荧光素标记抗体方法
荧光素标记抗体技术
(一)原理
目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocy nate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。
(二) 操作步骤
将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，
透析后抗体液移入小烧杯中
↓
称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO)
使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO
FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFI TC／mgIgG；
如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG
在10ml小烧杯中先放入抗体
↓
按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中
↓
将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h
↓
用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G2 5柱
↓
收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P
比值。第二个荧光素峰为游离荧光素
计算:
2.87×A495
F／P＝────────
A280-0.35×A495
合适的F／P值为2～4。
(三) 试剂器材
1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。
2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。
3. PBS、DMSO
CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。
4. PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na
2
5. PD10柱(Sephadex G25柱)
6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等
(四) 注意事项
1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。
2. FITC-DMSO液要临用时配制。
3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。
荧光素标记抗体方法
荧光素标记抗体技术 (一) 原理 目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocy nate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。 (二) 操作步骤 将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜， 透析后抗体液移入小烧杯中 ↓ 称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO) 使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFI TC／mgIgG； 如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG 在10ml小烧杯中先放入抗体 ↓ 按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中 ↓ 将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h ↓ 用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G2 5柱 ↓
收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P 比值。第二个荧光素峰为游离荧光素 计算: 2.87×A495 F／P＝──────── A280-0.35×A495 合适的F／P值为2～4。 (三) 试剂器材 1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。 2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。 3. PBS、DMSO 4. PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na 2CO 3 4.3g，NaHCO 3 8.6g加蒸馏水至500ml。 5. PD10柱(Sephadex G25柱) 6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等 (四) 注意事项 1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。 2. FITC-DMSO液要临用时配制。 3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！
常用抗体标记荧光染料的特性及其应用
常用抗体标记荧光染料的特性及其应用 1、FITC：激发波长488nm，最大发射波长525nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）可用于荧光显微镜技术 4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。 2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术； 4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。 3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）适用于荧光显微镜技术； 4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于P E。 4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL4通道检测；
