（Reteplase）是临床上治疗血栓性疾病的常用药物［3］，是在人组织纤溶酶原激活剂（human tissue type plasminogen activator，t－PA）基因基础上，通过人工缺失获得基因后，再进行表达的基因工程产品，具有半衰期长、溶栓作用强、对纤维蛋白选择性高、副作用小等优点［4］.商品化的rPA药物是经由大肠杆菌表达系统获得的，非糖基化，产量较低，后续复性纯化的收率不高，价格昂贵（一个疗程需要8 000～10 000美元）.因此，探索和研究新型、高效的表达系统，是提高产量、降低成本的关键.近年来，研究人员先后在CHO细胞（chinese hamster ovary cell）［5］、酵母［6］、转基因动物乳腺［7］、昆虫细胞［8］、转基因植物［9—11］、利什曼原虫［12］和海藻［13］等表达体系中表达t－PA获得成功.但这些表达体系仍存在表达效率低、费用高、生产工艺繁琐和周期长等问题［14］.利用植物RNA病毒瞬时表达载体表达外源蛋白是近年发展起来的，具有表达量大、速度快和廉价等优势的一种新型外源蛋白表达方式［15］.与其他表达系统相比，植物病毒载体表达体系在短时间内、不影响环境的条件下，可以生产大量成本低廉、安全的目的蛋白，这是目前其他任何一个表达系统都不可能实现的，而且这些特点也恰好符合低成本rPA生产的需求.基于此，笔者构建了重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA（Reteplase）基因的烟草花叶病毒表达载体PJL TRBO－rPA，并在烟草中进行了表达研究和初步分析.1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株和试剂大肠杆菌（Escherich coli）DH5α菌株（保存于宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室）；质粒小提试剂盒、Protein Marker、1Kb Plus DNA Ladder Marker、DL2 000Marker、DL15 000Marker、Pfu DNA Polymerase Mix（天根生化科技（北京）有限公司）；预染Protein Marker、平末端克隆载体pEASYBlunt Simple Cloning Kit（全式金（北京）有限公司）；限制性内切酶PacⅠ和NotⅠ（纽英伦（NEB）生物技术北京有限公司）；T4DNA连接酶、DNA回收试剂盒（普洛麦格（北京）生物技术有限公司）；卡那霉素（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）；NC膜（宝生物工程（大连）有限公司）；rPA标准样（爱德药业（北京）有限公司）；ε－氨基己酸（EACA）（阿拉丁试剂（上海）有限公司）；rPA抗体（英国abcam公司）；羊抗兔Ig G－HRP、HRP－DAB底物显色试剂盒（博士德（武汉）有限公司）；牛纤维蛋白原（牛血）、纤维蛋白溶酶原（牛血）和凝血酶（中国药品生物制品鉴定所）；其他试剂均为进口或国产分析纯.1.1.2 质粒和载体 rPA－C9质粒（宁夏大学李敏教授提供）；PJL TRBO－G载体（美国俄亥俄州立大学John A.Lindbo博士惠赠）.1.1.3 植物材料烟草本氏烟（Nicotiana benthamiana）种子（中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所张永江博士提供）.1.2 方法1.2.1 引物设计根据GenBank（M15518.1）报道的t－PA序列，利用DNAMAN 5.0软件设计引物.上、下游引物分别带有PacⅠ和NotⅠ限制性内切酶酶切位点.上游引物Prpaf：5’－GGCGCCTTAATTAAATGTCTTACCAAGGAAACAGTGAC－3’，下游引物Prpar：5’－ATAGTTTAGCGGCCGCCCTAGGTTACGGTCGCATGTTGTC－3’（下划线为相应的酶切位点）.引物由生工生物工程（上海）有限公司合成.1.2.2 质粒的提取及目的基因的扩增按质粒小提试剂盒说明书提供的方法提取质粒rPA－C9并做模板，以引物Prpaf和Prpar扩增rPA基因片段.PCR扩增体系为25μL，其中含：0.25μL的Pfu DNA polymerase（2.5U／μL）、引物（20mol／L）各1μL、12.5μL的Pfu Mix（2.5mmol／L）、1.0μL模板DNA、9.25μL的去离子H2O.扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，50℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环.