水质 粪大肠菌群(一般水样)测定作业指导书

水质粪大肠菌群（一般水样）测定作业指导书

1含义及执行标准

1.1含义

粪大肠菌群基本性状与总大肠菌群相似，属于总大肠菌群的一部分。在培养温度为37℃时可检出总大肠菌群的存在，为区别存在于自然环境和温血动物肠道内的粪源性大肠菌群细菌，将培养温度提高倒44.5℃，仍能使乳糖发酵产酸产气的总大肠菌群为粪大肠菌群。一般水样特指除医院污水外的各种水样。本实验通过定性区别实验产酸产气，检索MPN表，导出定量的粪大肠菌群结果。

1.2方法原理

多管发酵技术是以最可能数（most probable number，简称MPN）来表示试验结果的。它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN表获得结果的。

1.3水环境质量标准

表1-1 粪大肠菌群地表水环境质量标准（GB 3838-2002）

表1-2 粪大肠菌群农田灌溉水质标准（GB 5084-2005）

a 加工、烹调及去皮蔬菜

b 生食类蔬菜、瓜类及草本水果

表1-3 粪大肠菌群畜禽养殖污染物排放标准（GB 18596-2001）

2分析方法

2.1方法名称、方法来源及适用范围

方法名称：多管发酵法

方法来源：水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）(HJ/T 347─ 2007) 方法适用范围：此法适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。

2.2仪器

高压蒸汽灭菌器

电热干燥箱

恒温培养箱

冰箱

采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。

2.3 标准菌株制备

将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培养液中培养对照控制。必须包括大肠埃希氏菌、产气场杆菌和山夫登堡沙门氏菌三种对照。接种完后需记录：母种的来源，母种和工作种的保存方法、保存温度、传代间隔时间、生长培养基及孵育条件，确认试验（存活度、纯度、关键诊断指标等），母种到工作种的传代代数。

2.4培养基

2.4.1 单倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌配制，用定量加液器分装每个试管10ml，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。

2.4.2 三倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌比例，三倍配制（蒸馏水除外），用定量加液器分装每个试管5ml或每个大试管50mL，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。

2.4.3 EC培养液：市售EC培养基，按铭牌配制，在115℃灭菌20min，用定量加液器分装每个试管10ml，加塞，贮存于暗处备用。

2.4.4 培养基存放于带紫外灯的灭菌物品专用贮藏柜中，当培养基颜色变化，或体积明显变化时废弃不用。

2.5分析步骤

2.5.1 水样接种量

将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL 或0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。使用的水样量可参考下表2。

如接种体积为10mL ，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL ；如接种量为1mL 或少于1mL ，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL 中。 2.5.2 初发酵试验

吸取适量水样，按相应的比例将其制成1：10和1：100或其他稀释比的稀释样。将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在37℃±0.5℃下培养24h ±2h 。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。

1:10稀释样品的制作方法为：吸取1mL 水样，注入到盛有9mL 灭菌水的试管中，混匀，制成1:10稀释样品。因此，取1mL1:10稀释样品，等于取0.1mL 水样。其它稀释比的稀释样品同法制作。

样品为地表水、废水时，取三个接种量，每个接种量的样品分别接种于5个试管内，共需15个试管。样品为地下水时，取三个接种量，首个接种量为100mL,其他每个接种量的样品分别接种于5个试管内，共需12个试管。

试管内乳糖蛋白胨培养液的浓度与体积应根据接种量确定。若接种量为100mL ，倒取100mL 样品接种于装有50mL 三倍浓度乳糖蛋白胨培养液的大试管内；若接种量为10mL ，吸取10mL 样品接种于装有5mL 三倍浓度乳糖蛋白胨培养液的试管内；若接种量为1mL 时，吸取1mL 样品接种于装有10mL 普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内；若接种量少于1mL 时，吸取1mL 稀释样品接种于装有10mL 普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内。 2.5.3 复发酵试验

轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。在44.5℃±0.5℃温度下培养24h ±2h （水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。接种后所有发酵管必须在30min 内放进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。 3 结果的计算

根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从表3 或表4中查得每升水样中的粪大肠菌群。接种水样为100mL2 份、10mL10 份、总量300mL 时，查表3 可得每升水样中的粪大肠菌群；接种5份10mL 水样、5 份1mL 水样、5 份0.1mL 水样时，查表4求得MPN 指数，MPN 值再乘10，即为1L 水样中的粪大肠菌群。

10(mL)

MPN MPN mL =⨯

值指数接种量最大的一管（）

表3、表4 见附件 4质量控制要求 4.1对照控制

采用无菌水作全过程对照控制，当有明显杂菌污染时，表明测定过程某环节无菌性失控，应重新检验；采用阳性、阴性菌株作实验室过程对照控制，当阳性菌株不能生长或阴性