3）适用于荧光显微镜技术； 4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。 5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。 5、PE：激发波长488nm，最大发射波长575nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。 6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 7、PE-Alexa Fluor 610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）荧光强度高； 3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 8、PE-Alexa Fluor 647：激发波长488nm，最大发射波长668nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测； 2）不易湮灭；
几种常见荧光素极其特性介绍
几种常见荧光素极其特性介绍 荧光素（英语：Fluorescein，又称为荧光黄）是一种合成有机化合物，它是具有光致荧光特性的染料，外观为暗橙色/红色粉末，可溶于乙醇，微溶于水，在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光。荧光染料种类很多，目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明，酶作用后产生荧光的物质。目前荧光素广发应用在免疫荧光、免疫荧光染色实验中。 下面介绍几种常用荧光素及其基本生物学特性： 1、异硫氰酸荧光素，简称“FITC”。是一种小分子荧光素，其效率取决于于溶液的pH 值，因此，在使用FITC时应注意溶液的酸碱度。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。 FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 2、藻红蛋白，简称“PE”。相对分子质量较大，约为240kD，最大吸收峰为564nm，当使用488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm，故可能会对其它大探针产生空间位阻。 但PE的化学结构非常稳定，有很高的荧光效率，并易与抗体分子结合。需要注意的是PE作为天然染料，因来源不同可能造成荧光素结构上的微小差别，导致其特征的不一致。 3、PI和EB。两者都具有嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中并与碱基对结合的特异性。为了获得特异的DNA分布，染色前必须用RNA酶处理细胞，排除双链RNA的干扰。 PI和EB不能进入完整的细胞膜，因此，又可以用于检测死活细胞。PI和EB各种理化性质相似，但PI比EB的发射光光谱峰向长波方向移动，因而在做DNA和蛋白质双参数测量时，PI的红色荧光和FITC的绿色荧光更易于区分和测量。另外，PI比EB测得的DNA 分布的变异系统（CV值）低，所以PI得到更广泛的应用。
同位素示踪与荧光标记技术
同位素示踪与荧光标记技术 [热考解读] 1．同位素示踪法 (1)同位素示踪法：用示踪元素标记的化合物，可以根据这种化合物的放射性，对有关的一系列化学反应进行追踪。这种科学的研究方法叫做同位素示踪法，也叫同位素标记法。(2)应用：可用于研究细胞内的元素或化合物的来源、组成、分布和去向等，进而了解细胞的结构和功能、化学物质的变化、反应机理等。还可用于疾病的诊断和治疗，如碘的放射性同位素可以用来治疗甲状腺肿大。 (3)使用注意事项：一次只能使用一种同位素标记 2．荧光标记法 荧光标记法(Fluorescent Labeling)是利用荧光蛋白或荧光蛋白基因作为标志物对研究对象进行标记的分析方法。 (1)常用的荧光蛋白为绿色和红色两种 ①绿色荧光蛋白(GFP)常用的是来源于发光水母的一种功能独特的蛋白质，分子量为27 kD，具有238个氨基酸，蓝光或近紫外光照射，发射绿色荧光。 ②红色荧光蛋白来源于珊瑚虫，是一种与绿色荧光蛋白同源的荧光蛋白，在紫外光的照射下可发射红色荧光，有着广泛的应用前景。 (2)人教版教材中用到荧光标记法的地方 ①《必修1》P66“细胞融合实验”：这一实验很有力地证明了细胞膜的结构特点是具有一定的流动性。 ②《必修2》P30“基因在染色体上的实验证据”：通过现代分子生物学技术，运用荧光标记的手段，可以很直观地观察到某一基因在染色体上的位置。 (3)荧光标记法特别是在免疫学研究中也有重要的作用，例如免疫荧光抗体标记法。将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。 [命题设计] 1．(2018·山东青岛一模)同位素标记法常用于追踪物质运行和变化规律的研究，下列相关叙述不正确的是() A．给小鼠供应18O2，其呼出气体中可能含有C18O2 B．用含3H标记的尿嘧啶核糖核苷酸的营养液培养洋葱根尖，只能在分生区细胞中检测到放射性 C．用15N标记DNA分子，可用于研究DNA分子的半保留复制 D．用32P标记的噬菌体侵染大肠杆菌，保温、搅拌、离心后可检测到沉淀物中放射性很高
标记抗体技术
