人乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞株的建立及其耐药机制的探讨
乳腺癌的化疗药物耐药机制研究
乳腺癌的化疗药物耐药机制研究乳腺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，化疗是乳腺癌治疗的重要手段之一。
然而，随着化疗的广泛应用，乳腺癌患者出现耐药问题，限制了药物治疗的效果。
为了克服这一挑战，科研人员对乳腺癌的化疗药物耐药机制进行了深入研究。
化疗药物耐药是指乳腺癌细胞对药物的抗性增强，导致治疗效果降低或失效。
针对乳腺癌的化疗药物耐药机制，目前研究主要集中在多种因素上，如基因突变、肿瘤微环境、肿瘤干细胞等。
基因突变是乳腺癌药物耐药机制中的重要因素之一。
研究发现，某些细胞因子受体基因的突变会导致乳腺癌细胞对药物的耐药性增强。
例如，HER2阳性乳腺癌患者常常出现HER2基因突变，使得HER2受体对靶向药物的敏感性下降。
此外，BRCA1、BRCA2等基因的突变也与乳腺癌化疗药物耐药性相关。
肿瘤微环境也为乳腺癌细胞抵抗化疗药物提供了条件。
肿瘤组织中存在的低氧环境、富含细胞因子的炎症环境等都是导致耐药性产生的重要因素。
这些环境因素不仅促进了肿瘤细胞的生存和增殖，还引起了炎症反应，降低了化疗药物的疗效。
此外，肿瘤干细胞也是乳腺癌化疗药物耐药性的重要原因。
肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化的能力，能够在化疗过程中幸存下来，并通过激活特定的信号通路来产生抗药性。
乳腺癌患者中的肿瘤干细胞具有高度的耐药性，是导致药物治疗失败的主要原因之一。
针对乳腺癌的化疗药物耐药机制，科研人员提出了一系列的应对策略。
首先，基于基因突变的耐药机制，研究人员开发出了新的靶向药物，如HER2抑制剂和PARP抑制剂，以增强对耐药乳腺癌的治疗效果。
其次，通过抑制肿瘤微环境中的炎症反应和肿瘤血管生成，可以增强化疗药物的疗效。
此外，研究人员还通过免疫治疗、肿瘤干细胞靶向治疗等方式来应对化疗耐药问题。
总之，乳腺癌的化疗药物耐药机制是一个复杂的问题，涉及多个因素的相互作用。
通过深入研究这些机制，可以为乳腺癌的治疗策略提供新的思路和方法。
未来，科研人员将继续努力，进一步揭示该领域的奥秘，为乳腺癌患者的治疗提供更为有效的方案。
RPN2基因促进乳腺癌多西紫杉醇耐药
Ｓ ＡＴ Ｔ ３抑 制 剂 所 抑 制 ， 并 不 能 通 过 Ｐ ３ 和 ＭＥ Ｅ Ｋ 而 但 ＩＫ Ｋ／ Ｒ 抑 制 之 。而 且 ， 成 性 激 活 的 Ｓ Ｔ３可 明显 活 化 Ｔｗ ＩＴ 启 组 ＴＡ ｓ
Ｍｅ ， ０ ８ １ （ ） ９ ９ ９ ８ ｄ ２ ０ ，４ ９ ：３—４ ．
Ｔ Ｓ １ 表 达 与 原 发 结 直 肠 癌 淋 巴 结 浸 润 以 及 男 性 性 别 有 ｗＩ Ｔ 过
关
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（ Ｐ ２ 基 因 可显 著促 进 多 西 紫 杉 醇 诱 导 的 ＭＣ ７ＡＤ 细 胞 Ｒ Ｎ） Ｆ一 Ｒ 凋亡 。 由 多药 耐 药 基 因 ＭＤ 编 码 的 蛋 白产 物 Ｐ糖 蛋 白 （ — Ｒ１ 一 Ｐ ｇ ） 导 的多 药 耐 药 被 认 为 是 肿 瘤 细 胞 抵 抗 传 统 化 疗 药 物 的 Ｐ介 经典 机 制 ， Ｐ Ｒ Ｎ２基 因沉 默 可 降 低 Ｐｇ —Ｐ糖 基 化 而 导 致 其 膜 定 位 受 阻 ， 而 增 加 ＭＣ ７ＡＤ 细 胞 多 西 紫 杉 醇 的敏 感 性 。体 进 Ｆ一 Ｒ
陈 玉 乐摘 译 贺 大 林 审 校
ＲＮ Ｐ ２基 因促 进 乳 腺癌 多 西 紫 杉 醇 耐 药