取5.0μL的PCR扩增产物以w＝1.0%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定.1.2.3 目的基因的pEASY－Blunt克隆大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化均按参考文献［16］中的方法进行.利用DNA回收试剂盒，对剩余的20μL PCR扩增产物进行回收、纯化.目的条带用平末端克隆载体pEASY－Blunt Simple进行15min快速连接，连接产物以氯化钙法转化感受态DH5α大肠杆菌.取100μL菌液涂布于含ρ＝50μg／mL卡那霉素的LB平板中，37℃过夜培养.挑取白色菌落，利用菌落PCR技术进行筛选并送生工生物工程（上海）有限公司对目的片段序列进行序列测定.1.2.4 烟草花叶病毒瞬时表达载体的构建以限制性核酸内切酶PacⅠ和NotⅠ双酶切烟草花叶病毒瞬时表达载体PJL TRBO－G和克隆载体pEASY－rPA的质粒DNA，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带并分别回收酶切片段；将回收的载体和基因片段按比例混合，用T4DNA连接酶于4℃连接过夜.将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂平板后培养过夜，随机挑取菌落进行扩大培养.小提质粒后用限制性内切酶PacⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定.1.2.5 农杆菌的转化参照文献［16］的方法进行电转化.1.2.6 烟草的接种方法将含目的载体的重组农杆菌菌株于LB液体培养基（含有50mg／L Kan、50mg／L Gent、50mg／L Rif）中28℃、200r／min，暗处振荡培养16～18h；将V（菌）∶V（液）＝1∶25转接入IM培养基中28℃振荡培养至A600约为1.0，离心收集农杆菌；等体积重悬（10mmol／L MgCl2，10mmol／L MES），再次离心收集菌体，等体积重悬（10mmol／L MgCl2，10mmol／L MES，200mmol／L AS），室温暗处静止2～3h后即可接种.用无针头的1mL无菌注射器将含目标载体农杆菌悬浮液压入叶片背面.1.2.7 烟草叶片蛋白的提取接种后第6天摘取植物叶片，以渗滤接种点为中心打孔取样并称鲜质量.叶片样品经液氮充分研碎后，用提取缓冲液（50mmol／L Tris－HCl，5mmol／L EDTA，100mmol／L Nacl，20%甘油，0.1%Tween－20，pH＝8.8）浸提、12 000r／min离心后吸取上层清液进行以下相关测定.1.2.8 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳按文献［16］的方法进行，w（分离胶）＝12%.1.2.9 免疫印迹检测按文献［16］中的方法进行.一抗按1∶5 000稀释，二抗按1∶500稀释.1.2.10 体外纤溶活性的检测按《中国药典》（2010版）中的方法进行.平板每孔加样2μL，同时以加入纤溶酶抑制剂ε－氨基己酸（EACA）的平板作为阴性对照.37℃湿盒放置反应24h后，用考马斯亮蓝对平板进行染色和脱色并观察记录结果.2 结果与分析2.1 目的基因的扩增与序列测定以质粒rPA－C9做模板，以Prpaf和Prpar为引物进行PCR反应，得到约1.0kb 的特异性扩增带，与预期相大小相符（图1）.将此PCR产物回收纯化后，连接到克隆载体pEASY－Blunt Simple上得到重组质粒，命名为pEASY－rPA.以上、下游引物进行PCR扩增，进一步证实了目的基因rPA已经插入到pEASYBlunt克隆载体中（图2）.测序结果经序列拼接和载体序列去除后，获得长度为1 173bp的序列，且序列比对结果与GenBank（M15518.1）中报道的一致.图1 PCR扩增rPA基因的电泳图谱M—DL 2 000Marker；1—PCR扩增获得的rPA基因；2—阳性对照；3—阴性对照图2 rPA基因pEASY－Blunt克隆的PCR菌落鉴定的电泳图谱M—DL 2000Marker；1—阳性对照；2—阴性对照；3～5—PCR扩增产物2.2 TMV病毒表达载体PJL TRBO－rPA的构建烟草花叶病毒瞬时表达载体PJL TRBO－G和克隆载体pEASY－rPA用限制性核酸内切酶PacⅠ和NotⅠ进行酶切（图3），电泳后分别回收酶切片段.通过连接反应将目的片段插入烟草花叶病毒瞬时表达载体PJL TRBO－G中，替代PJL TRBO －G中绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因.连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂平板后培养过夜，随机挑取菌落进行扩大培养.