标记抗体技术 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗 体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。 一、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体 a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ） HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm 的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。 HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。 HRP DH2＋H2O2──────→D＋2H2O b. 辣根过氧化物酶标记方法 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff 碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。 在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，
荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用
荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用 Feb 20, 2010No Comments 随着分子生物学、有机化学以及材料科学等学科的进展，最近我们又获得了好几种新型的荧光蛋白标签，这些标签可以用于细胞生物学成像研究。本文将对荧光标志物在蛋白质研究中的优势及劣势进行一番详细的介绍，文章中将重点介绍如何使用荧光标志物研究活体细胞（而不是固定细胞）中的靶蛋白。使用该方法可以对靶蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、活性状态等指标进行研究，还将介绍将荧光显微镜与电子显微镜技术相结合的可行性问题。小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料，即所谓的“量子点（quantum dots）”材料、自发荧光蛋白、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物，而且将这几种材料“混合”起来是一种非常有前途的荧光标志物研究新思路。 我们使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了，而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接，来研究各种目的蛋白。不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时，还需要对细胞进行固定和透化操作。因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。在最近这10年里，荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。使用这种荧光蛋白标志物，我们可以研究目的基因的表达情况，蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统，我们还可以对蛋白质的寿命进行研究，如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术（rapid photoinactivation）还可以对蛋白质的定位情况进行研究。与此同时，半导体纳米晶体材料技术也得到了高度的发展，现在，这种新型的材料在亮度和光稳定性方面都要比传统的荧光标志物好得多，只不过现在这种材料的靶向性还不是很好。本文中我们将对目前荧光标志物及其相关技术的发展进行介绍，同时还将介绍荧光标志物在蛋白质表达、蛋白质活性以及蛋白质功能研究工作中的作用进行介绍。 ?0?2 荧光标志物 小分子有机染料 小分子有机染料是指分子量小于1KD的小分子物质，这种小分子有机染料可以通过与生物大分子共价连接的方式对其进行标记，我们现在对这种染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性都有了比较详尽的了解。利用荧光染料的分子策略包括扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。现在市面上已经有数百种这类荧光染料的商业化产品可供选择，而且还在不断增加之中。不过由于这类染料对蛋白质缺乏特异性，因此多与抗体联用（图1A~C）。?0?2 荧光蛋白 第一批用于细胞生物学的荧光蛋白包括藻胆蛋白（phycobiliproteins）和从蓝藻
抗体标记技术汇总
第1章抗体分子标记技术 第一节抗体的I125标记法 基本原理 有多种方法可用于蛋白质的碘标记，如应用化学法或酶促法通过氧化对蛋白质分子进行碘化是常用的方法。当应用化学氧化法时，碘化钠（NaI）遇强氧化剂，碘离子被氧化为碘分子，所生成的自由碘分子可与某些基团进行卤化反应。蛋白质分子可进行卤化反应的基团主要为酪氨酸残基，某些组氨酸残基也可能进行碘化。在应用氯胺T(Chloramine T)法的实验中，所用的氧化剂（1，3，4，6-tetrachloro-3α, 6α -diphenyl-glucoluril）是溶于强挥发性的有机溶剂中。该溶剂加入试管后，先让其挥发（即让氧化剂将试管包被），然后把Na125I和蛋白质液加入包被好的试管中，反应完成即将混合液移入他管，以终止反应。 试剂及仪器 ●经亲和层析纯化的多克隆抗体或单克隆抗体 ●0.5 mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.5 (配法见附录1) ●无载体的Na125I 3.7GBq/ml ( 100 mCi/ml ) 的NaOH液 ●凝胶过滤柱 ●γ-记数器 ●100g/L 三氯醋酸 ●70% 乙醇 ●玻璃纤维滤 ●氯胺T (Chloramine T)反应用 * 新鲜制备的含2mg/ml氯络胺T的 0.5 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.5）； * 氯胺T 反应终止缓冲液： 2.4mg/ml 偏重亚硫酸， 10mg/ml 酪氨酸, 10%甘油, 1g/L Xyene cyanol 的PBS 液。 操作步骤 *注意：125I 对健康有害，需要保护措施。在应用125I 应先有关同位素知识，及在有关部门的监测下，按放射线同位素的应用及处置要求进行。 （一）氯胺T法 1．用1.5ml Ependof 管，加10μl 抗体及pH 7.5的0.5 mol/L磷酸钠缓冲液总体积至25μl； 2．加500 μCi 的Na125I ，混匀； 3．加25μl 2mg/ml 氯胺T液，混匀； 4．在室温下培养1分钟； 5．加入50μl氯胺T 反应终止缓冲液（以饱和的酪氨酸来捕获游离的 Na125I）； 6．通过凝胶过滤层析分离将碘化抗体与碘化酪氨酸分离。将反应混合液上1ml的凝胶过滤层析柱，分部收集洗脱液100μl/管，碘化抗体在开始的组分排出。应用γ-记数器监测各组分； 7．收集、合并含碘化抗体的各管；
