药物体外代谢研究III- PHASE II酶研究
体外代谢产物实验报告
一、实验目的本实验旨在通过体外代谢实验，研究某种化合物在特定酶系作用下的代谢过程，鉴定其代谢产物，并分析其代谢动力学特性。
通过此实验，可以为该化合物的体内代谢研究提供实验依据，并为后续的药物研发和毒理学评价提供参考。
二、实验材料1. 实验化合物：待研究化合物A（纯度≥98%）2. 实验试剂：肝微粒体酶、NADPH、辅酶A、磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、硫酸铵、氯化钠、氢氧化钠等3. 实验仪器：低温离心机、紫外-可见分光光度计、高效液相色谱仪（HPLC）、质谱仪（MS）等4. 实验动物：比格犬（体重2-3kg）三、实验方法1. 肝微粒体酶的制备：取比格犬肝脏，剪碎后用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）制成匀浆，低温离心（10000g，4℃，10min）分离肝微粒体。
用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）调整肝微粒体蛋白浓度为10mg/mL。
2. 代谢反应：取肝微粒体酶溶液、NADPH、辅酶A和待研究化合物A，按一定比例混合，在37℃、pH 7.4的条件下进行代谢反应。
3. 代谢产物分析：代谢反应结束后，用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分析代谢产物，鉴定其结构。
4. 代谢动力学分析：通过计算酶的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax），分析酶的代谢动力学特性。
四、实验结果1. 代谢产物分析：实验结果显示，待研究化合物A在肝微粒体酶的作用下，产生了多个代谢产物，其中主要产物为B和C。
2. 代谢动力学分析：酶的米氏常数（Km）为0.5μM，最大反应速率（Vmax）为0.2μM/min。
五、讨论1. 本实验成功鉴定了待研究化合物A的代谢产物，为后续的体内代谢研究提供了实验依据。
2. 代谢动力学分析结果显示，该酶对化合物A的代谢动力学特性符合米氏方程，说明该酶对化合物A的代谢具有可逆性。
3. 通过比较不同酶系的代谢动力学参数，可以为药物研发和毒理学评价提供参考。
六、结论本实验通过体外代谢实验，研究了待研究化合物A的代谢过程，鉴定了其代谢产物，并分析了其代谢动力学特性。
代谢稳定性及其研究方法
微粒体 稳定性
测定用 缓冲液
血浆 pH缓冲液
体液
药物发现过程中多种稳定性的体外评估
CONFIDENTIAL© 2014 ChemPartner
代谢稳定性
药物代谢反应通常被分为一相反应（phase I）和二相反应（phase II） 一相反应 是对化合物分子结构本身的修饰，如氧化或去烷基，最常见的是 脂肪族和芳香族碳原子的羟基化， 是将极性基团结合到分子结构中。
代谢稳定性的数据的应用
指导结构修饰以提高稳定性 选择最佳化合物进行体内PK或活性测试 前瞻性预测体内PK行为 回顾性诊断体内PK差的根本原因 CYP表型分析：进行体外试验，研究化合物由哪种CYP同工酶代谢
CYP同工酶的底物特征
CYP 3A4 2D6 2C9 1A2 logP范围 0.97~7.54 0.75~5.04 0.89~5.18 0.08~3.61 其他特征 较大分子 碱性分子（离子化） 酸性分子（非离子化） 平面胺或酰胺 代表性底物 硝苯地平 普萘洛尔 萘普生 咖啡因
Biorad 二相代谢
代谢物稳定性
ADMENSA
Inparmatica 肝细胞
代谢物稳定性 ，代谢物结构
500/week
Meteor
代谢物/week
CONFIDENTIAL© 2014 ChemPartner
用于代谢稳定性研究材料
肝组织