抽提质粒后用PacⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，1.0%琼脂糖凝胶电泳显示两条带，分别为10.6kb及1.0kb（图4），与预期的大小相符，说明rPA基因已成功插入到烟草花叶病毒瞬时表达载体PJL TRBO－G中，重组质粒命名为PJL TRBO－rPA.图3 PJL TRBO－G和pEASY－rPA质粒PacⅠ和NotⅠ双酶切电泳图谱M1—DL15 000Marker；M2—DL2 000Marker；1—PJL TRBO－G质粒；2—PJLTRBO－G质粒PacⅠ和NotⅠ双酶切产物；3—pEASY－rPA质粒；4—pEASY －rPA质粒PacⅠ和NotⅠ双酶切产物；5—pEASY空质粒；6—rPA质粒PCR产物图4 PJL TRBO－rPA重组质粒PacⅠ和NotⅠ单、双酶切鉴定电泳图谱M—1kb Plus DNA Ladder Marker；1—PJL TRBO－G质粒；2—rPA质粒PCR产物；3—PJL TRBO－rPA重组质粒PacⅠ单酶切产物；4—PJL TRBO－rPA重组质粒NotⅠ单酶切产物；5—PJL TRBO－rPA重组质粒PacⅠ和NotⅠ双酶切产物；6—PJL TRBO－rPA重组质粒2.3 rPA在烟草中的表达分析取健康烟草叶片及接种PJL TRBO－rPA载体6d的烟草叶片，分别用蛋白提取缓冲液提取蛋白.所得样品与rPA标准样同步进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS －PAGE）（图5）.结果表明，与健康烟草相比，接种PJL TRBO－rPA载体的烟草叶片总蛋白提取物在40kDa处未见明显的差异条带（图5中的H，1泳道）；在33，28，24kDa处存在3条明显的差异条带.已知rPA在其氨基酸序列的第275／276和423／424间存在2个蛋白酶切割位点，因此推测rPA在烟草中获得了表达，但是表达产物发生了部分降解.图5 rPA在烟草中表达的SDS－PAGE电泳分析M—Protein Marker；H—健康烟草可溶性总蛋白；1—接种PJL TRBO－rPA载体6d后烟草可溶性总蛋白；2—rPA标准样品为了进一步验证上述推测，对上述样品做了免疫印迹（western blotting）检测分析（图6）.结果表明，表达样品在39，33，28，24kDa处存在杂交条带（图6中1泳道），而健康对照样品在相应位置不存在条带（图6中，H泳道条带为上样量较大时Rubisco大亚基形成的非特异性条带）；同时标准样品在相应的位置也有杂交条带产生.说明rPA在烟草中获得了表达且由于表达产物的不稳定，发生了部分降解.图6 rPA在烟草中表达的western blotting检测结果M—预染Protein Marker；H—健康烟草可溶性总蛋白；1—接种PJL TRBO－rPA载体6d后烟草可溶性总蛋白；2—rPA标准样品2.4 rPA活性的纤维蛋白琼脂平板（FAPA）检测在处理好的纤维蛋白平板上加样，各孔均上样2μL，37℃培养24h.活性检测表明，表达样品与标准样品具有体外溶栓活性，而空白对照和健康对照均未发现有活性（图7中EACA（－））.同时，含纤溶酶抑制剂的纤维蛋白平板各样品为没有活性反应（图7中EACA（＋））.该结果进一步证明rPA基因在烟草中获得了表达，且表达产物具有生物学活性.图7 体外纤溶活性的检测Mock—阴性对照；H—健康烟草可溶性总蛋白；1—接种PJL TRBO－rPA载体6d后烟草可溶性总蛋白；2—rPA标准样品3 讨论目前，利用植物生产的药用蛋白或多肽正在逐年增加，该实验也利用烟草花叶病毒表达载体在植物中对rPA（Reteplase）进行了表达研究.结果表明，在烟草中获得了有纤溶活性的rPA重组蛋白，证明了利用植物作为生物反应器生产rPA的可行性.研究中发现，利用植物表达的重组rPA与大肠杆菌表达系统表达的rPA标准样品在相对分子质量上略有差异（图6中1，2泳道），但FAPA验证了二者均具有体外纤溶活性（图7）.分析相对分子质量差异的原因，可能是由于天然的组织型纤溶酶原激活剂自身具有2个糖基化位点，在利用植物体系表达的rPA表达后进行了糖基化的修饰而原核表达的rPA不存在这种修饰，因此造成两者之间在相对分子质量和电泳行为上的差异.此外，利用植物表达的重组rPA中大部分表达产物发生了降解，严重地影响了表达的最终产量.如何进一步避免表达产物的降解，提高系统的表达效率就成为下一步需要重点解决的问题.该研究初步建立了利用烟草花叶病毒表达载体在烟草中瞬时表达重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA（Reteplase）基因的体系，为在植物中生产rPA提供了一条可能的途径，同时对深入了解植物RNA病毒载体表达系统和指导其他具有商业价值的外源基因表达奠定了基础.参考文献：［1］ LLOYD－JONGES D，ADAMS R J，BROWN T M，et al.Heart disease and stroke statistics－2010update：a report from the American Heart Association［J］.Circulation，2010，121（7）：46－215.