水质 粪大肠菌群(一般水样)测定作业指导书
常州市武进区环境监测站作业指导书 文件编号：WJES/QZ-0057-2003 名称：水质 粪大肠菌群（一般水样）测定作业指导书 第1页 共 5页
1 水质 粪大肠菌群（一般水样）测定作业指导书
1 含义及执行标准 1.1 含义 粪大肠菌群基本性状与总大肠菌群相似，属于总大肠菌群的一部分。在培养温度为37℃时可检出总大肠菌群的存在，为区别存在于自然环境和温血动物肠道内的粪源性大肠菌群细菌，将培养温度提高倒44.5℃，仍能使乳糖发酵产酸产气的总大肠菌群为粪大肠菌群。一般水样特指除医院污水外的各种水样。本实验通过定性区别实验产酸产气，检索MPN表，导出定量的粪大肠菌群结果。 1.2 方法原理 多管发酵技术是以最可能数（most probable number，简称MPN）来表示试验结果的。它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN表获得结果的。 1.3 水环境质量标准 表1-1 粪大肠菌群地表水环境质量标准 （GB 3838-2002） 类 别 Ⅰ类 Ⅱ类 Ⅲ类 Ⅳ类 Ⅴ类 标准值（个/L） ≤200 ≤2000 ≤10000 ≤20000 ≤40000 表1-2 粪大肠菌群农田灌溉水质标准 （GB 5084-2005） 类 别 水作、旱作 蔬菜 标准值（个/L） ≤40000 ≤20000a，10000b a 加工、烹调及去皮蔬菜 b 生食类蔬菜、瓜类及草本水果 表1-3 粪大肠菌群畜禽养殖污染物排放标准 （GB 18596-2001）
类 别 污水排放 标准值（个/L） ≤10000 2 分析方法 2.1 方法名称、方法来源及适用范围 方法名称：多管发酵法 方法来源：水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法（试行）(HJ/T 347─ 2007) 方法适用范围：此法适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。 2.2 仪器 高压蒸汽灭菌器 常州市武进区环境监测站作业指导书 文件编号：WJES/QZ-0057-2003 名称：水质 粪大肠菌群（一般水样）测定作业指导书 第2页 共 5页
2 电热干燥箱 恒温培养箱 冰箱 采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。 2.3 标准菌株制备 将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培养液中培养对照控制。必须包括大肠埃希氏菌、产气场杆菌和山夫登堡沙门氏菌三种对照。接种完后需记录：母种的来源，母种和工作种的保存方法、保存温度、传代间隔时间、生长培养基及孵育条件，确认试验（存活度、纯度、关键诊断指标等），母种到工作种的传代代数。 2.4 培养基 2.4.1 单倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌配制，用定量加液器分装每个试管10ml，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 2.4.2 三倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌比例，三倍配制（蒸馏水除外），用定量加液器分装每个试管5ml或每个大试管50mL，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 2.4.3 EC培养液：市售EC培养基，按铭牌配制，在115℃灭菌20min，用定量加液器分装每个试管10ml，加塞，贮存于暗处备用。 2.4.4 培养基存放于带紫外灯的灭菌物品专用贮藏柜中，当培养基颜色变化，或体积明显变化时废弃不用。 2.5 分析步骤 2.5.1 水样接种量 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL 或0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。使用的水样量可参考下表2。 表2 接种用水量参考表 水样种类 接种量(mL）
10 1 0.1 10-2 10-3 10-4 10-5 井水 × × × 河水、塘水 × × × 湖水、塘水 × × × 城市原污水 × × × 常州市武进区环境监测站作业指导书 文件编号：WJES/QZ-0057-2003 名称：水质 粪大肠菌群（一般水样）测定作业指导书 第3页 共 5页
