抗人CD40 mAb 5H6的 125I标记及其与卵巢癌细胞株HO8910体外结合的生物学特性
Rho的生物学功能及其在肿瘤发生中的病理学意义_百替生物
Rho的生物学功能及其在肿瘤发生中的病理学意义罗齐平综述（湖南中医药大学中西医结合学院湖南长沙410007）摘要:Rho家族成员及其各自的已知下游效应分子参与调节肿瘤细胞相关基因的表达及细胞增殖活性，调控细胞骨架组装、细胞迁徙运动等细胞生物力学机制，涉及肿瘤细胞的浸润和转移过程。
在多种实体瘤中，如胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、直结肠癌等，都可检测到Rho家族成员Racl、RhoA、Cdc42中的一种或多种蛋白质的表达上调与活性升高。
该类蛋白成分为一种新的肿瘤标志物，可以应用于病变良恶性的判断，并有助于评估肿瘤转移能力及患者预后。
关键词: Rho；肿瘤细胞；肿瘤转移；生物力学机制Rho家族蛋白质是Ras超家族成员中小分子量G蛋白构成之一，是一组分子量为20 KD ~ 30 KD的鸟苷酸结合蛋白，具有GTP酶活性。
1985年，Rho作为Ras同源物(Rashomologue)首先被克隆出来，称Ras相关单体GTP酶[1]，主要有Rho（包括Rho A、B和C）、Rac（Rac 1、2和3）和cdc42（cdc42Hs，G25K）3个亚家族，在细胞信号传导中具有重要的功能。
一般认为，Ras 家族调控细胞分裂和增殖，而在细胞变形、运动和游走调控中，Rho 家族是起开关作用的最重要的分子[2]。
以往有关Rho家族的研究主要集中在白细胞运动游走方面，近年来研究发现，Rho 家族成员在多种肿瘤组织的表达增加[3]，提示其可能成为一种新的肿瘤标志物，可以应用于判断良恶性及判断肿瘤转移能力及估计预后，具有潜在的重要临床价值[4]。
1. Rho的调控因子和效应分子异常活化的RhoA能启动细胞的无限增殖、肿瘤细胞的浸润和转移特征。
最近研究已证实，RhoA在肿瘤发生发展过程中有重要作用，如其参与细胞恶性转化、浸润转移和血管发生[5]等效应有关。
它的这些作用，是通过一系列的调控因子和效应分子来实现的。
1.1 Rho的上游调控因子在细胞内，Rho蛋白家族通过与GTP结合的激活型和与GDP结合的失活型两者之间的转换，执行其分子开关功能。
免疫组化常用标记物
免疫组化常用标记物免疫组化常用标记物一、常用标志物1. CD15(LeuM1)---（阳性部位：细胞膜）。
是一种由半乳糖、岩藻糖和N-乙酰葡萄糖组成的碳水化合物抗原，又称半抗原χ，是粒/单核细胞相关抗原。
免疫组织化学表达：成熟粒细胞、激活的淋巴细胞（主要是T淋巴细胞）、R-S细胞、大多数腺癌等。
2. 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）(CD66e)---（阳性部位：细胞膜/浆）。
癌胚抗原是表达于胎儿上皮细胞的一种糖蛋白，分子量为180kDa。
存于某些恶性肿瘤组织尤其是内胚层来源发肿瘤中，大多数胃肠道（包括胰腺）和肺腺癌均有表达，少量成人上皮细胞和良性肿瘤亦可表达。
CEA主要用于标记上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌。
3.嗜铬素A（chromogranin A，CgA）---（阳性部位：细胞浆）。
嗜铬素是位于神经分泌颗粒内的酸性糖蛋白家族，是一组可溶性酸性蛋白，分子量为76～1 20 kDa，分布广泛。
含量最丰富的是嗜铬素A，另两个是嗜铬素B和嗜铬素C。
几乎所有的神经内分泌肿瘤中均可检测到嗜铬素。
嗜铬素A不仅存在于神经内分泌细胞的分泌颗粒中，也广泛分布于所有含有颗粒的内分泌细胞和神经内分泌细胞来源的肿瘤细胞。
此抗体可以识别嗜铬素A抗原羧基末端的片段，而不与氨基末端的片段反应，主要用于标记神经内分泌细胞及其来源的肿瘤。
对小细胞癌进行抗原修复可提高检测的敏感性。
4.细胞角蛋白（cytokeratin pan，广谱CK）--- AE1/ AE3（阳性部位：细胞浆）。
此抗体可以识别绝大部分酸性细胞角蛋白（Ⅰ型/低分子量）和碱性细胞角蛋白（Ⅱ型/高分子量）。