［2］ ALBRIGHR K，MARTIN－SCHILD S，MORALES M，et ment on US geographic distribution of recombinant tissue plasminogen activator use by hospitals for acute ischemic stroke［J］.Stroke，2009，40（11）：3580－3584.［3］刘晓宇，王憬惺.Reteplase－第3代基因重组纤溶酶原激活物［J］.中国输血杂志，2000，13（2）：1287－130.［4］ GRUNWALD I Q，WAKHLOO A 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植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统是一种可以快速高效地表达外源基因的技术，可以用于植物基因功能研究、农业生物技术等领域。
在过去的几十年里，研究人员不断改进和发展植物瞬时表达系统，使之更加适用于各种不同的植物物种和基因表达需求。
本文将对近年来植物瞬时表达系统的研究进展进行综述。
目前广泛应用的植物瞬时表达系统之一是准双生物系统。
该系统利用无病毒植物（如烟草、洋葱等）叶片中的细胞壁降解酶和激素诱导等技术，将外源基因迅速表达于植物细胞中。
准双生物系统具有表达速度快、适用范围广、表达水平高等优点。
研究人员在该系统中引入了一些改进，如构建了一些特定的表达载体、调整了外源基因的启动子、选择了适合的植物物种等，以提高系统的表达效率和稳定性。
冷冻切片技术是近年来研究人员在植物瞬时表达系统中的一项重要突破。
该技术通过将植物组织或细胞冷冻切片，并在切片上进行DNA或RNA的转染，实现基因的瞬时表达。
冷冻切片技术具有不需要整株植物的特点，可以在实验室中进行快速高效的基因表达研究。
研究人员还进行了一些改进，如优化了冷冻切片的步骤、选择了合适的切片材料和切片工具等，以提高技术的稳定性和可重复性。
一些新兴的基因编辑技术也被应用于植物瞬时表达系统中。
CRISPR/Cas9技术可以精确编辑植物基因组中的特定区域，从而产生目的基因表达变异体。
研究人员在植物瞬时表达系统中引入了CRISPR/Cas9技术，实现了在短时间内快速高效地编辑植物基因组。
这些技术的引入使得研究人员可以更加深入地理解植物基因功能和调控机制。
还有一些基于病毒的植物瞬时表达系统被广泛应用于研究中。
这些基于病毒的系统利用植物病毒的复制和表达机制，将外源基因迅速表达于植物细胞中。
研究人员通过改变病毒载体的结构、优化病毒颗粒的产生条件、调节外源基因的插入位置等方式，提高了病毒介导的基因表达效率和稳定性。
植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统（Plant transient expression system）是一种用植物作为生物反应器来表达外源基因的技术。
相对于传统的植物基因转化技术，植物瞬时表达系统具有操作简单、高效快速、适应性强等优点，因而在植物基因工程研究和产业化应用中得到了广泛应用。
近年来，植物瞬时表达系统在实验室中的应用日益增多，其研究进展也取得了很多重要的突破。
下面将就植物瞬时表达系统的研究进展进行详细的介绍。
一、植物瞬时表达系统的基本原理与方法植物瞬时表达系统是利用植物体内的洋结球病毒、冠状病毒等病毒载体，通过基因枪法、电穿孔法、冻融法等方法将外源基因或者载体转移到植物细胞中，然后通过植物细胞的生物机制来表达这些外源基因。
基本原理是：将目标基因的DNA序列插入病毒载体中，然后将这个病毒载体引入植物细胞，并利用植物细胞自身的转录和转译系统来表达目标基因。
植物细胞内的RNA聚合酶和核糖体可以识别和转录由病毒载体上的启动子引导的目标基因的RNA序列。
当前，植物瞬时表达系统主要包括两种方法：基因枪法（Gene gun method）和冷冻质子法（Cold protonema method）。
基因枪法是一种通过高速微粒束将外源基因转入植物组织或者细胞内的方法。
利用基因枪设备，通过调节高压氦气或者氮气，将导入的DNA颗粒射入目标组织。
该方法可以用于不同的植物组织、细胞和亚细胞的转化，适用性广泛。
而冷冻质子法则是利用电极直接将导入的DNA或RNA质子射向目标组织或细胞的方法。
冷冻质子法可以实现更高的转化效率，并可用于大规模的瞬时表达培养。
近年来，植物瞬时表达系统的研究进展迅速，主要体现在以下几个方面：1. 高效快速的基因转导技术：研究人员通过改进基因枪和冷冻质子等转导技术，提高了基因表达的效率和速度。
通过优化基因枪药剂的配方和冷冻质子的射击参数，可实现更高的表达效率。
2. 外源基因表达的调控：研究人员通过基因工程技术，构建了一系列的响应子集和调控元件，实现了对外源基因表达的调控。