Ｒ ＰＮ２ ｅ ｃ ｎ ｅ ｓ ｄｏ ｅ ａ ｅ ｒ ｓ ｓ ａ ｅ ｉ ｂｒ ａ ｔ ｃ ｎｃ ｒ Ｎａ ｇ ｎｅ ｏ ｆ ｒ ｃ ｔ ｘ ｌ ｅ ｉ ｔ ｎｃ ｎ ｅｓ ａ ｅ ． ｔ
多药耐药机制研究及其抑制策略
多药耐药机制研究及其抑制策略多药耐药（Multi-drug resistance, MDR）是指细菌、寄生虫和真菌对多种药物产生的耐药性。
MDR是世界范围内临床治疗的巨大挑战，限制了许多传统抗生素和抗寄生虫药物的有效使用。
在这篇文章中，我们将深入探讨多药耐药的机制及其抑制策略。
多药耐药机制1. 基因突变基因突变是常见的多药耐药机制之一。
细菌、寄生虫和真菌通过突变特定基因的方式来产生对药物的抗性。
突变可以改变靶标蛋白的结构或功能，使得抗生素无法与其结合，从而减弱或完全阻止了药物对细胞的作用。
2. 表达外泌体外泌体是一种纳米级别大小的膜囊泡，可以被细胞释放到外部环境中。
多种细菌通过表达外泌体来排出抗生素分子，破坏了抗生素对宿主细胞的杀伤作用。
此外，外泌体还可以转移耐药基因和耐药质粒，使得耐药性在不同微生物间传播。
3. 上调毒力相关基因一些微生物在受到抗生素威胁时会上调毒力相关基因，以增加其对宿主细胞的侵袭能力和存活能力。
这种策略使得微生物在低浓度抗生素下仍能存活和复制，增加了治疗的难度。
4. 活性泵增强活性泵也是导致多药耐药的重要机制之一。
细菌和寄生虫可以通过增加活性泵的表达来排除外来分子，包括抗生素等有害物质。
这种机制使得微生物能够更有效地清除药物，降低对抗生素等化学物质的敏感性。
多药耐药抑制策略面对多药耐药问题，科学家们致力于开发新的解决方案。
以下列举了一些重要的多药耐药抑制策略。
1. 新型抗菌剂开发针对已知的耐药机制，科学家们致力于开发新型的抗菌剂，以克服已经存在的多药耐药问题。
这些新型抗菌剂可以通过结构优化或设计新颖靶点来克服细菌、寄生虫和真菌对传统抗生素和抗寄生虫药物的耐受性。
2. 绕过耐药机制另一种重要的策略是利用已有知识绕过已知的耐药机制。
例如，在面对基因突变导致的耐药时，可以开发针对其他结构或功能相似但不易被突变所影响的靶标蛋白。
3. 多靶点组合疗法研究证明，同时针对微生物的不同靶标可以显著提高治疗效果并降低出现多药耐药的概率。
乳腺癌新辅助化疗耐药性研究进展
乳腺癌新辅助化疗耐药性研究进展1. 乳腺癌新辅助化疗简介乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，新辅助化疗作为乳腺癌综合治疗的重要组成部分，已经在临床实践中取得了显著的疗效。
新辅助化疗是指在手术之前对乳腺癌患者进行的系统性化疗，旨在缩小肿瘤体积、降低病理分期、评估治疗效果以及指导手术方案的选择。
新辅助化疗的主要目的是通过药物的作用，使癌细胞的生长和扩散受到抑制，从而提高手术切除的成功率和减少复发风险。
随着乳腺癌研究的不断深入，新辅助化疗的药物选择和治疗策略也在不断优化。
常用的新辅助化疗药物包括蒽环类、紫杉醇类、多柔比星类、环磷酰胺等。
这些药物可以通过不同的作用机制，如阻断DNA合成、干扰微管功能、诱导细胞凋亡等，抑制癌细胞的生长和扩散。
针对新辅助化疗耐药性的研究也取得了重要进展，耐药性是指肿瘤细胞在接受化疗药物作用后，出现对药物的抵抗现象，导致化疗疗效降低甚至失效。
新辅助化疗耐药性的产生可能与多种因素有关，如基因突变、信号通路异常、表皮生长因子受体(EGFR)变异等。
研究乳腺癌新辅助化疗耐药性的机制和靶点对于提高治疗效果具有重要意义。
针对新辅助化疗耐药性的研究主要集中在以下几个方面：一是寻找新的耐药靶点，如开发针对耐药性肿瘤的新药物；二是研究耐药性肿瘤的基因表达谱，以便为个体化治疗提供依据；三是探索联合用药策略，以提高化疗药物的疗效和降低耐药性的发生率；四是研究免疫治疗在乳腺癌新辅助化疗耐药性中的作用，以期为患者带来更多的治疗选择。