3 如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL；如接种量为1mL 或少于1mL，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL中。 2.5.2 初发酵试验 吸取适量水样，按相应的比例将其制成1：10和1：100或其他稀释比的稀释样。将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在37℃±0.5℃下培养24h±2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。 1:10稀释样品的制作方法为：吸取1mL水样，注入到盛有9mL灭菌水的试管中，混匀，制成1:10稀释样品。因此，取1mL1:10稀释样品，等于取0.1mL水样。其它稀释比的稀释样品同法制作。 样品为地表水、废水时，取三个接种量，每个接种量的样品分别接种于5个试管内，共需15个试管。样品为地下水时，取三个接种量，首个接种量为100mL,其他每个接种量的样品分别接种于5个试管内，共需12个试管。 试管内乳糖蛋白胨培养液的浓度与体积应根据接种量确定。若接种量为100mL，倒取100mL样品接种于装有50mL三倍浓度乳糖蛋白胨培养液的大试管内；若接种量为10mL，吸取10mL样品接种于装有5mL三倍浓度乳糖蛋白胨培养液的试管内；若接种量为1mL时，吸取1mL样品接种于装有10mL普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内；若接种量少于1mL时，吸取1mL稀释样品接种于装有10mL普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内。 2.5.3 复发酵试验 轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。在44.5℃±0.5℃温度下培养24h±2h（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。接种后所有发酵管必须在30min 内放进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。 3 结果的计算 根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从表3 或表4中查得每升水样中的粪大肠菌群。接种水样为100mL2 份、10mL10 份、总量300mL 时，查表3 可得每升水样中的粪大肠菌群；接种5份10mL 水样、5 份1mL 水样、5 份0.1mL 水样时，查表4求得MPN 指数，MPN 值再乘10，即为1L水样中的粪大肠菌群。 10(mL)MPNMPNmL值指数
接种量最大的一管（）
表3、表4 见附件 4质量控制要求 4.1对照控制 采用无菌水作全过程对照控制，当有明显杂菌污染时，表明测定过程某环节无菌性失控，应重新检验；采用阳性、阴性菌株作实验室过程对照控制，当阳性菌株不能生长或阴性常州市武进区环境监测站作业指导书 文件编号：WJES/QZ-0057-2003 名称：水质 粪大肠菌群（一般水样）测定作业指导书 第4页 共 5页
4 菌株生长时，表明测定过程某环节失控，应重新检验。 4.2精确度 同一实验人员所作前15个阳性水样平行双样结果为X1i、X2i（X1i、X2i＞0，i＝1，2，…，15），则精确度判断值＝R27.3。
（ ，iiiXXR21loglog ）
当分析所得21loglogXXR＞R27.3表示精密度已失控；否则平行双样的差距可以接受。 5 数据处理 5.1数据审核 分析结果填写原始记录表与样品送检单，应经科室内部校对、审核后，方可上交。 5.2数据填报 粪大肠菌群报告以个/L单位填报，当数量在100以内按实有数据报告；大于100采用二位有效数字报告，有效数字后面的数值以四舍五入方法计算，为缩短数字后面的零数可用10的指数形式表示（如报告16，000或1.6×104）。 6 样品采集 6.1采样瓶应经高压或干热灭菌处理后方可使用； 6.2样品含有余氯时采样瓶灭菌前应加脱氯剂，即于500mL采样瓶中加入0.3mL10%硫代硫酸钠溶液； 6.3样品含铜锌等重金属较高时采样瓶灭菌前应加螯合剂，即于500mL采样瓶中加入1.0mL15%乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液； 6.4 同一地点同时采多瓶水样时，细菌学检验水样先采； 6.5采样时，采样瓶不得用水样荡洗； 6.6采样后，样品应2小时内检验，否则，应10℃以下保存且不超过6小时。 7 期间核查 7.1 人员素质 首先要参加省上岗证理论考试，理论考试合格后方能上岗。同时站内进行操作技能考核、培训，考核合格后方能持证上岗，承但本项分析。按国家和省环境监测中心的要求，须要进行五年换证的理论考试、操作技能考核。 7.2 仪器设备 臭氧杀菌效果、高压锅压力表指示、恒温培养箱温控情况每年由站质管中心组织持证人员检验、校正，玻璃量具每三年由站质管中心组织持证人员校正。 8分析环境条件控制 8.2仪器设备
15115/)(iiRR常州市武进区环境监测站作业指导书 文件编号：WJES/QZ-0057-2003 名称：水质 粪大肠菌群（一般水样）测定作业指导书 第5页 共 5页
5 保持实验室环境整洁，定期检查，避免恒温培养箱温控失控，做好仪器设备使用和保养记录。 8.3无菌室 定期采用消毒剂清洁无菌室，定期检查臭氧杀菌效果，保证无菌室微生物实验条件的满足。 8.4分析环境条件检查和记录 每次分析样品时，作无菌室空气细菌培养对照，保证无菌室空气微生物学质量，并做好记录。
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水质 总大肠菌群的测定
水质总大肠菌群的测定多管发酵法方法学报告起始日期：2018年月日结束日期：2018年月日一、实验目的掌握水中总大肠菌群的测定方法及原理。