生物素标记抗体的免疫荧光方法
生物素标记抗体的免疫荧光方法 *重要提示：在开始实验前请查阅所用抗体的说明书中第一页应用（APPLICATIONS）部分，确认这支抗体已经验证过可用于你计划采用的本实验方法中的特定方案。 A.所需溶液和试剂 注意：用Milli-Q超纯水或是相当级别的水配制溶液。 1.10 X磷酸盐缓冲液(PBS): 1升水中加入80 g 氯化钠(NaCl), 2 g 氯化钾(KCl), 14.4 g 磷 酸氢二钠(Na2HPO4) and 2.4 g 磷酸二氢钾(KH2PO4)。调整pH到7.4。 2.甲醛溶液，16%，无甲醇的类型，Polysciences, Inc. (cat# 18814) ，现配现用。开封 以后放在4°C避光保存。使用时用PBS稀释。 3.二甲苯 4.无水乙醇，组织学级，100%和95%。 5.蒸馏水(dH2O) 6.封闭缓冲液：配制25ml时，2.5 ml 10X PBS和1.25ml正常血清（来源与二抗相同， 例如正常山羊血清，正常驴血清）兑到21.25ml的蒸馏水中，混匀。边搅拌边加入75μL Triton X-100(100%) 7.抗体稀释缓冲液配置40ml时，取4 ml 10X PBS兑入36 ml蒸馏水，混匀。加入0.4 BSA，使溶解。边搅拌边加入120μL Triton X-100(100%)。 8.10 mM 柠檬酸钠缓冲液配置1L时，称取2.94g二水合柠檬酸三钠(C6H5Na3O7?2H2O) 溶解在1L蒸馏水中。调整pH为6.0。 9.荧光素标记的抗生物素蛋白Avidin/Streptavidin 注意：第一次使用不论是一抗还是荧光素标记的抗生物素蛋白Avidin/Streptavidin时，都需要做滴定分析以判断何种稀释比例能在你的样品上得到最强的特异信号同时背景保持最低 11.Prolong? Gold 抗淬灭试剂(Invitrogen, Eugene, OR, Cat# P36930) B.样品制备 I.细胞系培养物来源(IF-IC) 重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-IC。 注意：细胞应直接在多孔板，腔室玻片或是盖玻片上直接培养，处理，固定和染色。 1.用PBS稍加润洗。 2.吸去PBS，将细胞泡在2-3 mm厚的2-4%甲醛溶液（PBS配制）中。 注意：甲醛有毒，需要在通风橱中操作。 3.室温下固定细胞15分钟。 4.吸去固定剂，用PBS润洗三次，每次五分钟。 5.甲醇打孔步骤（是否需要参考抗体说明首页）在甲醛固定后，将细胞浸泡在冰纯甲 醇中（加入足量甲醇完全盖住细胞，液层厚度在3-5mm，千万别让细胞干掉），–20°C 孵育10分钟。用PBS润洗5分钟。 6.继续C部分的免疫染色。 II.石蜡切片(IF-P) 重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-P。 脱蜡处理/再水化 1.用二甲苯浸洗切片3次，每次5分钟。 2.用无水乙醇浸洗切片2次，每次10分钟。 3.用95%乙醇浸洗切片2次，每次10分钟 4.在蒸馏水中润湿2次，每次5分钟。 抗原暴露：
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、 生物素标记 抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。 一、酶标记 1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。 程序一： (1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。 (2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。 (3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等 (15mg/ml)，混匀。 (4)称取Sephadex
G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。 (5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加 1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。 (6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。 (7)酶结合物质量鉴定： 克分子比值测定 酶量(mg/ml)=OD403×0.4 IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62 克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。 标记率=OD403/OD280 酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效
荧光技术