1.1 定义和作用乳腺癌新辅助化疗耐药性研究进展主要关注在乳腺癌治疗过程中，针对新辅助化疗药物的耐药性进行研究。
新辅助化疗是指在手术切除肿瘤之前，使用药物对肿瘤进行治疗，以缩小肿瘤体积、减轻手术难度、提高手术切除率以及评估患者预后等目的。
耐药性是指肿瘤细胞对化疗药物的抗药性，即化疗药物无法有效杀灭或抑制肿瘤细胞生长的能力。
乳腺癌新辅助化疗耐药性的研究对于提高治疗效果、延长患者生存期具有重要意义。
肿瘤多药耐药模型建立方法的应用进展
高了诱导成功率 ，但此法建立 耐药株周 期长 ，细 物敏 感 性 显 著 降低 的现 象 ，细 胞 中 Ｐ．ｇＰ、ｍｒｐ２ ｍＲ—
胞 的耐 药性 与 培养 时 间呈 正相关 。
’
ＮＡ及 Ｐ．ｇＰ蛋 白表 达增 高 ，成 功 构 建 了具 有 耐 药 表
１．３ 高浓度反复间歇诱 导与药物浓度递增相结合 法 是将高浓度反复间歇诱导法与药物浓度递增法 相结合 的诱 导方法。高爱丽 首先采用逐步加大
为小 鼠和大 鼠，近些 年斑 马鱼因其个体小 、胚胎 透 明、实验周期短，基 因与人类极其相似也广泛用于人 类疾 病模 型 的建 立 ［１ 。胡 荣 英 等 ［驯 利用 长 春 新 碱 暴露 处理 受精 后 的 斑 马鱼 ，结 果 显示 长 春 新 碱 能 增 加班 马鱼 肿瘤 耐 药 基 因 ａｂｃｂ４的 表 达 ，该 模 型 建 立 提示 复制 肿 瘤 ＭＤＲ模 型可 利用 斑 马鱼进 行实 验 。 ２．１ 移植 型肿瘤 ＭＤＲ动 物模 型 为直 接将 耐药 细 胞株或 肿瘤组织 接种到 动物 体 内的方 法 。井 欢等 Ｉ－ 在体外 培养肺腺 癌 耐药 细胞 Ａ５４９／ＤＤＰ，取对 数 生长 期细胞消化制备成悬浮液 ，将其注射手健康 ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠腋下 ，５ ｈ后观察到腋下有米粒突起 ，建模成功 ，
山东 医药 ２０１８年第 ５８卷 第 ７期
· 综 述 ·
肿 瘤 多药 耐 药 模 型 建 立 方 法 的应 用 进 展
汤 婷婷 ，刘华钢 ，梁 燕 ，范 玉琴 。吴余 燕 （１广西中医药大学药学院，南宁 ５３０２９９；２广西医科 大学药学院）
摘要 ：肿瘤 多药耐药 （ＭＤＲ）模型的建立是肿瘤耐药机制 和耐药逆转方法 研究 的前提 。肿 瘤 ＭＤＲ模 型分为体 外和体 内模型 。 目前 ，肿瘤 ＭＤＲ体外模型建立方法主要有 高浓度反 复间歇诱 导法 、药 物浓度 递增诱 导法 、高浓度 反复 间歇诱导 与药物浓度递增相结合法 、转基 因结合药物筛 选法 和三维 细胞培养 法 ，其 中三维细 胞培养 法建立 的 ＭＤＲ模型生物学活性与在体肿瘤更接近且能模拟体 内微环境 ，弥￥ｂＴ其他方法的不足 ，但培养系统较复杂 、实验周 期长 。肿瘤 ＭＤＲ体内模 型主要 通过移植 和诱 导两种方法构建 ，两种方法制作 的 ＭＤＲ动物模型均能保 持动物原有 的组织学构造及原肿瘤 细胞 的各项特性 ，重现原始肿瘤结构 ，模拟体 内微环境 ，反映体 内肿瘤形成情况 。
人肺腺癌紫杉醇耐药细胞株交叉耐药性实验研究
ｓｓａ ｃ ｏ ｔｘ ｔ ｒ ｉｔ ｎ ｅ ｔ ａ ｏ ｅｅ，ｖｎｏｅ ｂ ｎ ｉ ｒｌ ｉ ｅ，ｖ ｎ ｒｓｉ ｅ ａ ｄ ｄｏ ｏｕｂｉｉ Ｉ ｌｏ ｄ ｓ ａ ｅ ｅ ａ ｒｌｗ ｅ ｉｔｎｃ ｏｃａ ｔ ｔ ｃｉ ｎ ｄ ｐ ｌ ｉ ｃ ｉｔｎ ｎ ｘ ｒ ｃｎ． ｔａ ｓ ｉｐｌｙ ｄ ｍ ｄｉｎ ｏ ｏ ｒ ｓｓａ ｅｔ ｍｐ ｏｈｅ ｎｓａ ｄ ｐｏ ｏ ｈｙ— ｌ ｔｘｎｓ Ｎｏ ｃｏ ｓｒ ｓｓａ ｃ ｓｏ ｅ ｖ ｄ ｔ ｎｔ ｕ ｏ ｌｔｎｕ ａ ｄ ａ ｔｍｅ ａ ｏ ｉ ｄ ｕ ｓ ａ ｄ ｅｅ ｅ ｅ ｅ ｏｏ ｉ ． ｒｓ ｅ ｉｔｎ ｅ ｗａ ｂｓ ｒ ｅ ｏ ａ ｉ ｍ ｒ ｐ ａｉ ｍ ｎ ｎ ｉ ｔ ｂ ｌｔ ｒ ｇ ｎ ｌｍ ｎ ｍｕｓｏ ｔ ｅ ｉｎ． Ｃｏ ｌ ｉ Ｓ ｎｃｕｓｏｎ ＰＣ —