二、依据标准文献GB/T 5750.12-2006生活饮用水标准检验方法微生物指标 2 多管发酵法三、适用范围生活饮用水及水源水总大肠菌群的测定。
四、方法原理总大肠菌群是指一群需氧及兼性厌氧的,在37℃生长时能使乳糖发酵,在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
多管发酵法的原理是根据统计学理论，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数，估计水体中大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
试验结果以最可能数，简称MPN 表示。
计算出数量/L。
（most probable number）五、仪器设备(1)立式压力蒸气灭菌器型号：YXQ-LS-50SII 容积：50升(2)恒温培养箱，超净工作台。
(3)酒精灯、镍铬丝接种棒。
(4)培养皿（直径100mm）、试管（5×150mm），吸管（1、5、10mL）、烧杯(5)（200、500、2000mL）、锥形瓶（250、1000mL）、采样瓶。
六、试剂材料培养基：乳糖蛋白胨培养液、伊红美蓝培养基，营养琼脂。
七、实验步骤 1. 试验准备乳糖蛋白胨培养液：按瓶上标志配制好液体培养基后，取10支20毫升试管，5支30毫升试管，内置小导管。
5支30毫升试管加入10 mL 2倍浓度的乳糖蛋白胨培养液，10管加入10 mL 单倍浓度的乳糖蛋白胨培养液，试管加硅胶塞。
伊红美蓝培养基：按瓶上标志配制好300 mL 液体培养基后，倒入锥形瓶500mL 中，加硅胶塞。
营养琼脂：按瓶上标志配制好200mL 液体培养基后，倒入锥形瓶500mL 中，加硅胶塞。
取采样瓶多个，接种棒，培养皿35对，密封包装。
以上物品材料于 121℃高压灭菌器中灭菌 30min 备用。
2. 样品测定取500mL 锥形瓶内的营养琼脂液体培养基，倒入约20mL 灭菌好的培养皿中，超净工作台不同位置各放1对，共10对，操作间不同位置各各放1对，共10对。
水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 多管发酵法
水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定多管发酵法1. 原理总大肠菌群和粪大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。
试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN表示。
2. 仪器(1)高压蒸气灭菌器。
(2)恒温培养箱、冰箱。
(3)生物显微镜、载玻片。
(4)酒精灯、3mm接种环。
(5)培养皿（直径100mm）、试管（5×150mm），吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶、移液枪。
3. 培养基及染色剂的制备3.1 乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。
3.2 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。
除蒸馏水外，各组份用量增加至三倍。
3.3伊红美蓝培养基：①贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解。
再加2.0g邻酸二氢钾及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL，调节溶液pH值为7.2～7.4。
趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀后定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，于121℃高压灭菌15min，贮于冷暗处备用。
②平皿培养基的制备：将上述制备的贮备培养基融化。
根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液（0.4g伊红溶于20mL水中）和一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液（0.065g美蓝溶于13mL 水中），加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。
粪大肠菌群的测定演示文稿(精)
MPN值
MPN指数
1（0 mL） 接种量最大的一管（mL）
• 表3 最可能（MPN） 表
作业
1. 为什么说提高温度培养出的大肠菌群更能代表水质受粪 便污染的情况？
2. 根据试验情况，报告每升水中含粪大肠菌群的数目。
谢谢！
• 表1 接种水量参考表
• 由于本次测定的是污水处理厂的出水水样，所以选取的 浓度梯度为10-3、10-4、10-5。
（2） 乳糖蛋白胨培养基分装
如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨 培养液5mL；如接种量为1mL或少于1mL，则可接种于普通浓度的 乳糖蛋白胨培养液10mL中。
蛋白胨
10g
牛肉膏
3g
乳糖
5g