匀浆化 过滤，离心（500 g, 10 min） 核，细胞
8
针对一相代谢稳定性的结构修饰
在对结构进行修饰以提高稳定性前，推测代谢特定位点是有必要的，对此研 发人员开发了代谢物结构推测的高通量方法。 一相代谢的结构修饰的关键特征：1）化合物和代谢酶的结合； 2）化合物 分子中特定部位的反应性，这些部位可接近CYP酶的反应性亚铁血红素或其 他酶的活性位点。 减弱这些化合物结合部位的活性都可增加代谢稳定性。但是由于存在代谢切 换，这些策略并不是100%成功。 改善一相代谢稳定性的结构修饰策略： 引入氟、氯、腈基封闭代谢位点：反应活性低于同一位点的氢，氟对分 子大小影响最小。 引入其他基团封闭代谢位点：引入较大的脂肪族取代基 去除易代谢的官能团：去除易去烷基化的基团。 环化：在易代谢位点引入环结构 该变环的大小： 改变手性 降低亲脂性 替换不稳定基团
手性药物体外代谢的研究方法
手性药物体外代谢的研究方法王彬;杨雷琼【摘要】手性药物体外代谢的研究是通过建立体外代谢模型对手性药物的代谢行为进行评价.随着大量手性药物的开发,出现了多种与体外代谢相关的研究方法和技术来评价对映体之间的分子以及代谢动力学方面的差异,从而选择出对映体.现对已有的一些研究方法及其优缺点进行综述,从而提供更系统化的手性药物的评选方法,更快速有效地为手性药物提供技术支持.%In vitro metabolism study of chiral drugs is to evaluate the metabolic behavior in vitro metabolic model. With the discovery of more chiral drugs, a lot of techniques and methods have been developed to evaluate chiral drug in vitro metabolism, so that molecular mechanisms and pharmacokinetic processes of two enantiomers can be displayed and the better can be selected. Here is to make a review on recent advances regarding different analytical techniques of chiral drugs and their metabolites, with the aim of offering a systemic reference for choosing suitable approach of chiral drug evaluation and selection.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2012(018)011【总页数】3页(P1614-1616)【关键词】手性药物;体外代谢;方法【作者】王彬;杨雷琼【作者单位】中国人民解放军总医院检验科,北京,100853;中国人民解放军总医院检验科,北京,100853;沈阳药科大学,沈阳,110016【正文语种】中文【中图分类】R969.1目前，在临床上应用的具有光学活性的药物已超过60%。
药物代谢与药效关系研究揭示药物代谢对药效的影响机制
药物代谢与药效关系研究揭示药物代谢对药效的影响机制药物代谢是指药物在体内经过化学反应转化为代谢产物的过程，通常发生在肝脏和其他器官中的细胞内。
药物代谢不仅仅是药物分解与排泄的过程，还与药物的药效密切相关。
本文将介绍药物代谢与药效的关系，并对药物代谢对药效的影响机制进行揭示。
一、药物代谢对药效的影响药物代谢可以影响药物的药效，具体表现为以下几个方面：1. 代谢速度与药物浓度：药物代谢速度决定了药物在体内的清除速度，从而影响药物的血药浓度。