https://www.360docs.net/doc/c012235307.html,/?p=21977 首页专题译述会议展览技术方法教学视频热点话题生命百态研究前沿科研综述电子杂志RSS 订阅当前位置: 生命奥秘> 技术方法> 文章正文荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用 cyq 发表于2010-02-20 14:48 | 来源：| 阅读 随着分子生物学、有机化学以及材料科学等学科的进展，最近我们又获得了好几种新型的荧光蛋白标签，这些标签可以用于细胞生物学成像研究。本文将对荧光标志物在蛋白质研究中的优势及劣势进行一番详细的介绍，文章中将重点介绍如何使用荧光标志物研究活体细胞（而不是固定细胞）中的靶蛋白。使用该方法可以对靶蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、活性状态等指标进行研究，还将介绍将荧光显微镜与电子显微镜技术相结合的可行性问题。小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料，即所谓的“量子点（quantum dots）”材料、自发荧光蛋白、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物，而且将这几种材料“混合”起来是一种非常有前途的荧光标志物研究新思路。 我们使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了，而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接，来研究各种目的蛋白。不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时，还需要对细胞进行固定和透化操作。因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。在最近这10年里，荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。使用这种荧光蛋白标志物，我们可以研究目的基因的表达情况，蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统，我们还可以对蛋白质的寿命进行研究，如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术（rapid photoinactivation）还可以对蛋白质的定位情况进行研究。与此同时，半导体纳米晶体材料技术也得到了高度的发展，现在，这种新型的材料在亮度和光稳定性方面都要比传统的荧光标志物好得多，只不过现在这种材料的靶向性还不是很好。本文中我们将对目前荧光标志物及其相关技术的发展进行介绍，同时还将介绍荧光标志物在蛋白质表达、蛋白质活性以及蛋白质功能研究工作中的作用进行介绍。 荧光标志物 小分子有机染料 小分子有机染料是指分子量小于1KD的小分子物质，这种小分子有机染料可以通过与生物大分子共价连接的方式对其进行标记，我们现在对这种染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性都有了比较详尽的了解。利用荧光染料的分子策略包括扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。现在市面上已经有数百种这类荧光染料的商业化产品可供选择，而且还在不
荧光素FITC标记抗体的方法
荧光素FITC标记抗体的方法 当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下 FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 1．Marsshall法 (1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光 素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等。 (2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为
20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。 ②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。 a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。 b．总蛋白量(AXB)＝Crag。 c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。 d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。 e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。 f．PBS量D-(B+F)=Gml。 注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。 ③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，
荧光微球标记抗体制备的详细步骤及问题分析
荧光微球标记抗体方法及问题分析 很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目，关注胶乳标记技术的技术人员越来越多。本人总结了部分胶乳微球标记技术相关主题帖，并加以分类，以便朋友们查阅，希望朋友们继续完善或分享经验。 1. 胶乳大小选择 【求助】免疫胶乳或免疫颗粒（聚苯乙烯）的粒径 免疫胶乳或免疫颗粒（聚苯乙烯）的粒径- 丁香园论坛 【求助】乳胶免疫比浊中的乳胶颗粒大小与抗体 乳胶免疫比浊中的乳胶颗粒大小与抗体- 丁香园论坛 2. 胶乳标记方法 【交流】蛋白如何偶联到聚苯乙烯乳胶颗粒上 蛋白如何偶联到聚苯乙烯乳胶颗粒上- 丁香园论坛 （求助）胶乳标记 （求助）胶乳标记- 丁香园论坛 【求助】抗原或抗体致敏胶乳的缓冲液和pH值 抗原或抗体致敏胶乳的缓冲液和pH值- 丁香园论坛 3. 胶乳标记过程问题 【求助】胶乳偶联出现絮凝 胶乳增强免疫比浊试剂稳定性问题- 丁香园论坛 【求助】胶乳增强免疫比浊中抗体交联的问题 胶乳微球物理吸附 反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka大约为2，因此在酸性pH保持稳定。醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定。 带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球）。醛
