反义核苷酸的研究
Chk1反义寡核苷酸影响胶质瘤放疗敏感性的研究
Chk1反义寡核苷酸影响胶质瘤放疗敏感性的研究【摘要】目的：观察转染chk1反义寡核苷酸(ason)后，对照射后u251细胞株中chk1表达、细胞周期及细胞凋亡的影响。
方法：采用脂质体转染法，chkl的正义、反义寡核苷酸对u251细胞株进行chkl转染。
以放射线照射后，测定其细胞周期和凋亡率变化，比较chkl转染正义链和反义链对细胞放射敏感性的不同。
用western blot法检测chk1蛋白，real time pcr检测chk1 mrna表达。
结果：转染chk1反义寡核苷酸后，能明显下调chk1蛋白和mrna的表达，显著增强放射线诱导的肿瘤细胞凋亡，并消除细胞周期阻滞。
结论：反义核酸技术灭活chk1基因显著增强放疗诱导的u251细胞凋亡，为增敏胶质瘤的放射治疗提供了理论依据。
【关键词】胶质瘤；细胞周期检测点激酶；反义寡核苷酸；放射敏感性transfection of chk1 antisense oligonucleotide to glioma increases the apoptotic sensitivity to irradiation/li yong，lai run-long， tan dian-hui，et al.//medical innovation of china，2012，9(13)：003-005【abstract】 objective：effect on expression of chk1 and changes of cell cycle after radiation in u251 cell line with antisense oligodeoxynucleotide (ason) wereobserved.methods：the u251 cell line was transfected with chk1 sense and antisense chain-lipofectamine plus complex. thenirradiated it and measured the changes of the cell cycle and apoptosis in order to compare the diference between the chk1 sense and antisense chain. the expression of chk1 was measured by western blot， and chk1 mrna was measured by real time pcr.results：the expression of chk1 protein and mrna markedly decreased after ransfecting u251 cell line with chk1 antisense oligonucleotide.transfecting u251 cell line with chk1 antisense oligonucleotide could increase apoptosis significantly and decrease cell cycle arrest markedly induced by irradiation.conclusion：the sensitivity to apoptosis is excessively increased after treated with irradiation by transfection of chk1 antisense oligonucleotide to glioma. this can be the theoretical basis for increasing the apoptotic sensitivity to irradiation of glioma.