血药浓度的增加或降低可能会导致药物疗效的增强或减弱。
2. 代谢产物的活性：药物代谢的过程中，往往会生成代谢产物。
有些代谢产物具有与原药物相同或更高的药效，进一步增强了药物的治疗效果。
然而，有时代谢产物具有低效或无效的药效，甚至出现毒副作用。
3. 药物相互作用：药物代谢还可以影响药物之间的相互作用。
一些药物被代谢酶代谢后，可能会影响其他药物的代谢速率，在体内导致药物间的相互作用。
二、药物代谢对药效的影响机制药物代谢对药效的影响机制主要涉及以下几个方面：1. 代谢酶系统：药物通常在体内经过多个酶介导的代谢途径，其中最常见的是肝脏细胞内的细胞色素P450酶系统。
细胞色素P450酶系统通过氧化、还原和水解等反应，将药物转化为代谢产物。
不同药物的代谢途径可能存在差异，从而导致对药效的影响。
2. 遗传变异：不同个体之间在药物代谢能力上存在遗传差异。
某些人可能具有较快或较慢的药物代谢能力，从而影响药物的疗效。
例如，对细胞色素P450酶系统的基因多态性研究已经发现，某些人携带特定遗传变异型，会导致药物代谢速度加快或减慢，从而对药效产生影响。
3. 药物的剂量与给药途径：药物的剂量和给药途径也会直接影响药物的代谢过程。
通常来说，药物剂量增加会导致药物更快地被代谢，使药效降低。
而改变给药途径，如口服、静脉注射等，也可能会对药物代谢过程产生影响。
三、药物代谢与药效的研究方法为了深入揭示药物代谢与药效的关系，科学家们采用了多种研究方法：1. 体外实验：体外实验可以利用体外代谢酶体系或细胞模型，研究药物与代谢酶之间的相互作用。
药物代谢酶的识别与鉴定
药物代谢酶的识别与鉴定药物代谢酶是指参与药物在机体内代谢转化的酶类，它们对药物的代谢过程具有重要的调控作用。
了解药物代谢酶的类型、功能与调控机制对于药物研发和合理用药具有重要意义。
本文将从药物代谢酶的分类、鉴定技术以及酶基因多态性的影响等方面展开论述。
一、药物代谢酶的分类根据其催化反应类型，药物代谢酶可分为两大类：相对较广谱的酶和相对较特异的酶。
1. 广谱酶：主要包括细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）和醇脱氢酶（Aldehyde Dehydrogenase，ADH）等。
细胞色素P450是一大家族的酶，能催化多种药物的代谢反应，特别是氧化、还原和羟基化等反应。
有些细胞色素P450同工酶还参与内源性物质的代谢，如17β-雌三醇和5α-二氢睾酮的代谢。
醇脱氢酶主要参与酒精、醛类药物等的代谢。
2. 特异酶：主要包括乙酰化酶（N-Acetyltransferase，NAT）、甲基转移酶（Methyltransferase）、酯酶（Esterase）等。
这些酶通常对一类或少数几类化合物具有高度专一性，参与药物的酸酐化、乙酰化、甲基化等代谢过程。
二、药物代谢酶的鉴定技术药物代谢酶的鉴定通常采用体外和体内两种方法。
1. 体外方法：以高通量实验技术为基础，如体外基因表达技术和体外代谢酶反应系统（recombinant enzyme systems）。
前者通过转染细胞系表达酶基因，研究其对不同底物的催化效能；后者通过体外合成大量纯化的酶，再与药物合成体外反应系统，模拟体内代谢反应，研究药物的代谢途径和反应动力学参数。
2. 体内方法：主要通过动物模型或人体试验进行。
动物模型包括小鼠、大鼠、猴子等，观察药物在体内的代谢过程和产物。
人体试验则指通过临床研究、个体差异评估和基因多态性的检测等手段，研究药物在人体内的代谢情况。
三、酶基因多态性与药物代谢酶基因多态性是指酶基因的不同等位基因在基因型及表型上的变异。
药物在不同生物体系中的药效研究
药物在不同生物体系中的药效研究药物是用于治疗疾病、缓解症状或预防疾病的物质。
药物的药效研究是了解药物在不同生物体系中的作用机制、药物代谢以及评估药物的疗效和安全性的重要环节。