用于标记上皮及上皮来源的肿瘤，特别是对鉴别和判断转移性肿瘤是否为上皮源性具有一定的意义。
5.细胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）---（阳性部位：细胞浆）。
在正常组织中，鳞状上皮和导管上皮的基底细胞以及部分的鳞状上皮生发层细胞、肌上皮细胞和间皮细胞阳性，腺上皮细胞阴性。
CD16单抗_CD16单克隆抗体_CD16使用说明
GMP级抗人CD16单克隆抗体（无色透明液体）Humanized anti-human CD16 monoclonal antibody作用机理：细胞 CD16 即FcγR Ⅲ , 为分子量为 50 000 ～ 70 000 的糖蛋白, 属 Ig 超家族成员，已知参与抗体依赖性的细胞毒性（ADCC）作用，其最显著的特征在于膜受体负责触发的裂解是由 NK 细胞完成的。
CD16 作为低亲和力受体对于一些 IgG 的 Fc 部分，与CD3ζ的Fcε关联受体 I（Fc 的εRI）γ链结合，共同参与信号转导。
NK 细胞上交联的 CD16 直接导致细胞内 Ca+ 水平的增加和一系列的类似于 T 细胞受体激活的级联生化反应。
据相关文献，CD16 对人 NK 细胞作为裂解受体介导直接杀伤某些病毒感染和肿瘤细胞的过程，是依赖于抗体的紧密结合来实现的。
CD16 分子广泛表达于 NK 细胞、嗜中性多形核白细胞、单个核细胞和巨噬细胞中，其单克隆抗体可激活 NK 细胞抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用。
规格参数：货号：TL-201 规格：500ug产品信息：表达宿主：CHO细胞浓度：1mg/mL纯度：>98%内毒素：<2EU/mg纯化方式：ProteinA 亲和层析性状：无色透明液体保存温度：2-8℃有效期：24 个月生产厂家：北京同立海源生物使用说明：如分装，建议置于-20℃～-80℃保存，避免反复冻融适用范围：用于 NK 细胞激活扩增，适用于直肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌等多种肿瘤的细胞免疫治疗临床研究。
抗体标记技术汇总
第1章抗体分子标记技术第一节抗体的I125标记法基本原理有多种方法可用于蛋白质的碘标记，如应用化学法或酶促法通过氧化对蛋白质分子进行碘化是常用的方法。
当应用化学氧化法时，碘化钠（NaI）遇强氧化剂，碘离子被氧化为碘分子，所生成的自由碘分子可与某些基团进行卤化反应。
蛋白质分子可进行卤化反应的基团主要为酪氨酸残基，某些组氨酸残基也可能进行碘化。
在应用氯胺T(Chloramine T)法的实验中，所用的氧化剂（1，3，4，6-tetrachloro-3α, 6α-diphenyl-glucoluril）是溶于强挥发性的有机溶剂中。
该溶剂加入试管后，先让其挥发（即让氧化剂将试管包被），然后把Na125I和蛋白质液加入包被好的试管中，反应完成即将混合液移入他管，以终止反应。
试剂及仪器●经亲和层析纯化的多克隆抗体或单克隆抗体●0.5 mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.5 (配法见附录1)●无载体的Na125I 3.7GBq/ml ( 100 mCi/ml ) 的NaOH液●凝胶过滤柱●γ-记数器●100g/L 三氯醋酸●70% 乙醇●玻璃纤维滤●氯胺T (Chloramine T)反应用* 新鲜制备的含2mg/ml氯络胺T的 0.5 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.5）；* 氯胺T 反应终止缓冲液： 2.4mg/ml 偏重亚硫酸， 10mg/ml 酪氨酸, 10%甘油, 1g/L Xyene cyanol 的PBS 液。
操作步骤*注意：125I 对健康有害，需要保护措施。
在应用125I 应先有关同位素知识，及在有关部门的监测下，按放射线同位素的应用及处置要求进行。