氯化钠
5g
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液
1mL
蒸馏水
1000mL
制法：
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，
调节pH 为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，
分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在115
℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
10 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
原液
90 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 无菌水 无菌水 无菌水 无菌水 无菌水
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
3.3 粪大肠菌群的初发酵
10-3
10-4
10-5
杜 氏 小 管 10ml 3倍
杜 氏 小 管
10 ml 1倍
杜 氏 小 管 10 ml 1倍
职业教育环境监测与治理技术专业教学资源库
水中大肠菌群的测定
实验水中大肠菌群的测定及结果分析一、目的要求1、学习测定水中大肠菌群检测程序、方法.2、掌握大肠菌群检测结果的报告方式.二、实验原理大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标,也是反映水体被生活无水污染的一项重要监测项目。
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌,在37℃生长时，能在48小时发酵乳糖并产酸才产气。
食品中大肠菌群数是以每100mL（g)检样内大肠菌群最近似数(The most probable number，简称MPN）表示。
据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群均以100mL(g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值为报告标准。
检查大肠菌群数,一方面能表明食品中有无粪便污染，另一方面还可以根据数量的多少，判定食品受污染的程度。
我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过3个。
多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管.乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
三、实验器材1、培养基：乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂、乳糖发酵管2、器皿：1ml吸管、10ml吸管、试管（15×150）、三角锥瓶500ml、三角锥瓶500ml（内装蒸馏水250ml）3、其他：酒精灯，牛皮纸或报纸,棉花，高压蒸汽菌锅，水浴锅，显微镜，香柏油，二甲苯等四、操作方法1、水样的采取池水、河水或湖水应取距水面10—15㎝的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中,然后翻转过来,除去玻璃塞，水即流入瓶中,盛满后,将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查,否则需放入冰箱中保存.2、检样稀释（1)以无菌操作，将检样25mL放于含有225mL灭菌蒸馏水水的三角锥瓶中，摇匀,做成1：10的均匀稀释液。
(2）取一支lmL吸管插入吸取1∶10稀释液1mL注入含有9mL灭菌水的试管内，振摇试管,混合均匀，做成1∶100稀释液。
粪大肠菌群操作细则
粪大肠菌群多管发酵法1、培养基、试剂与仪器本标准所用试剂除另有注明外,均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。
单倍乳糖蛋白胨培养液：称取23.0g乳糖蛋白胨营养液于1L蒸馏水中,加热煮沸至完全,分装于含有倒置的小玻璃管的试管中,每试管约8ml〔先用移液管吸取7ml至试管中,再用滴管吸取营养液放至小玻璃管中,直至营养液溢出。
注意小玻璃管中不能有气泡,若出现气泡,应将气泡排出后再注入营养液。
,于高压蒸汽灭菌器中,在115℃灭菌20min,贮存于暗处备用。
EC 培养液：称取37.0gEC肉汤于1L蒸馏水中,加热煮沸至完全,分装于含有倒置的小玻璃管的试管中,每管8ml〔操作方法同单倍乳糖蛋白胨营养液,于高压蒸汽灭菌器中,在115℃灭菌20min,贮存于暗处备用。
培养基的存放在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处,存放时应避免阳光直接照射,并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。
当培养液颜色变化,或体积变化明显时废弃不用。