烟草瞬时转化实验步骤
烟草叶片瞬时转化实验试验方法一、实验材料及药品pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等二、载体构建及农杆菌转化烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。
通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。
三、材料的准备1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）：0.5M MES 200ul 0.976g1M MgCl2100ul 2.03g100mM乙酰丁香酮10ul 0.196g（使用DMSO溶解）灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）四、操作步骤1、农杆菌转化2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）3、确定不同农杆菌所加菌液的量：计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。
烟草瞬时表达实验原理
烟草瞬时表达实验原理利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作（BiFC）和蛋白的纯化等实验操作。
在荧光蛋白(YFP、GFP、Luciferase 等)的两个β 片层之间的环结构上有许多特异性位点可以插入外源蛋白而不影响荧光蛋白的荧光活性。
BiFC 技术正是利用荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白融合表达。
如果两个目标蛋白因物理相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成有活性的荧光基团而发出荧光。
试剂：500 mM MES (pH5.6)、100 mM MgCl2、100 mM 乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)、LB 培养基、50 mg/mL Kana (母液)、25 mg/mL Rif (母液)、100 mg/mL Amp (母液)。
仪器：一次性注射器、恒温摇床、分光光度计、普通离心机、激光共聚焦显微镜。
配方：500 mM MES (pH 5.6)：称取9.75 g无水MES，用去离子水溶解，经NaOH调pH至5.6，定容至100 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，于4 °C保存。
100 mM 乙酰丁香酮：称取0.196 g乙酰丁香酮，用5 mL DMSO (二甲基亚砜) 溶解，再用去离子水定容至 10 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
50 mg/mL Kana (母液)：称取1 g的Kana粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
100 mg/mL Amp (母液)：称取2 g的Amp粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
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植物病原菌诱导表达载体构建及在烟草中的瞬时表达研究欧阳乐军;黄真池;沙月娥;曾富华【摘要】According to the sequences of pathogen-inducible plant promoters PPP3 at GenBank,PPP3 promot-ers was cloned from tobacco genome .It was used to replace cauliflower mosaic virus 35 S promoter of pCAM-BIA1301 .The recombinant plasmid was used to transform Agrobacterium tumefaciens GV3101 .The inducibility of the PPP3 promoters in tobacco leaf was evaluated by Agrobacterium tumefaciens-transient genetic transformation as-sye .Real-time quantitative PCR was used to screen the PPP 3 promoters with high inducible expression .The results showed that the gus transcript level under the control of PPP 3 promoters increased respectively 27 .94 fold and 17.69 fold after inoculation with Ralstonia solanacearum and SA.The PPP3 promoter had the advantages such as low basal activity and high expression activity .