（一）氯胺T法1．用1.5ml Ependof 管，加10μl 抗体及pH 7.5的0.5 mol/L磷酸钠缓冲液总体积至25μl；2．加500 μCi 的Na125I ，混匀；3．加25μl 2mg/ml 氯胺T液，混匀；4．在室温下培养1分钟；5．加入50μl氯胺T 反应终止缓冲液（以饱和的酪氨酸来捕获游离的 Na125I）；6．通过凝胶过滤层析分离将碘化抗体与碘化酪氨酸分离。
CA125
肿瘤相关抗原125 TM II电化学发光检测试剂盒说明书Elecsys CA 125 TM IIElecsys® Systems 1010/2010/MODULAR ANALYTICS E170 11776223 100 人份【名称】通用名：肿瘤相关抗原125 II TM电化学发光检测试剂盒英文名： Elecsys CA 125 II TM汉语拼音：Zhong liu xiang guan kang yuan 125 II dian hua xue fa guang jian ce shiji he【注意事项】【使用目的】用免疫学方法定量测定人血清或血浆中的OC125抗原。
检测结果与原发上皮浸润性卵巢癌（除外低恶性癌症）患者血清或血浆中高分子量糖蛋白相关。
Elecsys CA125II可用于经过一期治疗后随访病人体内残余或复发的卵巢癌细胞的检测。
也可进一步用于癌症患者的动态测定，以指导治疗。
电化学发光免疫测定试剂，适用于罗氏Elecsys1010、2010和E170（Elecsys模块）免疫测定分析仪。
【概述】CA125属杂种细胞家族的肿瘤标志物，其测定值由使用单克隆抗体OC125来决定。
抗原决定簇CA125位于来自于细胞培养或血清的高分子量糖蛋白分离株，具有含糖链的蛋白结构1。
Mab OC 125 由经OVCA 433 （卵巢来源的腺癌细胞）免疫的鼠的淋巴细胞中获得2。
在Elecsys测定法中，OC 125 单克隆抗体被用作检测抗体。
另一种单克隆抗体M 11用作捕获抗体。
未发现上皮来源的非粘液性卵巢肿瘤中CA125表达率很高3，可在血清中检测到4.5。
正常人的卵巢上皮表面不表达CA125（成人和胎儿）。
妇产科肿瘤中有20％为卵巢肿瘤，发生率15/100,0006。
CA125发现存在于羊膜和体腔上皮中，这些组织是存在于胎儿的器官中。
成人器官组织中，发现CA125存在于输卵管上皮、子宫内膜、子宫颈内7。
北京四正柏生物 Mouse Anti-Human CD4 APC 标记抗体 说明书
相关介绍：4A T4识别55 kDa 的人CD4分子。
80-95%正常胸腺细胞、28-58%外周血T 淋巴细胞（Th/i 细胞）、85-90%外周血单核细胞表达此分子；此外，组织巨噬细胞也有低水平表达。
CD4分子是MHC II 类限制性抗原介导的T 细胞活化过程中的共受体，也是HIV 逆转录病毒的第一受体。
它在调节T-B 淋巴细胞间黏附和胸腺分化的过程中起重要作用。
4A T4 和COD4识别CD4分子的不同表位。
CD4抗体是研究人胸腺分化和免疫应答的重要工具。
此克隆与非人灵长类动物有交叉反应。
储存条件： 2-8℃避光保存,勿冰冻。
克隆名称： 4A T4抗体亚型: Mouse IgG2b标记荧光： APC使用规格： 10μl / Test 用于100 μl 外周血或者106个细胞缓 冲 液： 0.01M PBS, pH 7.4, 0.2%(w/v) BSA, 0.09%(w/v) NaN 3应用范围： FCM IF实验方法（全血样本流式检测）1. 取100 μl EDTA 抗凝的人外周血加入5 ml 流式管底;2. 取10 μl 标记抗体加入流式管底与全血混匀,室温避光孵育20分钟;3. 加入2ml 1×红细胞裂解液混匀后避光放置10分钟,溶解红细胞(推荐: 4A Biotech Lysing Solution[10×],Cat. :FXP001);4. 将样品管置离心机中以1000 rpm 离心5分钟后弃上清;5. 加入2 ml PBS 洗液(Cat.:FXP005)重悬细胞，1000 rpm 离心5分钟,弃上清;6. 加入0.5 ml PBS 洗液重悬细胞,待流式细胞仪检测(样品应在当天上机测定,也可加固定液4℃保存过夜测定).[PBS 洗液:PBS+1%FBS+0.1%NaN 3；Cat.:FXP005][细胞固定液:2%甲醛溶液]注意事项1. 