ｆｏ ｍｅ ｉｎｉｈｂｔｒ ｏ ｃ ｎｒｔ ｎ（ Ｃ ０）ｗ ｉｈｗａ ｖ ｌａｅ ｙＭＴ ｓａ ．Ｒｅ ｕｔ Ｓ Ｃ—Ａ１ Ｔ ｘ ｌ ｅｌ ｉｅｄｓ ｌｙ ｄｈｇ ｅ ｒｍ ｄａ ｉｉ ｙ ｃｎ ｅ ｔａｉ ｎ ｏ ｏ Ｉ５ ｈｃ ｓｅ ａｕ ｔｄｂ Ｔ ａｓ ｙ ｓ ｌｓ Ｐ ／ ａ ｏ ｌｌ ｉｐａ ｅ ｉｈｒ— ｃ ｎ
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Ｊ ｅＲｓ ｅ２ ８ ｏ３Ｎ． ｄ ｅＤ ０， １７ ｏ ２ Ｍ ， ｃ０ Ｖ ． １
乳腺癌的药物耐药机制研究
乳腺癌的药物耐药机制研究乳腺癌是中老年女性最常见的恶性肿瘤之一，而药物治疗是乳腺癌治疗的重要手段之一。
然而，乳腺癌的耐药性问题一直困扰着医学界，使得部分患者无法获得有效的治疗效果。
为了解决这一问题，科学家们对乳腺癌的药物耐药机制进行了广泛的研究。
近年来，多项研究表明，乳腺癌的药物耐药主要与以下几个机制相关。
1. 靶向药物抵抗性突变：乳腺癌患者常常会被给予靶向治疗药物，如HER2抑制剂或激素受体拮抗剂。
然而，乳腺癌细胞存在着突变的倾向，使得它们对药物的作用产生变异。
这些突变可以导致靶向药物的结合位点发生改变，从而使得药物无法正常与肿瘤细胞结合，丧失治疗效果。
2. 药物外排泵增加：乳腺癌细胞往往通过上调药物外排泵，如P-gp 泵，来主动排出药物，减少药物在细胞内的积累。
这种细胞对药物的主动排出导致了药物浓度降低，使得有效治疗难以实现。
3. DNA修复机制增强：乳腺癌细胞的DNA修复机制是维持其正常生长和功能的一个重要环节。
然而，在药物治疗过程中，这些细胞会通过激活DNA修复途径来修复被药物破坏的DNA，减少药物对其的杀伤作用。
这就造成了药物治疗效果的降低。
4. 转录因子的改变：乳腺癌细胞的转录因子在癌细胞的生长和分化过程中发挥着重要的调节作用。
某些转录因子的改变可以导致乳腺癌细胞对药物的敏感性降低，从而产生耐药性。
针对以上机制，科学家们正在不断努力寻找乳腺癌耐药性的解决方案。
基于对乳腺癌细胞耐药机制的理解，新的药物设计和研发正在不断进行。
例如，研究人员正在致力于设计新型的靶向药物，以克服乳腺癌细胞突变导致的耐药问题。
此外，结合药物外排泵抑制剂的应用也被提出作为一种可行的解决方案。
另外，研究人员还通过抑制DNA修复途径，增加药物对乳腺癌细胞的杀伤作用。
通过抑制转录因子的活性，也有望恢复乳腺癌细胞对药物的敏感性。
这些新的治疗策略为乳腺癌的药物治疗提供了新的希望。
尽管乳腺癌的药物耐药机制研究已经取得了不少进展，但目前仍存在许多挑战。
多药耐药乳腺癌的形成机制研究新进展
多药耐药乳腺癌的形成机制研究新进展摘要】乳腺恶性肿瘤对化疗药物产生耐药性是困扰乳腺癌治疗的难题，影响了化疗的效果，故研究清楚化疗药物多药耐药的产生机制，从而采取相应措施逆转多药耐药的现状已经迫在眉睫。
本文就国内外最新进展作以下综述。
【关键词】乳腺癌多药耐药化疗分子机制【中图分类号】R969 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）07-0348-02据统计，全世界每年有一百多万女性发生乳腺癌，其中近一半患者死亡，并且发病率逐年递增。
肿瘤细胞在药物诱导下，对结构和功能不相关的药物耐药，即多药耐药(MDR) 现象。