【key words】 glioma; checkpoint kinase; antisense oligonucleotide; irradiationfirst-author’s address：first affiliated hospital of shantou university medical college，shantou 515041，china doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.13.002目前研究认为，细胞周期检测点信号传导通路主要由atm/atr-chk1/2-cdc25a、cdc25b、cdc25c-cdk轴组成[1]，chk1是细胞周期检测点信号中最关键的效应蛋白激酶[2]。
反义寡核苷酸探针
反义寡核苷酸探针反义寡核苷酸探针：在基因研究和诊断中的应用摘要：反义寡核苷酸探针是一种重要的分子生物学工具，广泛应用于基因研究和临床诊断中。
本文将介绍反义寡核苷酸探针的定义、原理、制备方法及其在基因研究和诊断中的应用，并讨论其优缺点以及未来发展方向。
引言：反义寡核苷酸探针是一种特异性高、灵敏度好的分子生物学工具，在基因研究和诊断领域中得到广泛应用。
它通过与目标基因序列互补配对，具有高度特异性，可以检测特定的基因突变、基因扩增和基因表达水平等。
在基因研究和临床诊断中发挥着重要作用。
一、反义寡核苷酸探针的定义和原理反义寡核苷酸探针是一种寡聚核苷酸序列，与目标序列互补配对，通常长度为15-30个碱基。
根据扩增特异性的要求，可以设计用于引物延伸、PCR、测序等各种基因研究和诊断方法中。
反义寡核苷酸探针的原理是通过与目标序列互补配对，形成稳定的双链结构，并使用荧光或放射标记等方式进行检测。
二、反义寡核苷酸探针的制备方法1. 化学合成法：利用化学合成的方法，通过固相合成技术制备反义寡核苷酸探针。
这种方法可以精确控制探针序列和长度，并可以在探针上引入荧光分子或标记物。
2. 酶法合成：通过利用DNA聚合酶合成反义寡核苷酸探针，该方法具有高效、经济等优点，但对于较长的探针序列，需要考虑到合成效率和错误率等因素。
三、反义寡核苷酸探针在基因研究中的应用1. 基因突变检测：反义寡核苷酸探针可以帮助检测基因突变，如单核苷酸多态性（SNP），缺失、插入或替换等突变。
2. 基因表达水平检测：通过对特定基因序列进行反义寡核苷酸探针的设计，可以检测该基因在不同组织或疾病样本中的表达水平，从而探究其在生物学、疾病发生发展中的作用。
3. 基因扩增和测序：在PCR扩增和测序中，反义寡核苷酸探针可用作引物，参与扩增过程，放大目标序列，并为测序提供可靠的检测信号。
四、反义寡核苷酸探针在临床诊断中的应用1. 遗传疾病的检测：反义寡核苷酸探针可用于遗传性疾病的检测，包括染色体异常、基因突变等。
反义寡核苷酸作用机理
反义寡核苷酸作用机理
反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides，ASOs）是一种人工合成的核酸序列，其作用机理是通过碱基互补配对原则与特定的信使RNA（mRNA）结合，从而抑制基因的表达。
反义寡核苷酸的作用机理主要涉及以下几个方面：
抑制DNA复制和转录：反义寡核苷酸可与双链DNA通过Hoogsteen氢键结合形成三螺旋结合，以交联、切断等方式使之不能进一步复制和转录。
此外，反义寡核苷酸也可与复制和转录时解链的双链DNA的局部单链结合，抑制DNA的复制和转录。
抑制转录后加工：反义寡核苷酸可与mRNA靶序列通过Waston-Crick碱基配对结合，干扰mRNA的进一步加工成熟，发挥其抑制作用。
抑制翻译：经转录后加工成熟的mRNA必须从细胞核转至细胞质中，与核糖体和重要的启动因子结合，使蛋白质合成过程开始。
而反义寡核苷酸可与mRNA结合，由于直接的立体效应，影响核糖体和重要的启动因子结合，使蛋白质合成过程停止。