加入外周血时勿将血液触及到流式管壁，否则请用棉棒擦干净;2. 红细胞裂解液使用前应平衡至室温后方可使用(见红细胞裂解液说明书);3. 若样品不能及时上机分析,请及时固定;4. 此产品仅供研究，不用于临床诊断Mouse Anti-Human CD4APC 标记抗体目录号 规格FHA004-100 100 TestsFHA004-050 50 Tests流式参考图正常人外周血淋巴细胞用4AT4-APC染色分析图.参考资料1. Ledbetter, J et al. (1981) J Exp Med 153:310-323.2. Haynes , B et al. (1986) Leukocyte Typing II: Human T lymphocytes. New York: Sprimger-V erlag; 3-30.3. Clevers H et al. (1988). Ann Rev Immunol 6 : 629-662.4. Barclay, N et al. (1993). The Leucocyte Factsbook. Academic Press. San Diego.相关产品：目录号产品名称应用范围FHU004 Mouse Anti-Human CD4/纯化抗体FCM IFFHF004 Mouse Anti-Human CD4/FITC标记抗体FCM IFFHP004 Mouse Anti-Human CD4/PE标记抗体FCM IFFHC004 Mouse Anti-Human CD4/PE-Cy5标记抗体FCM IF。
肿瘤标志物检验
肿瘤标志物检验一、糖类抗原125 检验1．英文或缩写：Cancer Antigen 125，CA-125。
2．标本采集：空腹静脉血2ml，置普通试管送检。
3．正常参考值：0-35 U/ml。
4．临床意义：CA-125 属肿瘤标志物，正常人的卵巢上皮表面不表达CA-125，但在上皮来源的非粘液性卵巢肿瘤CA-125 表达率很高，并可在血清中检测到。
上皮性卵巢癌(尤其是浆液性腺癌)阳性率可达80%以上。
除可见于卵巢癌患者外，还可见于子宫颈癌、乳腺癌，阳性率约为83%，而子宫颈磷状细胞癌阳性率仅为7.1%，子宫内膜癌CA-125升高的阳性率约为48%。
胃肠道癌和其他非妇科恶性肿瘤阳性率约为22%。
各种恶性肿瘤引起的腹水也可见CA-125 升高。
CA-125 升高也可见于多种妇科良性疾病，如女性盆腔炎、子宫内膜异位症、卵巢囊肿、宫颈炎及子宫肌瘤等。
轻度升高可见于妊娠早期和其它良性疾病，如急、慢性胰腺炎、胃肠道疾病、肾功能衰竭、自身免疫病等。
明显升高也可见于肝硬化、肝炎。
5．注意事项：尽管CA-125 是非特异的指标，不能作为直接诊断肿瘤的依据，却是迄今为止用于监测卵巢癌患者治疗效果、观察疾病发展的重要指标，有资料表明，CA-125 的浓度与瘤体大小有直接关系。
CA-125 也可作为观察治疗效果和判断预后的指标。
治疗有效，CA-125 水平下降；若肿瘤复发，CA-125 可先于临床指征几个月升高。
有时术后CA-125 浓度恢复至正常也不能排除有残余肿瘤存在的可能性。
二、糖类抗原15-3 检验1．英文或缩写：Cancer Antigen 15-3，CA15-3。
2．标本采集：空腹静脉血2ml，置普通试管送检。
3．正常参考值：0-31.3 U/ml。
4．临床意义：CA15-3 的抗原决定簇存在于一种称为MAM-6 的糖蛋白分子上，该种抗原属于唾液酸化的糖蛋白亚类，又称多态性上皮粘蛋白(PEM)，正常情况下，PEM 只存在于腺体细胞腔的分泌物中，不出现在血循环中。
抗CD52人源化单克隆抗体项目简介
抗CD52人源化单克隆抗体项目简介 简介：阿仑单抗Campath(Alemtuzumab，欧洲商品名:MabCampath)于2013年和2014年分别获得EMBA和FDA批准用于多发性硬化症（MS）。
国内目前临床药物仅有干扰素类药物，如利比（干扰素β），疗效普通，难以遏制MS的发展。
阿仑单抗相对于利比效果显著，相对于其他疗效好的单抗药品理论上安全性更佳。
目前国内仅有一家阿仑单抗的药物申报，且申报时间已超过十年，申报适应症为白血病。