1ATP结合盒膜转运蛋白家族与MDRMD R 包括几种转运蛋白：P - 糖蛋白( P - g p )、多药耐药相关蛋白(MRP1 ～ 7) 和乳腺癌耐药蛋白(BCRP/ABCG2)，这些蛋白均属于A T P 结合盒( A B C ) 膜转运蛋白超家族，作为药物排出泵，可以导致胞内的细胞毒药物浓度降低，使肿瘤细胞对多种抗肿瘤药物产生耐药。
1.1 P-gp 的高表达与多药耐药的机制自从1976 年Juliano 等在耐药的中国仓鼠卵巢癌细胞中发现P-gp 以来，人们对P-gp 的研究越来越深入。
P-gp 由人类MDR基因家族中与耐药有关的MDR1 基因编码，在MDR 细胞株中高表达[1]，P-gp 能将细胞内的化疗药物泵出胞外,降低细胞内的有效药物浓度而产生耐药。
研究显示，几乎所有的人类乳腺癌肿瘤细胞均有不同程度的MDR/P-gp 的表达, 那些对化疗不敏感或疗效差的肿瘤往往有较高的P - g p 基因表达[2]。
在P - g p 表达于将近40％的乳腺癌患者身上，经受过化疗的患者P - g p 的表达是未经过化疗患者的1.8 倍[3]，因此，P-gp 高表达和耐药有很大的关系。
1.2 乳腺癌耐药蛋白(BCRP/ABCG2) 机制 1998 年，美国学者报道了从人胎盘组织和耐米托蒽醌的人结肠癌细胞S1-M1-80 中克隆出B C R P 基因，为乳腺癌耐药细胞系中一种新的肿瘤耐药相关蛋白，因而BCRP 又分别被称为ABCP(Placenta specific ATP-binding cassettetransporter) 和MXR(Mitoxantrone resistance transporter)-MRP。
紫杉醇耐药原因
紫杉醇耐药原因
紫杉醇是一种广泛应用于肿瘤治疗的化疗药物。
尽管它在治疗癌症方面具有较高的效果，但一些肿瘤细胞会对紫杉醇产生耐药性，即不再对该药物敏感。
以下是一些可能导致紫杉醇耐药的原因：
1. 细胞内药物排出机制：某些细胞可能表达了多种药物泵，例如P-glycoprotein（P-糖蛋白），这些泵可以将药物从细胞内
排出，减少药物在细胞内的积累。
2. 基因突变：细胞内的基因突变可能导致细胞对紫杉醇的耐药性。
例如，突变可能发生在药物的靶点微管蛋白（如β-tubulin）上，导致药物无法结合或影响其结合效果。
3. 细胞死亡途径异常：紫杉醇主要通过干扰肿瘤细胞的有丝分裂过程诱导细胞死亡。
因此，某些肿瘤细胞可能具有异常的细胞死亡途径，不受紫杉醇的影响。
4. 细胞内修复机制：细胞可能具有有效的DNA修复机制，可
以修复紫杉醇引起的DNA损伤，从而减少药物对细胞的毒性
作用。
5. 其他耐药机制：除上述原因外，还有多种其他机制可能导致细胞对紫杉醇产生耐药，例如细胞信号转导通路的异常、细胞周期调控异常等。
需要指出的是，不同的肿瘤类型和个体之间对紫杉醇的耐药机
制可能有所不同，因此准确确定耐药原因需要进行个体化的研究。
新一代紫杉类抗癌药物——泰索帝(多西紫杉醇ocetaxel)
亡特性的消失。实验资料显示 ．泰素帝 是一种有效的 Ｂ ｌ 磷酸化诱导剂，这 ｃ一 ２
种作 用可 见干浓 度为 １ ０ ，而其 它微管
外，尽管已有报道多药耐药细胞株会导 泰素帝是在ｃ 和ｃ 位置上含有一 ４ ５ 个带有氧 四环的紫杉烷环结构 ，并在
Ｃ 位置上 含 有一个 庞大的 酯倒 链 。在 １ ３ 致 对紫 杉醇 获 得性 耐药 ，但研 究 显示 ，
疗后肿瘤直径明显缩小。３ 例进行 了保
留乳腺的手术 ｌ 例（３ 进行了乳房 ８ ％） ５ 切除及腋窝淋 巴结清扫术 ， 中阳性淋 其 巴结平均数为３ 范围０ ｌ） 个（ 一 ４。由此认 为泰素帝联合蒽环类抗生素可以明显缩
小 原 发性 可 行 手 术 的乳 腺 癌 的瘤 块 体 积 ，同时是 患者 可以 很 好耐受 的化疗方 案。 Ｊ ｉｓ ． ｎ 等对预 后不好的晚期乳 腺癌 Ｂ ｅ
作用的一 个重要机 制。 ｃ－蛋 白是一 种 Ｂｌ ２