本文将介绍药物在不同生物体系中药效研究的一般方法和应用。
一、药物在体外的药效研究药物在体外的药效研究是指在离体条件下对药物进行评价。
这种实验方式主要应用于药物的新发现或初步筛选阶段。
常见的体外实验方法包括酶反应体外研究和细胞培养实验。
1. 酶反应体外研究酶反应体外研究是评价药物与特定酶之间的相互作用。
通过测量药物对酶的抑制或促进作用，可以初步判断药物的活性和选择性。
常用的酶反应实验包括酶动力学和酶抑制实验。
2. 细胞培养实验细胞培养实验是在体外培养的细胞系统中评估药物的效果。
这种实验方法可以模拟人体内细胞的功能和反应，对药物的细胞毒性、细胞增殖、细胞代谢等进行研究。
细胞培养实验通常包括体外细胞毒性实验、细胞增殖实验和细胞代谢实验等。
二、药物在动物体内的药效研究药物在动物体内的药效研究是评估药物在整个生物体系统中的作用机制和效果。
这种实验方法可以模拟人体内的生理环境，对药物的代谢、疗效和安全性进行全面评估。
常用的动物模型包括小鼠、大鼠、猴子等。
1. 小鼠模型小鼠模型是药物研究中最常用的动物模型之一。
小鼠模型可以用于评估药物的效能和毒性，并通过遗传工程技术构建特定疾病模型，如癌症模型、心脏病模型等。
2. 大鼠模型大鼠模型相较于小鼠模型更接近人体生理特征，因此在某些药物研究中更具代表性。
大鼠模型可以用于评估药物的药代动力学、疗效和安全性，尤其在药物代谢与排泄等方面更为可靠。
3. 猴子模型猴子模型是药物研究中最接近人类的动物模型之一。
猴子模型在特定疾病模拟和药效评估方面具有重要意义，但由于其成本高昂和伦理限制等因素，使用较为局限。
三、药物在人体内的药效研究药物在人体内的药效研究是最接近真实环境的研究。
通过在人体中进行临床试验，可以评估药物的疗效和安全性，为药物的进一步开发和临床应用提供依据。
药物相互作用研究
药物相互作用研究药物相互作用是指在人体内同时或连续使用两种或更多药物时，一个药物会影响另一个药物的吸收、分布、代谢和排泄等过程，从而改变其药效或药物浓度。
药物相互作用的研究对于合理用药、预防不良反应以及提高药物疗效至关重要。
本文将探讨药物相互作用的研究方法和应用。
一、体外研究方法1. 酶反应体外研究酶反应体外研究是以体外酶底物与药物共同作用，测定药物在不同浓度下对酶的激活或抑制情况。
通过这种方法，可以评估不同药物之间的竞争性或非竞争性相互作用。
2. 细胞模型研究细胞模型研究使用体外培养的细胞系，通过测定细胞内指标物质的变化来评估药物相互作用。
例如，利用荧光染料来测定药物对药物转运蛋白的影响，或者使用细胞增殖试验来评估药物对细胞增殖的影响。
二、动物模型研究1. 体内药动学研究体内药动学研究主要通过给动物静脉、口服或皮下等途径给药，采集血样并测定药物的浓度-时间曲线，评估药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄等过程。
通过比较单药物和多药物给药后的药代动力学参数，可以评估药物相互作用的程度和机制。
2. 功能研究功能研究是通过测定动物体内的生理指标或药物效应来评估药物相互作用的影响。
例如，使用动脉舒张试验来评估药物对血管舒张的影响，或者使用行为学测试来评估药物对动物行为的影响。
三、人体研究方法1. 临床观察研究临床观察研究是通过观察临床患者的用药情况和治疗效果来评估药物相互作用。
这种方法需要充分记录患者的用药史和相关生理指标变化，从而推断药物相互作用的可能性。
2. 体内药代动力学研究体内药代动力学研究是通过给健康志愿者单次或多次给药，并采集血样来测定药物的浓度-时间曲线，评估药物在人体内的吸收、分布、代谢和排泄等过程。
对于多药物联合治疗的研究，还可以通过同时给药并测定药物浓度来评估药物相互作用的程度。
药物相互作用研究的应用非常广泛。
它可以为临床医生提供合理用药的指导，避免药物不良反应的发生。
同时，药物相互作用的研究也为药物的临床研发和药物安全性评价提供了依据。