%根据GenBank中植物病原物诱导型启动子碱基序列设计引物，以烟草基因组DNA为模板，扩增PPP3启动子。
用PPP3替换pCAMBIA1301中与gus基因相连的35S启动子，构建重组质粒pCOMBIA ＋PPP3＋gus后导入农杆菌GV3101。
通过农杆菌介导的瞬时表达技术将受PPPs控制的gus基因导入烟草。
分别接种青枯菌和水杨酸24 h后，烟草叶片中检测到gus基因转录效率分别提高了27．94，17．69倍。
表明PPP3启动子具有本底表达水平低、诱导表达活性强的特点。
【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2013(000)004【总页数】5页(P41-45)【关键词】诱导型启动子;瞬时表达;定量PCR【作者】欧阳乐军;黄真池;沙月娥;曾富华【作者单位】湛江师范学院生命科学与技术学院，广东湛江 524048;湛江师范学院生命科学与技术学院，广东湛江 524048;湛江师范学院生命科学与技术学院，广东湛江 524048;湛江师范学院生命科学与技术学院，广东湛江 524048【正文语种】中文【中图分类】Q786近年来越来越多的研究表明,农杆菌介导的瞬时表达技术是一种快速有效的分析基因表达的方法[1]。
该方法同样也是以农杆菌介导法为基础,将外源基因导入植株叶片后,短时间内就可进行快速检测。
因此,瞬时表达技术具有操作简易、周期短以及表达高效等优点,目前在多种植物中已有运用该方法进行启动子功能分析的成功报道[2-7]。
当前,要想运用诱导表达策略提高外源抗性基因的表达效率与转基因技术的实际应用效果,就必须找到真正具有高效诱导表达活性的病原物诱导型启动子。
研究表明,一个合适的病原物诱导型启动子往往具有本底活性低、诱导表达效率高、不受伤诱导等特点[8]。
但一种顺式作用元件往往同时受几种信号途径的调控,因此,要找到理想的病原物诱导型启动子不容易[9]。
本研究从烟草中扩增到的PPP3启动子置换pCAMBIA1301中的35S组成型启动子,调控gus报告基因表达。
经农杆菌介导法转入烟草叶片进行瞬时表达,通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,QPCR)检测接种病原物后GUS活性变化,分析病原菌诱导型启动子PPP3诱导表达活性及特点。
探讨农杆菌介导的基因瞬时表达法在分析启动子表达活性中的应用,为快速筛选诱导因子广、诱导表达强度高、本底活性低的病原诱导启动子提供借鉴与参考。
1 材料和方法1.1 植物材料烟草(Nicotiana tabacum L.)种子,由湛江师范学院广东高校特色植物工程中心实验室保存,播种于土壤中,并将其放入(26±1)℃、16 h/d光照和50 μmol/(m2·s)光强的人工气体培养箱中培养。
60 d后用于农杆菌介导的基因瞬时表达。
1.2 菌株、质粒及试剂农杆菌GV3101、pCAMBIA质粒由湛江师范学院广东高校特色植物工程中心实验室保存;E.coli DH5α、pMDTM19-T Vector 购自宝生物工程(大连)有限公司。
限制性内切酶、5 000 bp DNA Ladder Marker、Premix Taq Version 2.0、DNAiso Reagent购自宝生物工程(大连)有限公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒、Trizol Reagent购自生工生物工程(上海)有限公司;PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成;小量质粒提取试剂盒购自天根生物公司;通用型PCR试剂盒琼脂糖购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司;其他试剂均为国产分析纯,购自广州化学试剂厂。
1.3 试验方法1.3.1 PPP3启动子的克隆及诱导表达载体构建根据GenBank中病原菌诱导型启动子PPP3(AF469483)序列设计引物(下划线分别表示,Hind Ⅲ和NcoⅠ的酶切位点)。
Primer 1′：5′-GCAAGCTTGAAAAGGGTCCAGTCCT-3′;Primer 2′：5′-GTCCATGGAGTACTATTTATAGTGAT ATATATGCT-3′。