本项目的阿仑单抗目前已完成三批次临床药品生产，在国内申报时间优势明显，预计一年内完成一期临床审批。
预计上市后就有5亿销售额，全球MS药品市场有250亿美元，未来的潜力巨大。
一、背景CD52 表达于所有B细胞、T细胞、NK细胞、多数单核巨噬细胞、部分粒细胞表面，而红细胞和造血干细胞不表达，皮肤细胞和男性生殖器细胞也表达CD52。
对类风湿关节炎患者的一用长达20年的随访数据显示，使用阿仑单抗后不改变患者的免疫应答，仅仅改变患者的免疫状态，因此感染风险相对较小，显示其卓越的安全性。
阿仑单抗Campath(Alemtuzumab，欧洲商品名:MabCampath)是利用基因重组及单克隆抗体技术生产的人源化抗细胞表面CD52抗原的单克隆抗体，由赛诺菲旗下健赞（Genzyme）开发。
目前国外已经批准的适应症有两种：2001年FDA 批准用于慢性淋巴细胞白血病；2013年和2014年分别获得EMBA和FDA批准用于多发性硬化症（MS）。
同时阿仑单抗对一些自身免疫病中也有使用，如类风湿关节炎。
此外，临床应用还包括实体器官移植及骨髓移植后移植抗宿主病（GVHD）等。
目前公司计划以biosimilar申报多发性硬化症作为CD52的申报适应症，后续上市后申报慢性淋巴细胞胞血病，以及类风湿关节炎等其他自身免疫系统疾病。
二、阿仑单抗在治疗多发性硬化症的优势2.1国内无阿仑单抗申报多发性硬化症的竞争者药品名称企业名称最新申请事项申请号申请时间状态重组抗CD52人源化单克隆抗体注射液浙江海正药业股份有限公司|海正药业(杭州)有限公司申请临床已发批件CXSL14000912014年9月10日重组抗CD52人源化单克隆抗体注射液上海张江生物技术有限公司申请临床已发批件CXSL05000392005年4月29日目前张江生物和海正药业，均以慢性B淋巴细胞白血病为适应症申报，其中海正药业已经撤回，张江生物已经转让给安徽未名生物医药有限公司。
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抗人CD40 mAb 5H6的125I标记及其与卵巢癌细胞株HO8910体外结合的生物学特性（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：罗先富, 章斌, 马泓冰, 汤琳, 周璇, 徐颖, 吴翼伟, 张学光【摘要】目的: 研究抗人CD40单克隆抗体（mAb）5H6的125I 标记及与卵巢癌细胞株HO8910体外结合的生物学特性。
方法: 氯氨T法125I标记mAb 5H6(125I5H6), 纸层析法测定125I5H6的标记率和放射化学纯度, 三氯醋酸沉淀法分析125I5H6体外稳定性, 细胞结合饱和实验进行Scatchard分析, lindmo法及其改良方法计算125I5H6的免疫活性分数, 细胞结合实验分析125I5H6同HO8910细胞的内化和滞留。
结果: (1)mAb 5H6的125I标记率为（85.4±5.2）％, 放射化学纯度为(99.2±0.5)%。
(2)125I5H6存放于4℃磷酸缓冲液中7 d后其放射化学纯度为(80.3±4.7)%, 在37℃血浆中存放24 h后其放射化学纯度为(95.3±0.8)%。
(3) 125I5H6与HO8910细胞亲和力Kd=(0.711±0.06) nmol/L, 最大结合位点数(Bmax)=(2.17±0.08）×105个/细胞。
(4)125I5H6免疫活性分数达(38.6±5.4)%。
(5)4℃ 2 h 125I5H6同HO8910细胞滞留率为(89.8±6.0)%, 37℃ 2 h 125I5H6同HO8910细胞内化率达(54.9±2.6)%。
结论: 氯氨T法进行125I5H6标记具有良好的标记率和放射化学纯度, 以及良好的体外稳定性和较高的免疫活性分数, 且125I5H6与HO8910细胞具有很高的亲和力, 可用于动物体内实验。