激活RNaseH：RNaseH是一种专一性降解DNA/RNA杂交链中RNA链的核酸酶。
反义寡核苷酸与靶RNA杂交后可被RNaseH识别并切割，从而加速RNA的降解。
总之，反义寡核苷酸的作用机理主要通过与特定基因或mRNA互补结合，抑制基因的表达。
其作用机制涉及多个环节，包括抑制DNA复制和转录、干扰mRNA加工成熟、抑制蛋白质合成以及激活RNaseH等。
反义寡核苷酸作为一类具有广泛应用前景的基因靶向治疗药物，对肿瘤、病毒感染等疾病的治疗具有重要意义。
Daxx反义寡核苷酸在全脑缺血／再灌损伤中作用机制的研究
Daxx反义寡核苷酸在全脑缺血／再灌损伤中作用机制的研究目的檢测Daxx反义寡核苷酸在大鼠海马全脑缺血/再灌介导的神经元损伤中作用机制的研究。
方法采用SD大鼠四动脉结扎全脑缺血模型，于缺血前连续3d脑室注射Daxx反义寡核苷酸，用免疫印迹方法研究Daxx反义寡核苷酸在大鼠海马全脑缺血/再灌介导的神经元损伤中对Daxx/Ask1信号通路的影响。
结果在海马的CA1区，Daxx反义寡核苷酸可以明显抑制脑缺血介导的Daxx的核转位以及Ask1磷酸化的升高。
结论缺血前3d连续脑室注射Daxx反义寡核苷酸可以明显抑制Daxx/Ask1介导细胞信号转导通路。
标签：脑缺血/再灌；反义寡核苷酸；Daxx；Ask1脑血管疾病是神经系统的常见病，因此研究其发病的分子机制具有极其重要的意义[1]。
死亡结构域相关蛋白（death domain associated protein，Daxx）在核内作为转录调控子发挥促凋亡作用[2]，在各种凋亡刺激下，Daxx可以从胞核转移到胞浆中，从而启动不同的细胞信号转导通路引起细胞的凋亡。
凋亡信号调节激酶1（Apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）是MAPKKK家族中的一个成员，可以分别激活MKK4/7-JNK和MKK3/6- p38信号通路[3-5]而引起细胞的凋亡。
在脑缺血信号转导中ASK1信号级联反应是重要的致凋亡信号通路[6-8]。
1 资料和方法1.1一般资料雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠，250～300g，清洁级，由徐州医学院实验动物中心和中科院上海实验动物中心提供。
1.2 SD大鼠脑缺血/再灌模型的建立按本室已建立的大鼠四动脉结扎全脑缺血模型，实验动物有机分为假手术组、缺血/再灌组、溶剂对照组和给药组。
动物以20%水合氯醛（300～350mg/kg）腹腔注射麻醉后，分离双侧颈总动脉并电凝椎动脉。
手术第2d动物于清醒状态下结扎双侧颈总动脉，使全脑缺血15min，然后再灌注不同时间。
反义寡核苷酸的药代动力学研究进展
[12] Mamiya K,Ieiro I ,Shimam oto J ,et al .The effects of ge 2netic polym orphisms of CY P2C9and CY P2C19on phenytoin metabolism in Japanese adult patients with epilepsy :studies in stereoselective hydroxylation and population pharmacoki 2netics[J ].Epilepsia ,1998,39(12):1317-1323.[13] K irchheiner J ,Brockm oller J ,Meineke I ,et al .Impact ofCY P2C9amino acid polym orphisms on glyburide kinetics and on the insulin and glucose response in healthy v olunteers[J ].Clin Pharmcol Ther ,2002,71(4);286-296.