泰索帝的用药方案： 以往为一周期，
每日 一次 连 用 ５ 或单药 １ 天； 小时 ．６ 小
体外实验证实 ，泰素帝对多种小鼠
ＰＩ Ｖｏ｝３ ｏ． ． Ｎ ３
凋亡抑制剂，在乳腺癌 、肺癌 ．前列腺
１ ２
６ ・２ＯＯ２
维普资讯
点与临床 资料相吻 合 。
管是 由微管蛋白聚合而成 。微管蛋白则 是由 和 Ｄ 两个多肽亚单位所组成的分 子量为 Ｉ 万ｋ ａ Ｏ Ｄ 的蛋白质。 在微管蛋白 的聚台作用和微管的解聚作用之间存在 动态平衡 泰索帝能加１ 微管蛋白聚合 虫 成微管的速度并延缓微管的解聚作用， 导致形成稳定的非功能性的微管束，从
帝 对 ５Ｆ ．Ｄ Ｐ Ｃ ．ｕ Ｄ 、Ｖ Ｒ或 Ｖ １ 产生获 Ｐ６ 得 性 耐 药 的 多种 细胞 株 无 耐 药 性 。此
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人乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞株的建立及特性李文静1，张磊2，赖娅娜2，唐金海3，钟山亮1，恽文3，赵建华1(210009 江苏南京，南京医科大学附属省肿瘤医院临床检验中心1、科研科第三实验室2和普外科3)[摘要] 目的建立人乳腺癌多西紫杉醇（Docetaxel，Doc）耐药细胞模型MCF-7/Doc，初步探讨其生物学特性。
方法采用Doc低浓度逐步加量诱导法建立MCF-7/Doc耐药株；通过细胞形态学观察、生长曲线和群体倍增时间测定、MTT 法药物敏感试验及流式细胞术评价其生物学特性；实时荧光定量PCR和Western blot分别检测多药耐药基因MDR1 mRNA和蛋白的表达。
结果经10个月的诱导成功建立MCF-7/Doc细胞株，可在100 ng/ml Doc培养液中稳定生长，耐药指数为亲代敏感细胞MCF-7/S的33.3倍，对其他多种化疗药物呈交叉耐药状态。
光镜下，药物处理后细胞变圆变小、核分裂像减少；MCF-7/Doc倍增时间较MCF-7/S延长（41.6h vs 30.6h；P<0.01）。
与亲代相比，耐药细胞处于G1期和G2期的细胞增加、S期减少；MDR1基因表达水平增高90.7倍，蛋白表达转为阳性，而雌激素受体阳性表达丢失。
结论MCF-7/Doc细胞具有典型的多药耐药性，MDR1基因和蛋白过表达是其获得性耐药的主要机制之一。
[关键词] 乳腺癌细胞；多西紫杉醇；多药耐药；P糖蛋白[中图分类号] R737.9乳腺癌属全身性疾病，综合治疗非常关键，其中化疗是不可替代的重要手段之一；然而多药耐药（multi-drug resistance, MDR）常导致治疗失败以及后期肿瘤的复发和转移，严重威胁患者生存。
多西紫杉醇（Doc）是在天然抗肿瘤药物紫杉醇的基础上，经结构修饰后获得的一种新型抗肿瘤药物，溶解性好，药效更优。
临床实践表明，以Doc为主的联合化疗是乳腺癌、尤其是淋巴结阳性患者最有希望的治疗方案[1]，但耐药问题也不容忽视，据报道其对转移性乳腺癌的治疗反应率为[基金项目]江苏省社会发展科技计划项目（BS），国家自然科学基金资助项目（）第一作者：李文静，女，硕士研究生，主要方向：临床检验诊断学，电话：，E-mail：通讯作者：赵建华，女，硕士生导师，研究员，主要从事临床检验诊断学及肿瘤学研究：电话：, E-mail：30-50%[2]。
已知耐药细胞株是研究肿瘤MDR发生和逆转的重要模型，国内外报道现已建立多种乳腺癌耐药细胞株，但关于Doc乳腺癌耐药细胞株的建立国内还未见报道。
为此，本文通过低剂量逐步加量法体外诱导建立人乳腺癌多西紫杉醇耐药株，并对其生物学及耐药特性进行了初步研究。