【关键词】 125I标记氯氨 T法 CD40 卵巢肿瘤单克隆抗体［Abstract］AIM: To prepare iodine125 labeled anti human CD40 monoclonal antibody 5H6 (125I5H6) and investigate the binding properties of 125I5H6 to HO8910 cells in vitro. METHODS: The mAb 5H6 was labeled with Na125I using chloramine T method. The labeling efficiency and radiochemical purity of 125I5H6 were measured by paper chromatography. The stability of 125I5H6 in vitro was monitored by trichloroacetic acid (TCA) precipitation. The dissociation constant (Kd) of 125I5H6 from HO8910 cells and the numbers of maximum binding sites (Bmax) were obtained by Scatchard analysis. Immunoreactivity of 125I5H6 to HO8910 cells was determined by “Lindmo” assay and its improved method. Internalization and retention of 125I 5H6 by HO8910 cells were studied by cell binding experiments. RESULTS: (1)The labeling efficiency of 125I5H6 was （85.4±5.2）% and itsradiochemical purity was (99.2±0.5)% . (2)Radiochemical purity of 125I5H6 was (80.3±4.7)% after 7 days in 4℃ PB (phosphate buffer) and (95.3±0.8)% after 24 hours in 37℃plasma. (3)At 4℃, Kd for 125I5H6 to HO8910 cells was (0.711±0.06) nmol/L and Bmax was （2.17±0.08）×105 sites/cell.(4)Immunoreactivity of 125I5H6 was (38.6± 5.4)%.(5)Retention rate of 125I5H6 with HO8910 cells was (89.8±6.0)% after 2 hours at 4℃and internalization rate of 125I5H6 by HO8910 cells was (54.9±2.6)％ after 2 hours at 37℃. CONCLUSION: 125I5H6 possesses good labeling efficiency and perfect radiochemical purity. 125I5H6 has suitable stability in vitro and its immunoreactivity was not low. The high affinity of 125I5H6 with HO8910 cells will benefit further animal study in vivo.［Keywords］iodine125 labeling; chloramine T method; CD40; ovary tumor; monoclonal antibody卵巢癌的死亡率高居妇科恶性肿瘤之首, 虽然经过传统的手术、化疗和放射治疗, 病情可获缓解, 但复发率高, 上皮性卵巢癌的总体5年存活率仅30％, 且卵巢癌患者晚期生存质量很差［1］。
近年卵巢癌的免疫治疗成为备受关注的一种新的辅助治疗方法, 采用肿瘤特异性或者相关抗体对卵巢癌进行放射免疫诊断和治疗逐步成为一种新的方法［2］。