体外代谢用于中药活性成分筛选的研究
体外代谢用于中药活性成分筛选的研究一、概述随着中医药学的不断发展，中药活性成分的筛选与鉴定成为中药现代化研究的重要方向。
体外代谢作为一种模拟人体药物代谢过程的技术手段，在中药活性成分筛选中发挥着越来越重要的作用。
本文旨在探讨体外代谢在中药活性成分筛选中的应用及其优势，为中药现代化研究提供新的思路和方法。
体外代谢技术通过模拟人体内的代谢环境，对中药中的化学成分进行代谢转化，从而揭示其潜在的生物活性。
通过体外代谢实验，可以预测中药成分在人体内的代谢过程，为药物的安全性和有效性评价提供依据。
体外代谢技术还可以用于中药活性成分的筛选和优化，通过比较不同成分在代谢过程中的转化效率和产物活性，确定具有潜在药用价值的化合物。
近年来，随着生物技术的不断进步，体外代谢技术在中药活性成分筛选中的应用也越来越广泛。
研究人员利用先进的体外代谢模型和方法，对中药中的复杂成分进行深入研究，发现了一系列具有显著药理活性的化合物。
这些研究成果不仅为中药现代化研究提供了新的候选药物，也为中药的临床应用提供了有力支持。
体外代谢技术在中药活性成分筛选中仍面临一些挑战和限制。
例如，中药成分的复杂性使得体外代谢模型的建立和优化变得困难同时，不同中药成分的代谢途径和机制也可能存在差异，需要针对不同药物进行个性化的研究。
未来研究需要进一步完善体外代谢技术，提高其准确性和可靠性，以更好地服务于中药活性成分的筛选和鉴定工作。
体外代谢在中药活性成分筛选中具有重要应用价值。
通过深入研究体外代谢技术在中药领域的应用，有望为中药现代化研究开辟新的道路，推动中医药学的传承与创新发展。
1. 中药活性成分筛选的重要性中药活性成分的筛选有助于揭示中药的药效物质基础。
中药通常含有多种化学成分，这些成分在中药的疗效中发挥着不同的作用。
通过筛选活性成分，可以明确哪些成分对疾病具有治疗作用，从而深入揭示中药的药效机制。
中药活性成分的筛选有助于优化中药的制剂工艺。
了解中药中活性成分的种类和含量，可以为制剂工艺的改进提供依据。
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1药物体外代谢研究III—Phase II酶研究
刘慧鑫Outline•Background & research significance；•Classification & Nomenclature;•Catalytic Mechanisms;•Substrate specificity;•Distribution;•Species differences & examples;•Metabolic stability studies (UGTs)2
Elimination pathways of top 200 drugsWieners et al. (2005) Nature Rev Drug Discov 4:825-833
药物代谢酶
转运蛋白以不变形式清除UGT，ST，甲基转移酶，乙酰转移酶结合代谢
酯酶，酰胺酶，环氧化物水解酶水解代谢CYP，FMO，MAO，Mo-CO，过氧化物酶氧化代谢
可能参与代谢的酶/蛋白清除机制
FMO，黄素单加氧酶；MAO，单胺氧化酶；UGT，UDP-葡糖醛酸转移酶；ST，磺基转移酶；Mo-CO，含钼氧化酶
研究意义Background代谢稳定性(代谢通路及速率）；揭示药物（或毒物）的作用机制(如解毒）；种属差异研究；前药设计与评价；结构改造及新药研发3
Phase II代谢酶Catalyze both detoxificationas well as bioactivationreactionsGenerally considered to be “antioxidant”enzymes when reactions catalyzed lead to detoxification.