基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。一般，在被吸附蛋白等电点附近pH时，物理吸附效率会很高。 反应步骤： 1. 用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml； 2. 用反应缓冲液系数胶乳微球到1%； 3. 将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中，10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。室温搅拌孵育2hr； 4. 离心或超滤，除去未结合蛋白； 5. 将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解。 注意事项： 1. 最优蛋白标记量影响因素 1）有效比表面积：粒径减小时，比表面积/mg微球值得增加； 2）胶体稳定性：蛋白对胶乳有稳定和去稳定作用； 3）免疫反应：最近标记量由免疫反应需要决定。 2. 胶乳微球中加入蛋白后，快速搅拌混合，利于反应均衡。反应体积是1ml时，可用移液器吸取蛋白加入微球中，并吹打数次。如果反应体积较大时，用烧杯，边搅拌边加入蛋白， 3. 储存缓冲液和反应缓冲液不同时，抗体有脱落的可能； 4. 表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落，所以应避免加入。 微球共价结合抗体方法 一、一步法 1. 准备50mM pH 6.0的reaction buffer，醋酸或MES buffer更合适 2. 用reaction buffer溶解抗体，使其浓度为1mg/mL。 3. 用reaction buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v 4. 边搅拌边将一倍体积的抗体溶液加入到10倍体积的微球悬液中，室温下持续搅拌20分钟 5. 准备浓度为10mg/ml（52umol/mL）的EDC溶液，用前准备，现配现用。 6. 将计算需求量的EDC溶液加入到上述微球悬液中。(Note 6). 7. 室温下，立即调节pH (Note 7). 8. 移除未结合的蛋白，并将包被微球用storage buffer重悬。(Note 3 and 4) B. 两步法 为了避免EDC将相邻微球之间的蛋白偶联导致微球聚集或者蛋白之间交流，两步法偶联抗体更合适。两步法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除。两步法中，蛋白也可以使用更高pH的buffer来溶解，从蛋白的稳定性方面和加速蛋白和活化微球之间的交联速度方便考虑，是非常有利的。 B1 简单一步法： 1. 准备50mM pH 6.0的活化buffer，醋酸或MES buffer更合适；用活化buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v 2. 每ml微球悬液加入20mg的EDC，室温孵育20分钟，然后再次加入20mg/mL的EDC，继续室温孵育20分钟。(Note 7). 3. 离心或超滤，用等体积的包被缓冲液清洗两次微球，最后悬浮在包被缓冲液中。(Note 3). 4. 用包被缓冲液溶解抗体到1mg/mL，包被缓冲液pH7~9，浓度为50mM~100mM。(Note 1)
第十六章 标记抗体技术
第十六章标记抗体技术 1、免疫荧光标记技术的概念/所用荧光素的要求/基本原理/操作步骤/注意事项/实际应用 （一）概念：免疫荧光标记技术是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法（二）荧光素要求：作为蛋白质标记用的荧光素须具备①有与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团，而不形成有害产物②荧光效率高，与蛋白质结合的需要量很小③结合物一般在储存条件下稳定，结合后不影响抗体的免疫活性④作为组织学标记，结合物的荧光必须与组织的自发荧光有良好的反衬，以便能清晰地判断结果⑤结合程序简单，能制成直接应用的商品，可长期保存。可用于标记的荧光素有FITC,RB200,四甲基异硫氰酸罗丹明。 （三）基本原理：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应 （四）操作步骤：
①标本制备： 涂片或压印片：细菌培养物、感染动物的组织或血液、脓汁、粪便、尿沉渣 冰冻切片或低温石蜡切片：组织学、细胞学和感染组织 盖玻片：上面培养单层细胞 首要要求是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。标本要相当薄，有适当的固定处理方法 ②固定：常用丙酮和95%乙醇，室温固定15-30min后，用PBS反复冲洗，干后即可染色。 目的：防止被检材料从玻片上脱落，消除抑制抗原抗体反应的因素。检测细胞内的抗原，用有机溶剂固定可增加细胞膜的通透性而有利于荧光抗体渗入。 ③检测： A、直接法：直接滴加2-4个单位的标记抗体于标本区，置湿盒中，于37度染色30min左右，然后置大量ph7-7.2PBS中漂洗15min，干燥、封载，显微镜镜检 B、间接法：将标本先滴加特异性的抗血清，置湿盒中，于37度作用30min，PBS漂洗5min后，再加入FITC标记的抗抗体，置湿盒中，37度作用30min，PBS漂洗5min，干燥、封载，显微镜观察
FITC标记抗体流程
其中FITC 应用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长520～530nm ，可呈现明亮的黄绿色荧光。FITC 分子中含有异硫氰基，在碱性(pH9.0～9.5)条件下能与IgG 分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG 结合物，从而制成荧光抗体。 抗体经荧光色素标记后，不影响 与抗原的结合能力和特异性。当荧光 抗体与相应的抗原结合时，就形成了 带有荧光性的抗原抗体复合物，从而 可在荧光显微镜下检出抗原的存在。 一,FITC 标记抗体流程 （1） 将待交联的蛋白（浓度 ≥1mg/ml ）对交联反应液透析三次 (4 ℃)，至pH ＝9.0。 交联反应液配制方法：7.56g NaHCO 3，1.06g Na 2CO 3，7.36g NaCl ，加水定 容至1 L 。 （2） 将FITC 溶于DMSO 中，浓度为1mg/ml 。每次交联使用的FITC 均应新鲜配制，避光。 （3） 按P:F （蛋白质：FITC ）=1mg:150μg 的比例将FITC 缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 ℃反应8 hr 。 （4） 加入5mol/L 的NH 4Cl 至终浓度50mmol/L ， 4 ℃终止反应2 hr 。 （5） 将交联物在PBS 中透析四次以上，至透析液清亮。 （6） 交联物的鉴定 蛋白浓度(mg/ml) = [ A 280– 0.31×A 495 ] / 1.4 F/P 比例: 3.1×A 495 / [A 280 – 0.31×A 495 ]，该值应介于2.5 ~ 6.5之间。 （7） FITC 交联的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1% NaN 3、1% BSA ， 4℃暗处保存。 二,免疫荧光组织化学染色方法 1.直接法 简便、快速，用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。 操作流程： (1)冰冻切片经固定，凉干PBS 洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min ，PBS 洗。 (2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内37℃温育1h ，PBS 洗3×3min。 (3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min ，PBS 洗3×3min，蒸馏水洗2次，除去Nacl 结晶。
荧光标记PCR
主要需要考察的方面： ?加热方式 ?升降温速度 ?准确性 ?均一性 ?激发光源 ?检测元件 ?检测通路 ?监测系统 详情请参考全文…… 回顾分子生物学的发展历程，PCR技术的发明和普及无疑是最重要的篇章之一。而PCR技术在近20年的不断发展创新中，最受瞩目当属荧光实时定量PCR技术(real-time quantitative PCR, or qPCR)。定量PCR技术真正实现了PCR从定性到定量的飞跃，通过对PCR过程的实时监控，专一、灵敏快速、可重复地精确定量起始模版浓度，已经在科研和临床诊断领域得到了越来越广泛的应用。本文从荧光定量PCR的原理入手，详细介绍荧光定量PCR仪的类型和技术，为定量PCR仪的选择提供详细参考。 一、背景 本来，PCR是为了将样本中微量的DNA模版放大以便研究模版特性，随着研究的深入，要了解样本中基因的表达模式与疾病的关系，就需要了解标本中的DNA 原始拷贝数。理论上PCR过程中反应产物是以指数规模增长的，但实际的PCR 扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线——因为随着PCR循环数的增加，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率降低，产物生成的速度逐渐减缓，最终进入平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时间和平台期的高低都有很大变化，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也往往不同。因此经过PCR扩增的DNA产物量不能反映起始模板量的真实情况。通过传统凝胶电泳EB染色或者同位素标记只能定量PCR的终产物量，而不能定量起始DNA模版的拷贝数。 荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面可以在每次PCR 循环收集数据，建立实时扩增曲线，准确地确定域值循环数(CT值)，计算起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。根据最终得到的数据不同，定量PCR 可以分为相对定量和绝对定量两种。相对定量常见于比较两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。
第5章 常见免疫学检测技术-荧光、化学发光
第五章 常见免疫学检测技术
第二节 荧光免疫检测
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用荧光素标记抗体或抗原，与相应的抗原或抗 体反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫 技术，称为荧光免疫技术
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包括荧光抗体技术和荧光抗原技术，但在实际 工作中荧光抗原技术很少应用 荧光显微镜技术 常见技术 荧光免疫测定技术
一、荧光的基础知识
（一）荧光 （fluorescence）
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某些物质能吸收外界能量进入激发状态，使处 于基态的电子被激发至激发态，当其再回到稳 定基态时，多余的能量会以电磁辐射的形式释 放，即发出荧光，这类物质被称为荧光素
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由光激发所引起的荧光，为光致荧光 ------荧光免疫技术 由化学反应所引起的荧光，为化学荧光 ------化学发光技术
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荧光免疫技术的标记物一般为光致荧光物质， 当受一定波长光激发后，在极短时间内发出长 于激发光波长的荧光，一旦停止供能，荧光即 消失（约持续10-7～10-8s）
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荧光效率：指荧光物质分子将光能转变成荧光 的百分率 荧光效率= 发射荧光的光量子数/吸收光的光 量子数
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发射光谱：是指固定激发波长，在不同波长下 记录的样品发射荧光的强度 激发光谱：是指固定检测发射波长，用不同波 长的激发光激发样品记录的相应的荧光强度