CD40分子属于TNF受体超家族成员, 主要表达在B细胞、树突状细胞（DC）、上皮细胞以及一些肿瘤细胞上。
业已表明, 卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌等肿瘤细胞株和新鲜肿瘤组织都表达CD40分子, 而通过单克隆抗体（mAb）激发CD40分子不仅可以直接作用于肿瘤细胞, 其介导的信号还可在多个环节影响肿瘤发生、发展［3］。
本所研制的mAb 5H6是鼠抗人CD40新位点mAb, 我们采用氯氨T法进行125I 标记mAb 5H6(125I5H6), 获得了高放射化学纯度、良好体外稳定性和较高免疫活性分数的125I5H6, 为不同放射性碘标记mAb 5H6以及建立放射免疫显像和靶向治疗方法奠定了初步实验基础。
1 材料和方法1.1 材料卵巢癌细胞株HO8910、人血管内皮细胞株Eahy926 (中国科学院上海细胞研究所) 由本所保存; 鼠源性抗人CD40 mAb 5H6（IgG1）、 5C11（IgG1）均为本所研制。
RPMI1640 培养基（GIBCO 公司, 美国）, 无还原剂Na125I （成都中核高通同位素股份有限公司）, 氯氨T（Sigma公司, 美国）, 偏重亚硫酸钠（Fluka公司, 德国）, Sephadex G25(GE公司, 美国), 其他化学试剂均为国产分析纯试剂。
CO2培养箱, 离心机(Jouan 公司, 法国), 倒置显微镜(Olympus 公司, 日本), 流式细胞仪(Beckman Coulter公司, 美国), CRC15R型放射性核素活度计(CAPINTEC公司, 美国), SN695B型放免γ测量仪（上海核所日环光电仪器有限公司）。
1．2 方法1.2.1 mAb 5H6与HO8910细胞特异性结合的检测将细胞HO8910及对照细胞Eahy926调至5×109/L, 分别取100 μL同2 μg 5H6或5C11, 4℃孵育45 min, PBS洗2次, 加入PE羊抗鼠二抗, 4℃孵育45 min, PBS洗2次, 悬浮于0.5 mL PBS中, 进行流式细胞术分析。
1.2.2 mAb 5H6的125I标记及纯化采用氯氨T法［4］对mAb 5H6进行 125I标记: 分取70 μL (0.05 mol/L, pH=7.4) PB液（磷酸缓冲液）, 20 μg 5H6, 1 mCi Na125I, 50 μL（1 g/L）氯胺T 溶液, 混合振荡60 s, 用100 μL （1 g/L）偏重亚硫酸钠溶液终止反应1 min; 将标记液用预先平衡Sephadex G25柱（Ф1×5 cm）纯化, 采用含1 g/L BSA（牛血清白蛋白）的PBS洗脱, 收集洗脱液（0.5 mL/瓶）。
1.2.3 标记率、放射化学纯度测定及稳定性分析采用纸层析法测定抗体标记率和放射化学纯度, 以新华1号层析纸为固定相, 生理盐水为展开剂, 用γ放射免疫计数器测量各段放射性计数, 计算标记率（纯化前标记物峰的计数占各峰总计数的百分比）和放射化学纯度（纯化后标记物峰的计数占各峰总计数的百分比）。
125I5H6在体外的稳定性: 将125I5H6分别存放于4℃ PB液、 37℃生理盐水、 37℃血浆中, 于不同时间点采用100 mL/L TCA（三氯醋酸）沉淀法测定其放射化学纯度。
1.2.4 细胞结合动力学实验分为总结合（total binding, TB）和非特异性结合(non specific binding, NSB)两组。
TB组各实验管加5×105个HO8910细胞和20 ng125I5H6, NSB组各管则比TB 组多加20 μg未标记抗体5H6（封闭特异性抗原结合位点）, 在室温孵育10 min、 30 min、 1 h、 2 h、 4 h、 6 h, 其中每组每个时间点均设两个平行管, 反应结束时先测各管总投入（total, T）的放射性计数, 离心弃上清, 用含1 g/L BSA的PBS洗涤2次后, 测其沉淀部分即结合的放射性计数, 由TB管沉淀部分的放射性计数减去相应的NSB管沉淀部分的放射性计数可得特异性结合（specific binding, SB）的放射性计数, 并由T减去相应的SB可得未结合即游离部分（free, F）的放射性计数。