[14] Leger F ,Seronie 2Vivien S ,Makdessi J ,et al .Impact ofthe biochemical assay for serum creatinine measurement on the individual carboplatin dosing :a prospective study[J ].Eur J Cancer ,2002,38(1):52-56.[15] Frame B ,Miller R ,Lalonde R L.Evaluation of mixturem odeling with count data using NONME M[J ].J Pharma 2cokinet Pharmacodyn ,2003,30(3):167-184.反义寡核苷酸的药代动力学研究进展尚明美综述 刘秀文,汤仲明,陈惠鹏审校(军事医学科学院放射医学研究所,北京 100850)摘要:反义药物在经历了20年后,又迎来了一个蓬勃的发展阶段。
以Survivin为靶点的反义寡核苷酸在肝癌研究中的应用进展
体内肉芽组织新生血管中表达较高，提示Ｓｕｒｖｉｖｉｎ可 能在血管形成的中间环节发挥重要作用。Ｍｅｓｒｉ 等［３一用Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ＡＳ（）ＤＮ作靶向治疗，可以抑制 ＶＥＧＦ介导的内皮细胞保护作用，促进血管内皮细
胞的凋亡和血管的退行性改变。提示，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ可
２
献
Ａ ｎｏｖｅｌ
ａｎｔｉ—ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｎａｔ
Ａｍｂｒｏ ｓｉｎｉ Ｇ，Ａｄｉｄａ Ｃ，Ａｌｔｉｅｒｉ ＤＣ． ｇｅｎｅ．ＳｕｒＶｉＶｉｎ・ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
１９９７．３：９１７—９２１． Ｚａｆｆａｒｏｎｉ ｎｅｗ Ｎ，Ｐｅｎｎａｔｉ ｉｎ
ｃａｎｃｅｒ
ａｎｄ
ｌｙｍｐｈｏｍａ．
Ｍｅｄ，
Ｍ。Ｄａｉｄｏｎｅ ＭＧ．Ｓｕｒｖｉｖｉｎ Ｊ
３反义寡核苷酸技术及其封闭Ｓｕｒ’ｒｉｖｉｎ靶向治疗 的意义
家族中最小的。它的结构非常独特，其Ｎ端只含有 一个杆状病毒ＩＡＰ重复序列（ＢＩＲ），这是其发挥抗 凋亡作用的关键结构域；其羧基末端不含锌指结构 而代之以一个ａ螺旋结构，后者是Ｓｕｒｖｉｖｉｎ与微管 相互作用调节细胞周期的关键位点。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ是迄 今为止发现的作用最强的凋亡抑制因子，它可能通 过抑制终末效应因子ｃａｓｐａｓｅ－３和ｃａｓｐａｓｅ－７来干扰
意义。
参考文
１
近年来研究发现，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达可能与化学治疗
耐药有关［１ ６｜。通过反义技术封闭Ｓｕｒｖｉｖｉｎ的过表
达诱导细胞凋亡，可能干预肿瘤耐药的产生，增强 化学治疗敏感性‘”］。Ｇａｏ等‘”３以脂质体为载体，用
ＡＳＯＤＮ封闭人肝癌耐药细胞株ＳＭＭＣ一７７２１／
ＡＤＭ的Ｓｕｒｖｉｖｉｎ后，肝癌细胞的生长受到明显抑 制，而联合应用化学治疗药物阿霉素（ＡＤＭ）后细胞 的生长抑制作用更为明显，认为ＡＳ（）ＤＮ能降低肝 癌耐药细胞Ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达，增强人肝癌耐药细胞 对ＡＤＭ的化学治疗敏感性。另有学者认为一…，
Survivin反义寡核苷酸诱导人胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡的研究