以烟草基因组DNA为模板,PCR扩增PPP3启动子。
PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测后,用生工生物工程(上海)公司琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段;回收的PCR产物分别连接克隆载体pMDTM19-T Vector ,然后转化E.coli DH5α;挑选平板中的白色菌落,进行PCR检测。
同时,用限制性内切酶Hind Ⅲ和NcoⅠ对提取的质粒进行酶切验证克隆子。
用Hind Ⅲ和NcoⅠ酶切重组质粒和pCAMBIA1301质粒,将酶切回收的PPP3小片段与酶切回收的pCAM质粒大片段进行连接后转化农杆菌,采用双酶切和PCR扩增法进行重组质粒pCAM+PPP3+gus鉴定。
PCR扩增、酶切及回收、质粒提取、连接转化参照试剂盒操作说明。
1.3.2 农杆菌介导的瞬时表达分析烟草中瞬时表达方法参照文献[1]。
将含质粒pCOMBIA+PPP3+gus的农杆菌GV3101培养在含Rif(50 μg/mL)和Kan(50μg/mL)的LB培养基中,于28 ℃,200 r/min培养直至OD600为0.6。
用无针头的注射器将农杆菌接种于烟草叶表面,接种后的植株放于26 ℃控湿培养箱,12 h后分别用青枯菌及水杨酸处理,处理12 h后提取叶片RNA。
1.3.3 瞬时表达叶片组织化学染色分析将青枯菌及水杨酸处理12 h后,烟草叶片浸染于X-Gluc溶液,GUS染色方法参照魏开发[10]的方法。
1.3.4 总RNA提取及cDNA合成接种后取15～20 mg烟草叶片,用液氮充分研磨后用上海生工 Trizol Reagent提取总RNA,具体方法参照说明书。
以RNA为模板用于Reverse transcriptase-PCR(PrimeScriptTMRT Master Mix Perfect Real Time)反应得到cDNA。
反应体系：5×PrimeScript Buffer(for Real Time)2 μL,RNA 5 μL,RNasel-free ddH2O 3 μL;PCR程序：37 ℃,15min;85 ℃,5 s,4 ℃保存。
1.3.5 实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,QPCR) 使用Primer 3设计QPCR引物,引物长度18～25 bp,融解温度在50～65 ℃,引物的GC含量为50%～60%,避免超过3个G或C重复片段。
gus的上游引物：5′-CTGATAGCGCGTGACAAAAA-3′;gus的下游引物：5′-GGCACAGCACATCAAAGAGA-3′;内参基因actin 的上游引物：5′-ACATTGTGCTCAGTGG TGGA-3′;actin的下游引物：5′-CAAGATAGAGCC TCCGATCC-3′。
按步骤2.3提取烟草总RNA并进行两步法RT-PCR,合成得到cDNA溶液进行QPCR。
QPCR反应体系为25 μL,模板量为2 μL cDNA,每个反应设置3个重复。
QPCR程序为：94 ℃,10 s 预变性;94 ℃ 10 s变性,55 ℃ 15 s,72 ℃延伸15 s。
反应结束后分析PCR产物的特异性。
数据分析方法采用相对定量的Pfaffl法[11],用Opticon Monitor 3进行数据统计分析。
计算公式如下：公式中Etarget和Eref分别是目的基因和参照基因的扩增效率。
2 结果与分析2.1 诱导表达载体构建2.1.1 PPP3启动子的克隆以烟草基因组DNA为模板可扩增出大小为220 bp的DNA片段,其大小正好与GenBank中所报道的细菌诱导型启动子PPP3(图1)的大小相符。
M.100 bp DNA Marker;1.阴性对照;2～5.PPP3扩增片段。
M.100 bp DNA Marker;1.Negative control;2-5.PPP3 were amplified from tobacco genomic.图1 烟草细菌诱导型启动子PPP3的扩增Fig.1 The amplification of bacteria-induciblepromoter PPP3 from tobacco genomic2.1.2 pMDTM19-T-PPP3 转化大肠杆菌的鉴定以重组质粒为模板,进行PCR扩增,经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析,扩增产物片段大小为220 bp左右(图2-A)。
用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切重组大肠杆菌质粒,经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析,出现2条条带,其中 PPP3片段大小约220 bp(图2-B)。