验所需仪器超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、冰箱、酒精灯、天平、电炉、500ml广口瓶、烧杯、玻璃棒、玻璃发酵管、试管架、移液管、移液枪、接种环2步骤前期准备器皿灭菌〔高压蒸汽灭菌：所用采集水样的广口瓶、玻璃试管、移液管、玻璃棒、接种环、移液枪枪头等器皿均需放入高压锅灭菌。
广口瓶：将清洗干净的采样瓶盖好瓶盖,用牛皮纸、报纸等防潮纸将瓶盖、瓶顶和瓶颈处包裹好,用绳子绑好,置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。
玻璃试管〔已经装好营养液、移液管、玻璃棒、接种环、移液枪枪头：用牛皮纸、报纸等防潮纸将其包裹好,置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。
采样：采取水样时,可握住瓶子下部直接将已灭菌的带盖采样瓶插入水中,约距水面10~15cm处,拔瓶盖,瓶口朝水流方向,使水样灌入瓶内然后盖上瓶盖,将采样瓶从水中取出。
如果没有水流,可握住瓶子水平前推,直到充满水样为止。
大肠菌群计数检验指导
例： 10-4样品稀释液1mL ，在VRBA平板上有100个典 型和可疑菌落 ，挑取其中10个接种BGLB肉汤管 ，证 实有6个阳性管 ，则该样品的大肠菌群数为：
100×6/10×104/g（ mL）=6.0×105CFU/g（ mL）。
· 胆盐可以抑制其它细菌生长繁殖。 · 分解乳糖产酸产气的大肠菌群 ，看小倒管中的气体。
杜氏发酵管产气情况
1 产气
2
不产气
第四天： 大肠菌群计数报告
第一法： 确证大肠菌群LST阳性管数 ， 检索
MPN表（见附录） ，报告每g（mL）样 品中大肠菌群的MPN值。
第二法： 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以结晶
· 从10-2取样1ML+9 ML生理盐水=1：1000，从10-3取 样1ML ，接种到3管LST中。
第二法： 检样稀释与平板计数
检样稀释： 同上。 平板计数： 1 、每个稀释度接种2个无菌平皿 ，每皿1mL稀
释样品 ， 另外一个平皿加1mL生理盐水作空 白对照。 2 、及时将15—20mLVRBA（结晶紫中性红胆 盐琼脂） 倾注每个平皿中。 3 、待琼脂凝固后 ，再加3—4mLVRBA覆盖表 层 。翻转平板培养。
· MPN： 表示食品中大肠菌群数是以每100ML或克检样内大肠菌 群最大可能数 。一般采用9管法.
· 一般样品25ML（克）+225ML生理盐水=1： 10，从 10-1取样1ML ，接种到3管LST（月桂基硫酸盐胰蛋白 胨肉汤） 中。
· 从10- 1取样1ML+9 ML生理盐水=1：100，从10-2取样 1ML ，接种到3管LST中。
水质粪大肠菌群的测定标准2007
本电子版为发布稿。
请以中国环境科学出版社出版的正式标准文本为准。
HJ 中华人民共和国环境保护行业标准HJ/T347─ 2007水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）Water quality—Determination of fecal coliform—manifold zymotechnicsand filter membrane（发布稿）2007-03-10发布2007-05-01实施国家环境保护总局发布I目次HJ/T 347—2007前言 (Ⅱ)第一篇多管发酵法1 适用范围 (1)2 原理 (1)3 培养基和试剂 (1)4 步骤 (2)5 结果的计算 (2)第二篇滤膜法1 适用范围 (4)2 原理 (4)3 培养基和试剂 (4)4 步骤 (5)5 结果的计算 (6)水质粪大肠菌群的测定粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便。
在44.5℃温度下能生长并发酵乳糖产酸产气的肠菌群称为粪大肠菌群。
用提高培养温度的方法，造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的条件，使养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群，从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。
粪大肠菌群的测定可以用多管发酵法和滤膜法。
第一篇多管发酵法1 适用范围本标准适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。
2 原理多管发酵法是以最可能数（most probable number）简称MPN 来表示试验结果的。
实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。
不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。
因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数，要根据所要求数据的准确度而定。
3 培养基和试剂本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。
水中大肠菌群的检测
水中大肠菌群的检测一、实验目的1、了解大肠菌群数量与水质状况的关系。