胞 裸 鼠移 植 瘤 生 长 的影 响 ， 探 讨 其 诱 导 人 胃癌 移 植 瘤 凋 亡 的 分 子 生 物 学 机 制 。方 法 建 立 Ｓ 一 并 ＧＣ
７０ ９ １胃癌 细 胞 裸 鼠 皮 下 移 植 瘤 模 型 ， 机 分 为 ４ 组 ，即 ｓ ｒｉｉ ＡＳ 随 ｕ ｖｖｎ— ０ＤＮ＋ 脂 质 体 组 、 ｕ ｖｖｎ— ｓ ｒ ｉｉ ＡＳ ＯＤＮ 组 、 质 体 组 和 空 白对 照 组 （ 馏 水 ） 脂 蒸 。瘤 体 内 隔 日给 药 ， 药后 ４ 停 ８小 时 处 死 裸 鼠 ， 离 瘤 组 剥
ａ ｌ ｔｍｏ ｐ ｐｏ ｉ Ｗ ＡＮＧ ａ ｂｅ ｕ ｒａ ｏ ｔｓｓ Ｃｈ ｏ— ｑ ｎ，ｅ ａ ． ｕ ｔ １
ｔ ｅ Ｐ． ｈ Ｒ．Ｃｈ ｎ ） ｉａ
（ ｚ ｏ ｅ ｉａ ｌ ｇ ， ｚ ｏ Ｊａ ｇ ｕ ２ １ ０ Ｘｕ ｈ ｕＭ ｄｃ ｌ Ｃｏｌ ｅ Ｘｕ ｈ ｕ，ｉｎ ｓ ２ ０ ２， ｅ
ＡＯ ｓ ＤＮ＋ 脂质 体 组 的 ｓ ｒｉ ｎ蛋 白表 达 量 明 显低 于对 照 组 （ ｕｖｖ ｉ Ｐ＜ ０ ０ ） Ｃ ｓａｅ ３ 白表 达 高 于对 ． ５ ， ａｐｓ 一 蛋
照组 （ Ｐ＜ ０ ０ ） ． ５ 。结 论 ｓ ｒ ｉｉ 义 寡 核 苷 酸 转 染 胃癌 移 植 瘤 能 够 明 显 抑 制 肿 瘤 生 长 ， 主要 机 制 与 ｕｖｖｎ反 其
齐 齐 哈 尔 医学 院学 报 ２ １ ０ ２年 第 ３ ３卷第 １ Ｏ期
・ １２ ５ ６ ・
Ｓ ｒ ｉｉ 义寡 核苷 酸诱 导人 胃癌 细胞 裸 鼠皮 下 ｕｖｖｎ反
移 植 瘤 细胞 凋 亡 的研 究
王超群 郑 茂 金 梁 栋 周 云
【 要】 目的 研 究 ｓ ｒ ｉｉ 摘 ｕ ｖｖｎ反 义 寡 核 苷 酸 （ ｎ ｉｅ ｓ ｌ ｏ ｅ ｘ ｎ ｃｅ ｔｄ ， ＯＤＮ） 人 胃癌 细 ａ ｔ ｎ ｅ０ｉ ｄ ｏ ｙ ｕ １０ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱｅ ＡＳ ｓ ｇ 对
反义寡核苷酸技术原理
反义寡核苷酸技术原理反义寡核苷酸技术，听起来是不是有点高大上？别担心，咱们把这件事情说得简单明了，就像喝水一样轻松。
想象一下，咱们的DNA就像一本厚厚的书，里面记录了我们身体的各种秘密。
有些时候，书里的某些章节写得不太对，可能导致一些疾病、遗传问题或者其它麻烦。
哎，这时候反义寡核苷酸就像是个超级编辑，把这些错误的章节给改正过来，让书本重新焕发光彩。
你想啊，反义寡核苷酸就是一种小小的分子，跟我们的DNA有着千丝万缕的关系。
它们就像调皮的小孩子，专门去找那些“坏”的基因，把它们“禁言”。
这小家伙们的工作原理其实很简单，就是通过与目标mRNA（也就是DNA转录出来的信使分子）结合，阻止这些坏信息被翻译成蛋白质。
就好比你在课堂上把耳塞塞上，听不见老师讲的那些胡话，轻松自在。
这样一来，细胞就不会产生那些引起疾病的蛋白质，健康指数一下子就上升了。
制作反义寡核苷酸可不是随便拿几根材料就能搞定的。
这可是个高精尖的活儿，科学家们得在实验室里反复折腾，设计出针对特定基因的反义寡核苷酸。
有点像是做一道复杂的菜，需要精准的配比和火候。
没错，每个反义寡核苷酸都有它独特的“身份”，只能针对特定的mRNA，所以可不能随便用。
想象一下，做菜的时候如果调料放错了，那可真是翻车呀。
说到这里，咱们来聊聊反义寡核苷酸的应用。
它们可不只是好听而已，实际上在医学上大展拳脚。
比如，某些遗传病、癌症、感染等，反义寡核苷酸都能出一份力。
科学家们正在研究用它们来治疗各种疾病，甚至包括一些现在还没法治的病。
嘿，这可是个大新闻呢，谁能想到这些小小的分子能改变那么多人的命运。
再说了，反义寡核苷酸的技术也在不断进步。
以前的治疗方法往往效果不稳定，很多患者可能会面临副作用。
但反义寡核苷酸就像是个小心肝，温柔又精准。