1 材料和方法1.1 材料乳腺癌细胞株MCF-7/S为典型的雌激素受体（ER）阳性细胞株，分离自人乳腺腺癌组织上皮（上海细胞生物所）；Doc、顺铂和卡铂(齐鲁制药)，紫杉醇(太极制药)、多柔比星(海正药业)、吉西他滨(豪森药业)、他莫昔芬(扬子江药业)、甲氨蝶呤和依托泊苷(恒瑞医药)、羟喜树碱(李时珍药业)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma)；鼠抗人P-gp单克隆抗体(ABcam)；辣根过氧化物酶（HRP）标记抗小鼠IgG (康为生物) 、HRP标记抗兔IgG（博士德生物）。
1.2 细胞培养MCF-7/S细胞培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml 链霉素的DMEM高糖培养液, 在37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养，经2-3次传代后至指数生长期进行实验。
1.3 MCF-7/Doc的建立首先测定Doc对MCF-7/S的半数致死浓度(IC50)；以IC50的1/1000 Doc为起始浓度作用MCF-7/S细胞24h，生理盐水洗五遍，撤药常规培养并每天换液去除死细胞，约7-18天后存活细胞生长恢复，待进入对数生长期后传代1次，继续培养至生长良好且稳定时进行浓度逐步递增性诱导（梯度为10 ng/ml）；如此反复，历时10个月，直至细胞能在100 ng/ml Doc培养液中稳定地传代生长。
双目倒置显微镜下观察各时段细胞的生长情况。
1.4 生长曲线测定将对数期MCF-7/S和MCF-7/Doc细胞经胰酶消化后制成2×104单细胞悬液，接种于24孔板，接种后第1～5天计数，每次计数3孔取平均值，绘制生长曲线。
按Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间：T d=Tlg2/lg(N T/N0)，T d为倍增时间(h)，T为细胞数由N0增至N T所用的时间，N为细胞数。
1.5 细胞IC50及耐药指数RI的检测1.5.1MCF-7对Doc的敏感性取1×105/ml MCF-7/S或MCF-7/Doc单细胞悬液，接种于96孔板，100μl/孔；培养24h后加入含相应浓度药物的培养液100μl/孔，每个药物浓度设4个复孔，同时设空白组和无药对照组；继续培养48 h，MTT法染色，CliniBio128 酶标仪检测550 nm处的吸光度（A）值，计算生长抑制率：生长抑制率= 1-(实验组平均吸光值/对照组平均吸光值)×100%；根据生长抑制率计算IC50[3] 和RI ，RI= IC50（MCF-7/Doc）/ IC50（MCF-7/S）。
独立重复3次。
1.5.2交叉耐药性按上述方法分别检测MCF-7/S和MCF-7/Doc细胞对常规化疗药物：紫杉醇、表柔比星、甲氨蝶呤、羟喜树碱、卡铂、顺铂、依托泊苷、吉西他滨及内分泌治疗药物他莫西芬的IC50，计算各RI。
1.6 细胞周期分布取对数期细胞消化制成单细胞悬液，1ml预冷70%酒精固定，-20℃过夜，PBS洗两次，碘化丙啶（PI）避光染30分钟，以流式细胞仪（美国BD FACSCalibur）于FLA-2参数下检测细胞周期，定量分析各时期的百分率及凋亡、坏死细胞的百分率。
独立重复3次。
1.7 MDR1基因相对定量使用TRIZOL法，提取细胞总RNA，测A260/A280值（NanoDrop2000）并计算其纯度和RNA含量；按BU-Script RT KIT说明，逆转录合成cDNA。
取2µl cDNA作为模板进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR；BIO-RAD iCycle扩增仪）。
