免疫逃避型人胰岛类器官改善糖尿病

免疫逃避型人胰岛类器官改善糖尿病导读干细胞来源的胰岛有望成为治疗胰岛素依赖型糖尿病的有效策略，但仍面临挑战。

本研究诱导多能干细胞产生人胰岛类器官（HILO），驱动非经典的WNT4信号促进其代谢成熟。

这些功能成熟的HILO 包含内分泌类细胞，且移植后可在糖尿病NOD / SCID小鼠中快速重建葡萄糖稳态。

PD-L1的过表达保护HILO异种移植，使它们能够在具有免疫活性的糖尿病小鼠中复原葡萄糖稳态达50天。

此外，IFN-γ离体刺激可诱导内源性PD-L1表达，并抑制T细胞活化和移植排斥。

这类能够逃避免疫检测的葡萄糖反应性胰岛类器官的产生，为尸体和设备依赖的糖尿病治疗提供了极具前景的替代方案。

结果1 WNT4诱导HILOs的功能成熟胰岛移植可为1型和2型晚期糖尿病患者提供长期有效的血糖，但尸体来源的胰岛因质量和可利用性而限制了其实用价值。

尽管诱导性多能干细胞（iPS细胞）向胰岛β样细胞的分化取得重大进展，但产生适合于人类治疗的功能性β样细胞仍待探究。

研究者先前证明核雌激素相关受体γ（ERRγ）能够驱动葡萄糖刺激下β细胞胰岛素分泌（GSIS）所必需的产后代谢成熟。

ERRγ在iPS来源的β样细胞中的过表达足以实现体内/外功能。

为了产生适合移植的功能性细胞，研究者探索能够复制细胞结构以及胰岛细胞类型多样性的培养条件。

最初利用人类脂肪干细胞（hADSCs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）（分别模拟胰腺成纤维细胞和胰腺内皮细胞）在三维（3D）培养和多糖悬浮凝胶培养中形成器官和血管结构的固有能力。

在人类iPS细胞（hiPS细胞）衍生的内分泌祖细胞分化过程中掺入hADSCs和HUVECs，可形成与人类胰岛大小相当的多细胞球体（MCSs）。

与不存在hADSCs和HUVECs的情况相比，MCSs中ESRRG（编码ERRγ）和线粒体基因NDUFA1和COX7A2的表达增加，这也与体外葡萄糖刺激后胰岛素分泌升高有关。

在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病NOD / SCID小鼠中，移植到肾囊中的MCSs能够维持葡萄糖稳态约40天，显示出与人胰岛移植相似的效果，且移植的MCSs仍对葡萄糖具有反应性。

这些结果均表明3D多细胞相互作用在器官发生中具有重要作用。

在hADSC自组装过程中发生的转录变化基因本体（GO）分析显示富集的代谢和细胞因子信号以及WNT信号途径。

在小鼠胰岛的产后功能成熟过程中WNT4的表达增强，并且非经典的WNT 途径可诱导人胰岛的β细胞成熟并增加GSIS，此外，WNT4在人类胰岛中高度表达。

人类胰岛的单细胞测序表明WNT4在β和α细胞中的广泛表达。

基于此，研究者认为WNT信号传导足以支持iPS细胞衍生的离体β样细胞的功能成熟。

为此，利用CRISPR–Cas9生成显示内源胰岛素启动子活性的报告基因。

在3D培养系统中对这些改造的hiPS细胞进行分化，并在最后的成熟步骤中掺入WNT4，可诱导表达胰岛素的人胰岛类器官（HILO）的形成（图1a，b）。

此外 HILOs 高表达尿皮质激素-3（UCN3）和胰岛素。

电子显微镜显示HILO与人类胰岛结构相似，最重要的是胰岛素和胰高血糖素颗粒的存在（图1c）。

比较转录分析显示WNT4处理的HILO（wHILO）和人类胰岛中多个关键胰岛细胞标记物的表达相似，如β细胞特异性（NKX6-1，NEUROD1，RFX6，GCK，ISL1，SYT4和PDX1）和α-细胞特异性（ARX）基因，而INS，MAFA，MAFB，UCN3和NKX2-2表达较低（图1d）。