它们直接锁定问题所在，减少了对正常细胞的伤害。
就像是一个超级医生，开出精准的药方，让病人不再苦苦挣扎。
科研的路上总会有些坎坷。
反义寡核苷酸虽然强大，但也有它的挑战。
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得到新型的化合物----多肽核酸(ｐｅｐｔｉｄｅ
ｃｌｅ ｉｃ ａｃｉｄ, ＰＮＡ)。
ｎｕ
由于结构上 PNA 与 DNA 类似，其两相邻碱基间距 及碱基与类肽链骨架间的距离均相近， PNA 与 DNA 以 及RNA与PNA之间均可形成碱基配对。
第4条途径----偶联物
即综合应用多种化学修饰 ,效果很好,有“第二代
Cycle Diagram
是一种有高度原则性和 低毒性的基因药物，一般为寡核苷酸 类化合物。 反义寡聚核苷酸（antisense oligonucleotides）：是一小段与mRNA 或DNA特异性结合并阻断其基因表达的人 工合成的短核酸片断。
反义RNA调节翻译的基本原理是：
1、反义 RNA与 mRNA 有互补序列，根据碱基互补原则，能
化学修饰方法
第1条途径-------磷酸二酯键的修饰:
磷原子是核酸酶的主要攻击位点 ,修饰后效果明显。 磷的修饰包括硫代、甲基化、氨化、酯化等,尤以硫代 磷酸寡核苷酸 (phosphoroth-ioteoligonucletide,PS-ODN) 最为常用,称为“第一代反义药物”。
PS-ODN 是至今研究最深入、应用最广泛的一类
反义药物”之称。它以 PS-ODN为核心，两翼序列上 的核糖的2’ 位被其它基团修饰。除了化学修饰，还可
以试作转基因表达反义核酸，在体细胞内以DNA为模
板转录产生 , 模拟天然ＲＮＡ的形成过程 , 这样表达的 反义ＲＮＡ可能在细胞内被天然修饰,从而稳定性得到 提高。
Hot Tip
国外已有反义药物应用于临床,Ｓｃｉｅｎｃｅ杂志 1998年7月报道了第一个通过ＦＤＡ认证的反义药物, 即用于治疗艾滋病人巨细胞病毒感染的视网膜炎的 ,这是ISIS公司的一大成果, 此外还有多种反 义药物包括核酶在内的新一代反义药物进入临床。
asODN ，它有效增强了对核酸酶稳定性、具有良好的 水溶性及易于大量合成，基本能满足临床治疗的需要。
第2条途径------核糖的化学修饰:
糖环修饰包括α构型、1’位取代、2’位取代、3’- 3′
连接、5’＿ 5′ 连接等。原理是使核酸酶不能有效识别
磷酸二酯键。 α构型修饰: 是指将天然ＤＮＡ或ＲＮＡ的β型糖苷键替 换成α构型,使核酸酶不能有效地识别其磷酸二酯键。
白质。Βιβλιοθήκη 反义寡核苷酸作为药物比常规药物的治疗有更 高的特异性。
1、有关疾病的靶基因mRNA序列是已知的，因此，设 计、合成特异性的反义核酸比较容易； 2、反义寡核苷酸与靶基因能通过碱基配对原理发生特 异和有效的结合，从而调节基因的表达。 天然的寡核苷酸难以进入细胞内，而一 旦进入又容易被胞内核酸酶水解，很难直接用于治疗。 为此，人们采用药物化学的原理和方法，对天然寡核苷 酸进行 以达到治疗药物的要求。
1’位取代、2’位取代:
指将戊糖的1′ 2′位引入某些取代基。
如烷基、烷化剂等。嵌入特殊功能分子后 , 也使 as ＯＮ具 备更强的核酸酶抗性，但不影响亲和力。
第3条途径-----碱基的化学修饰
基于asON发挥特异性抑制基因表达的关键在于其 碱基排列顺序 , 而与易于降解的磷酸和糖环组成的磷酸 二酯键骨架无关。所以,asOD的磷酸-糖骨架以肽键取代，
相互结合，形成 mRNA- 反义 RNA 杂交体，阻断 mRNA 的翻
译。 2、反义 RNA和 mRNA 的结合可发生在细胞核中，也可发生 在细胞质中。如发生在核中，就会干扰mRNA的加帽和加尾 以及剪接和加工过程，也会干扰mRNA从细胞核向细胞质的
转运。
3、RNA杂交分子不稳定，易被核酸酶降解。 4、反义 RNA与胞质中成熟的 mRNA杂交，抑制其翻译成蛋