MDR1引物：上游GTTGCTGCTTACATTCAGGTTTC和下游ACCAGCCTATCTCCTGTCGC，Taqman探针：TTGGTGCCTGGCAGCTGGAAGAC；β-actin引物：上游ACCGAGCGCGGCTACAG和下游CTTAATGTCACGCAGATTTCC，探针：TTCACCACCACGGCCGAGC。
以2-ΔΔCt计算MDR1 mRNA的相对表达量。
1.8 Western Blot检测P-gp和ER的表达蛋白上样量80µg，100V电泳2h；300mA 湿转2h；室温封闭1h；P-gp鼠单抗（1:500）、ER兔单抗(1:200)、β-actin鼠单抗(1:5000) 4℃过夜；HRP标记抗鼠二抗（1:2000）、HRP标记抗兔二抗（1:9000）室温1h；ECL液暗室发光显影。
1.9统计学分析采用SPSS16.0统计软件作t检验和单因素方差分析。
2结果2.1 细胞形态学观察光镜下，上皮来源的MCF-7/S细胞贴壁生长，呈长梭形或多角形、排列均匀，可见较多分裂像细胞。
加入Doc 24h后，细胞发生明显改变，胞体变圆变小，折光性增强，分裂像细胞数明显减少，且敏感细胞不断死亡，需数次换液不断清除死细胞，最后仅存少数贴壁细胞。
这些细胞不规则突起增多，胞体变大，空泡增多，继续培养中仍会有少量细胞崩解死亡，但随着撤药时间的延长，存活细胞最终可恢复原来形态并成团生长（图1）。
2.2 细胞生长曲线 MCF-7/S 和MCF-7/Doc 细胞的倍增时间分别为30.6±1.11h 、41.6±1.58h ，后者是前者的1.36倍，增殖速度明显减慢（t =﹣9.797，P =0.001；图2)。
2.3 细胞的耐药特性 与MCF-7/S 相比，MCF-7/Doc 不仅对Doc 有较高的耐药性，对其他多种药物也存在不同程度的交叉耐药性；其中对甲氨蝶呤、羟喜树碱有强的耐药，对紫杉醇、表柔比星、吉西他滨有较强耐药，对他莫西芬有轻度耐药，而对卡铂、顺铂及依托泊苷无明显耐药性（表1）。
表1 MCF-7/S 和MCF-7/Doc 细胞的药物敏感性细胞生长曲线5010015020012345培养时间(天)细胞数/1000MCF-7/S MCF-7/Doca . MCF-7/Sb . 加药24小时后 f . 20天左右完全恢复c . 撤药3-5天d . 撤药7-10天e . 撤药15天左右 图1 多西紫杉醇作用前、后及细胞恢复的全过程(放大倍数10×10)药物IC50/mg·L-1RI MCF-7/S MCF-7/Doc多西紫杉醇 2.49±0.87 82.89±5.21 33.29 紫杉醇0.39±0.13 7.80±2.07 20.00表柔比星0.86±0.24 18.37±0.98 21.36甲氨蝶呤0.02±0.01 3.71±0.99 185.35羟喜树碱0.14±0.03 44.33±2.60 310.00卡铂39.57±6.36 43.67±2.36 1.10顺铂 4.57±0.94 4.63±0.84 1.01 依托泊苷11.25±1.26 14.69±1.97 1.31吉西他滨0.32±0.08 7.27±1.84 22.72他莫西芬 5.03±0.11 14.87±2.03 2.962.4 细胞周期流式细胞仪结果显示，与MCF-7/S相比，MCF-7/Doc处于G0/G1期细胞增加、S期细胞减少、G2/M期细胞增加（表2、图3）。
表2MCF-7/S和MCF-7/Doc细胞的周期分布细胞类型细胞周期(%)G0/G1S G2/M MCF-7/S 54.19±1.14 41.02±6.37 1.57±0.34MCF-7/Doc 68.87±6.44 25.67±7.67 5.46±2.672.5 MDR1基因和P-gp 、ER 蛋白的表达 RT-qPCR 结果显示，MCF-7/Doc 细胞MDR1 mRNA 表达水平是MCF-7/S 的90.66±6.28倍（F =611.445，P <0.001）。