加入WNT4不会改变β细胞谱系特异性标志物的表达（如INS，NKX6-1，UCN3，MAFB和SYT4），这表明WNT信号传导不会影响细胞命运的确定。

但WNT4以剂量依赖方式增加了HILO中ESRRG以及线粒体呼吸链NDUFA7和COX7A2的表达（图1e），与基因表达的变化一致。

在WNT4存在条件下衍生的 HILO其氧化代谢增加，这也与健康人类胰岛的代谢特征一致（图1f）。

WNT4处理的HILOs表现出改善的体外GSIS，且不能被β-连环素抑制剂（XAV939）所阻断，暗示非经典的WNT信号是诱导β细胞成熟的驱动力（图1g）。

在多能HuES8和H1ES 细胞的分化和成熟过程中观察到类似的转录和功能变化，表明此方案的稳定性。

在含有WNT4的3D分化培养基中培养商业化的hiPS衍生的β样细胞，也可促进伪胰岛的形成和GSIS功能。

在STZ诱导的NOD / SCID糖尿病小鼠中移植wHILOs恢复了其血糖控制，并维持了葡萄糖稳态超过六周。

总之，这些结果表明非经典的WNT信号足以诱导HILOSs代谢成熟，这也是GSIS所必需的。

为明确驱动HILOs成熟的分子机制，研究者鉴定在WNT4处理所诱导的转录变化。

WNT4处理增加了1,581个基因的表达，并减少了1,354个基因的表达。

基因本体（GO）分析明确了代谢途径，最为显著的是氧化磷酸化，在上调的基因组中富集（图1h），与对细胞代谢的影响一致。

WNT4处理可将HILOs中OxPhos基因的表达完全提高至与人类胰岛相似的水平，并增加线粒体含量（图1i）。

为了检测β样细胞群体中的特定影响，在有/无 WNT4或WNT5a处理HILOs 时，基于HILOs 的GFP表达，对分泌胰岛素的细胞进行分类。

胰岛素分泌细胞比例不受WNT处理的影响，与HILOs成熟期恒定的β细胞谱系标志物的表达一致。

但WNT4和WNT5a处理增加了胰岛素分泌细胞中的线粒体质量，这也支持线粒体支撑β样细胞代谢成熟的观点。

为了鉴定该成熟步骤的遗传效应，利用 ATAC-seq在分选的GFP +细胞中WNT4诱导的染色质可及性变化进行分析，可观察到广泛的染色质可及性的微小变化。

利用GO对WNT4处理后表达量和染色质可及性增加的123个基因进行分析，明确了代谢途径（包括氧化磷酸化），而对该基因子集的基序分析确定了包括FOXA2和ERRs在内的β细胞成熟因子。