partlybecause they remove metabolites capable of causing oxidative stress via redoxcycling
Conjugation reactions also detoxify reactive intermediatesof phase I reactions
Conjugatinreactions requires the presence of a reactive group(R-OH, R-NH2, R-COOH, R-SH, and some others)
实例Conjugation with phase II enzymesDetoxification & Antioxidant
BileUrine4
尿甘二磷酸葡萄糖醛酸转移酶UDP-Glucuronosyltransferases, UGTs
UGTs酶命名TransferasesGlycosyltransferasesHexosyltransferasesGlucuronosyltransferases(UGTs)
EC 2EC 2.4EC 2.4.1EC 2.4.1.17
Full NamesCommon Names
The Enzyme Commission number (EC number) is a numerical classification scheme for enzymes, based on the chemical reactions they catalyze
Accepted name:Glucuronosyltransferase(UGTs)
Reaction: UDP-glucuronate+ acceptor = UDP + acceptor β-D-glucuronoside5
UGTs催化机理There are three steps to form the conjugate:1.Coupling of D-glucose-1-phosphateto UTPto give UDP-glucose2.Oxidation of the primary alcohol yields the coenzyme UDP-glucuronicacid3.Conjugation with the substrateto yield the glucuronide
细胞质细胞膜内质网内腔+ + Signal peptide
UDP-GlcUApH 7.1 （Kim et at., 1998 ）[Mg+] 1mM ( Berg et al., 1995 )
UGTsare a family of membrane-bound enzymes that are concentrated in the endoplasmic reticulum (ER) and nuclear envelope of hepatocytes.
UGTs结构特征
How to remove the latencySonicationDetergent : Toxon-X Brij-58…
Pore-forming peptides: FilipinAlamethicin…6
UGTs酶分类—催化反应类型•O-GlucuronideHydroxyl (alcohol, phenol) Carboxylic acid
•N-Glucuronide
Amine, AmideSulfonamide
•S-Glucuronide
Sulfhydryls(e.g. thiols) •C-Glucuronide
1,3-dicarbonyls
OHAcNH
OH
OPhO
OCONH2
ONH2
OH2NSO2NHNN
OMe
OMeNN
SHCH3
NNO
OPh
Ph
UGTs酶分类-基因相似性The UDP-glucuronosyltransferases(UGTs) are a superfamilywhich comprised of 2 families (UGT1 and UGT2) and 3 subfamilies (UGT1A, UGT2A, and UGT2B)
41%59%
66%
78%85%87%90%94%67%71%93%94%93%89%83%UGT1UGT2UGTBAUGT1A5UGT1A3UGT1A4UGT1A1UGT1A6UGT1A7UGT1A8UGT1A10UGT1A9UGT2B10UGT2B11UGT2B7UGT2B4UGT2B15UGT2B17UGT2A1Fig. Phylogenetictree showing the relationships between the human UGTs.7
UGTs在人体内的分布情况LiverUGT1A1 UGT1A3UGT1A4 UGT1A6UGT1A9 UGT2B4UGT2B7 UGT2B10UGT2B11 UGT2B15
EsophagusUGT 1A7 UGT1A8UGT1A9 UGT1A10UGT2B7 UGT2B10UGT2B15
IntestineUGT1A1 UGT1A4UGT1A8Biliarytissue
UGT1A1 UGT1A3UGT1A4 UGT1A6UGT1A10
StomachUGT1A1 UGT1A3UGT1A6 UGT1A7UGT1A10
KidneyUGT1A9 UGT2B7
BrainUGT1A6 UGT2A1UGT2B7
ColonUGT 1A1 UGT1A3UGT1A4 UGT1A6UGT1A8UGT1A9 UGT1A10UGT2B7
1A1 16%1A3 3%1A4 14%1A6 6%1A9 17%2B4 4%2B7 40%
人体内主要UGTs代谢亚型酶BurchellB. et al. Methods Enzymol. 2005;400:46-57Relative contributions to the glucuronidationof the top 200 drugs prescribed in the United States in 2002 by human UGTs
Relative contributions to the glucuronidationof the top 200 drugs prescribed in the United States in 2002 by human liver UGTs
Williams J.A. et al. DMD 2004; 32:1201-08