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荧光寿命：指荧光物质被激发后所产生的荧光 衰减到一定程度时所用的时间 各种荧光物质的荧光寿命不同
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荧光猝灭：荧光物质在某些理化因素作用下， 发射荧光减弱甚至消退称为荧光猝灭 荧光猝灭物质如亚甲基蓝、碱性复红、伊文思 蓝、碘溶液等
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荧光素FITC标记抗体的方法
荧光素FITC标记抗体的方法当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 1．Marsshall法 (1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光 素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等。(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于使最后免疫球蛋白浓度为再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，烧杯中， 20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。 ②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出
需加缓冲液的量。 a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。b．总蛋白量(AXB)＝Crag。 c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。 d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。 e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。f．PBS量D-(B+F)=Gml。 注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白 总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓。ml的容积，PBS为G；ml冲液的容积， ③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后， 继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。 ④透析结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8．0缓冲盐水透析(0～4~C)过夜。 ⑤过柱取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：0．01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．2)；过滤量：12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析)；收集量：20ml(稀释1．7倍左右)。
荧光标记二抗的选择
荧光标记二抗的选择 来源: 生物耗材网发布日期: 2012-2-28 一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine）和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin检测系统。其中荧光素是具有光致荧光特性的染料，荧光染料种类很多，目前常用于荧光标记二抗有以下几种： 【异硫氰酸荧光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)荧光标记二抗】FITC 纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。由于FITC是小分子化合物，每一个抗体可标记几个FITC分子，IgM通常用小分子的荧光素标记，如FITC、Cy3/5、Texas Red等。FITC荧光二抗主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。然而FITC 的最大缺点是淬灭快，因此要和抗淬灭剂一起使用。 【四甲基异硫氰酸罗丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC)，Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)荧光标记二抗】 这些罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长(550, 570, 596nm)和最大发射波长（570, 590, 620nm）。尽管TRITC经常和FITC一起在双标记实验中使用，使用RRX和TR可以得到更好的颜色区分。在使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记的实验时，RRX尤其有用，可以和Cy2(或者FITC)和Cy5一起使用，因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，而且和这两者覆盖都很少。氪氩灯激发光为488nm，598nm和647nm，分别是Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激发波长。因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发, 在流式细胞仪中用FITC作双标，另一种用藻红蛋白（PE）耦联基团要比罗丹明好。TRITC 为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。 【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)】 Cy2 耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和