此外WNT4可诱导从野生型而非ERRγβ细胞特异性基因敲除小鼠（ERRγKO小鼠）中分离的新生儿胰岛中，线粒体代谢基因的表达并改善GSIS功能。

总之，这些结果表明非经典的WNT4信号传导可增强线粒体功能，且很大程度上是通过诱导ERRγ基因网络（驱动β样细胞的代谢成熟）来实现（图1）。

图1. WNT4诱导HILOs功能成熟。

a，产生HILOs的示意图，图中显示了每个发育过程中需添加到培养基中的关键因素，上下箭头分别表示激动剂和抑制剂。

DE，定形内胚层；EP，内分泌祖细胞；FG，后前肠；PP，胰腺祖细胞。

Act, 激活素A；RA，视黄酸；VitC，维生素C；VitE，维生素E; ALK5也称为TGFBR1。

b，3D培养中HILOs图像（左）和人胰岛素启动子驱动的胰岛素表达（右，由GFP指示）。

c，wHILOs和人胰岛的电子显微镜图，显示了胰岛素和胰高血糖素颗粒。

d，在hiPS细胞，经PBS（-）或rhWNT4（+）处理的HILOs和人胰岛中关键胰岛基因相对表达的热图。

e，用梯度浓度的WNT4处理后，HILOs中ESRRG，NDUFA7和COX7A2基因的相对表达。

f，测量在hiPS细胞球状体（0天，紫色），PBS处理的HILOs（绿色），WNT4处理的HILOs（红色）和人胰岛（蓝色）中的耗氧率（OCR）。

g，体外HILOs在不同刺激条件下人C肽分泌的情况，如体外人C 肽分泌对（G3）或20 mM葡萄糖（G20）或20 mM KCl（K20）刺激。

h，HILOs中WNT4调控基因的GO分析。

富集途径中的上调和下调基因分别以红色和蓝色圆点显示。

i，3D培养的hiPS细胞，HILOs，wHILOs和人胰岛中氧化磷酸化基因相对表达的热图。

2 成熟HILOs 的细胞复杂性免疫组织化学和流式细胞仪分析显示50–60％的wHILO细胞共表达胰岛素和β细胞标志物，并鉴定出少数表达其他内分泌细胞标志物（如胰高血糖素，生长抑素，胰腺多肽）的细胞群（图2a）。

WNT4处理并不会改变HILO的细胞组成，这与转录分析一致。

为了表征代谢成熟HILOs的细胞复杂性并了解其体外成熟程序，研究者比较了HILOs（PBS处理）和wHILOs（WNT4处理）单细胞转录组。

wHILOs聚类分析发现了一类富含β细胞标记物和SOX9 + HES1 +的胰腺祖细胞簇。

特征基因表达分析进一步区分了非复制和复制性导管内分泌双能细胞（TOP2A±），内分泌素富集的细胞（GCG +或SST +），导管样细胞（KRT19 +）和少量功能未知的细胞。

综合的HILO和wHILO单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据聚类表明在β样细胞簇其谱系标记INS，NEUROD1，NKX6-1和PDX-1的表达非常相似。

相比之下， WNT4处理INS + ESRRG +细胞，其ESRRG及其靶线粒体基因NDUFV3的表达增加，而糖酵解基因LDHA减少。

对wHILOs和人胰岛单细胞数据集的类似综合分析证实了多种内分泌样细胞类型的存在（图2b）。

尽管差异显著，wHILOs能与胰岛内分泌细胞（β-，α-，δ-和γ-细胞）聚类，暗示其转录相似性（图2b）。

值得注意的是，与胰岛细胞共聚类的功能分类显示wHILOs中主要存在β样和α样细胞（图2b）。

图2. 外源性PD-L1表达在免疫能力强的小鼠中扩展了wHILO功能。

a.胰高血糖素的代表性免疫荧光染色(GCG；α细胞标志物)、生长抑素(SSTδ细胞标志物)和胰腺多肽(PP；γ细胞标记)。

β细胞由胰岛素启动子的绿色荧光蛋白表达来指示。

（比例尺，75μm。

右侧，方框区域的扩展。

）b，T-分布式随机邻居嵌入(t-SNE)聚类组合wHILO(蓝点，n = 4，840)和人胰岛(红点，n = 3，245)单细胞转录组(左)和由该聚类分析定义的细胞类型(左)。

c，实验方案示意图。

高剂量STZ (HD-STZ，180mg·kg-1)诱导的糖尿病C57BL6J小鼠接受有或无PD-L1过度表达(n = 500)的wHILOs或小鼠胰岛移植。

d，移植有或无PD-L1表达的wHILOs(分别为11和9)和C57BL6J 胰岛(7)后随机喂养的血糖水平。

e，流式细胞术分析在移植有或没有PD-L1表达的wHILOs后27天从肾被膜移植物中回收的胰岛素表达和小鼠免疫(CD45+)细胞(n = 6)。

显示每个区域中的细胞百分比。

数据为平均标准差*P<0.05，P < 0.01，***P<0.001单尾配对学生测验。

图像是三个独立实验的代表。

数据具有代表性(e)，或由三个独立样本(b)或实验(d，f)汇编而成。

3 wHILOs具有免疫耐受性PD-L1为 wHILOs提供免疫保护。