2、了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义。
3、掌握大肠菌群对人体健康的影响以及作为水体评价的指标和对象。
4、学习检测水中大肠菌群的方法。
二、实验原理1、大肠菌群大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，周身鞭毛，能运动，无芽孢。
主要生活在大肠内。
在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。
大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。
所以在平常外界环境中不能正常存活很长。
在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。
若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。
因此，大肠菌群数（或大肠菌值）常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。
（国家规定，每升饮用水中大肠杆菌数不应超过3个）2、初发酵试验发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置杜氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为PH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。
溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。
水样接种于发酵管内，37℃下培养：（1）24h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，疑为阳性结果；（2）在量少的情况下，也可能延迟48h后才产酸产气，此时应视为可疑结果。
以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。
（3）48h后仍不产气的为阴性结果。
3、MPN - 概述最大或然数(most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。
其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。
本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。
粪大肠菌群检测
粪大肠菌群检测一、室所用设备、器皿1、无菌区工作台2、恒温培养箱3、高压蒸汽灭菌器4、冰箱5、酒精灯6、天平7、电炉8、采样广口瓶9、烧杯、玻璃棒10 、玻璃发酵管11、试管架12、移液管13、锥形瓶二、药品:乳糖胆盐培养基三、前期准备1、玻璃器皿灭菌(高压蒸汽灭菌)所用采集水样的广口瓶、玻璃试管、移液管、玻璃棒、锥形瓶等玻璃器皿均需放入高压锅灭菌。
广口瓶:将清洗干净的采样瓶盖好瓶盖,用牛皮纸、报纸等防潮纸将瓶盖、瓶顶和瓶颈处包裹好,用绳子绑好,置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。
玻璃试管、移液管、玻璃棒:用牛皮纸、报纸等防潮纸将其包裹好,置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。
2、采样采取水样时,可握住瓶子下部直接将已灭菌的带盖采样瓶插入水中,约距水面10~15cm处,拔瓶盖,瓶口朝水流方向,使水样灌入瓶内然后盖上瓶盖,将采样瓶从水中取出。
如果没有水流,可握住瓶子水平前推,直到充满水样为止。
采好水样后,迅速盖上瓶盖和包装纸。
采好的水样,应迅速运往实验室,进行检验,一般从取样到检验不宜超过2h,否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品,但不得超过6h。
四、实验步骤(多管发酵法)1、配制乳糖胆盐培养基试制(注:做15管的话,10ml的要配双料的,如:30g配1000ml,就应称取60g配1000ml,其他1ml、0.1ml的配制成单料的),配制试剂时不用定容,只需大概体积即可。
2、称取12g乳糖胆盐培养基溶于200ml蒸馏水中,置于电炉上加热至溶解完全为止,冷却至室温后,分装于玻璃发酵管里。
(5管10ml)3、称取6g乳糖胆盐培养基溶于100ml蒸馏水中,置于电炉上加热至溶解完全为止,冷却至室温后,分装于玻璃发酵管里。
(10管10ml)5、所有发酵管盖好盖子,包裹好置于高压锅灭菌15 分钟(第一次曝气开始计时)6、分别加入5管10ml、5管1ml、5管0.1ml的水样于已冷却至室温的发酵管中,并置于恒温培养箱里培养24小时(温度为44.5℃)五、结果根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目,从MPN表中查得相应的MPN 指数,按总大肠菌群的计算方法计算每升水中粪大肠菌群细菌的MPN值。
水中粪大肠菌群检测的基本流程
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