乳酸菌检测方法

一、乳酸菌检测方法
植物乳杆菌的检验
1原理
植物乳杆菌能在相应的厌氧培养条件下，于MRS培养基表面生长成白色、细密、圆形光滑突起的菌落，根据长出的菌落数和稀释倍数，计算出活菌数。

2仪器与试药
2.1 仪器
超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温干燥箱、电冰箱、恒温培养箱（60℃±1℃）、恒温水浴锅、显微镜（10x—100x）、架盘天平（0—500g，精确至0.5g）、250ml锥形瓶、250ml 盐水瓶、灭菌吸管：1ml(具0.01ml刻度）、10ml(具0.1ml刻度）、灭菌平皿（直径90mm）、灭菌试管（15mm×160mm）、灭菌L型玻璃棒等。

2.2 试药
酪蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、琼脂等均为生化试剂；无水乙酸钠、柠檬酸三胺、硫酸镁、硫酸锰、葡萄糖、磷酸氢二钾、碳酸钙、吐温-80、氯化钠等均为分析纯；水为双蒸馏水，其他化学试剂均为分析纯。

2.3 MRS琼脂培养基的组成与制备
2.3.1培养基的组成
酪蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺3g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.2g、磷酸氢二钾2.0g、碳酸钙20g、吐温-801ml、琼脂15g、蒸馏水1000ml。

2.3.2培养基制备
将上述的各组分在80～90℃加热使溶解，校正pH6.2，加蒸馏水至1000ml中，摇匀，分装于盐水瓶，每瓶100ml。

在121℃高压灭菌20分钟，冷却后备用。

2.4营养琼脂平板的制备
取冷至45℃左右的MCA琼脂培养基，在无菌的条件下倒入无菌的培养皿中，每平皿各约15ml，待冷却凝固后，备用。

2.5无菌生理盐水的制备
称取氯化钠9.0g，用蒸馏水溶解并定容于1000ml量瓶中，摇匀，分装于250ml三角瓶中，每瓶装90ml. 在121℃高压灭菌20分钟，冷却后备用。

3供试品溶液的制备
以无菌操作法取检品10.0g，加入盛有90ml无菌生理盐的三角瓶中，充分振荡10分钟，制成1﹕10样品悬液。

再用无菌吸管吸取1﹕10的样品悬液1ml，注入盛有9ml无菌生理盐水的试管中，充分振荡，制成1:10-2的稀释液。

按上述操作程序依次制成1：10-3、1：10-4、1：10-5、1：10-6、1：10-7等的稀释液，作为供试品溶液。

4 测定方法
4.1 涂布分别吸取稀释级为10-4～10-6的样品稀释液各0.2ml，用无菌L形玻璃棒均匀涂布于固体培养基平板上，每稀释级重复2～3个平板。

4.2 培养倒置，于35～37℃厌氧培养24～48小时后，计算单个菌落。

5.3 计数选取菌落数在30—300个平板进行有效活菌计数，并计算同一稀释级的平均数。

5 计算
计数后按下式进行样品中活菌的计算：
N×D×10
植物乳杆菌数（cfu/g）=————
0.2×W
N：平板中菌落数（同一稀释级数的平均值，cfu）；
D：稀释倍数；
W：取样量（g）。

6结果报告
上述测定的植物乳杆菌含量为每1g样品中的活菌数量。

二、乳酸菌的作用
名称含量功能特点使用方法
粪链球菌200亿cfu/g 1、产生乳酸、维生素、酶及抑菌物
质。

2、抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄
色葡萄球菌的生长。

3、饲料中添加，可大量减少抗生素
和酶的用量。

4、提高免疫力，提高防病抗病能力，
减少消化道、呼吸道疾病。

5、降低粪便氨氮浓度，改善养殖环
境。

将本品均匀混合于颗粒饲料或粉料中直接饲喂。

每吨配合饲料添加料参考如下：
1、鸡、鸭、鹅：50克，全场全期使用。

（1-7日龄加倍使用效果更佳）
2、猪：50克，连续使用10-15天，全程使用效果更好。

断奶前后一周连续使用，按每吨100-150克添加，可有效防止断奶腹泻。

嗜酸乳杆菌200亿cfu/g 1、代谢产生乳酸、酶及抑菌物质。

2、抑制大肠杆菌、沙门氏菌的生长，
减少肠炎与腹泻。

3、使消化道、呼吸道疾病减少，防
病抗病能力提高。

4、增强机体抗氧化能力，提高免疫
力。

5、降低粪便氨氮浓度，改善养殖环
境。

在饮水中使用或混合于饲料中。

将本品均匀混合于颗粒料或粉料中直接饲喂，每吨配合饲料添加量参考如下：
1、鸡、鸭、鹅：50克，全场全期使用。

（1-7日龄加倍使用效果更佳）
猪：50克，连续使用10-15天，全程使用效果更好。

断奶前后一周连续使用，按每吨100-150克添加，可有效防止断奶腹泻
植物乳杆菌200亿cfu/g 1、产生乳酸、维生素、酶及抑菌物
质。

2、在发酵饲料中添加，既增加饲料
的风味，促进动物的食欲，又有防腐
作用。

3、抑制大肠杆菌、沙门氏菌的生长，
减少肠炎与腹泻。

4、提高免疫力，提高防病抗病能力，
减少消化道、呼吸道疾病。

5、降低粪便氨氮浓度，改善养殖环
境。

将本品与其他益生菌混合均匀后，用于发酵饲料，每吨发酵饲料添加量参考如下：每吨发酵饲料按1公斤添加。

四、乳酸菌的生产工艺
大多数乳酸菌属于兼性厌氧和异养菌，不像双歧杆菌那样要求严格厌氧条件，对营养要求也不如双歧杆菌高，许多菌可以在MRS培养基、牛乳、胡萝卜汁、番茄汁及其他蔬菜汁中良好地生长。

对厌氧条件要求不高的乳酸菌，在小规模培养时可以采用静止培养或间歇搅拌的方式进行培养。

1、平板培养复壮：将在冰箱保藏的乳酸菌斜面种子采用划线的接种方法在乳酸菌平板
培养基上划线接种，于38℃培养12h，使乳酸菌复壮，并形成单菌落；
培养基为按下述比例的混合物：酪蛋白胨1%、葡萄糖2%、酵母浸粉0.7%、牛肉膏0.5%、柠檬酸三铵1.5%、磷酸氢二钾0.2%、无水乙酸钠0.5%、吐温-80 0.1%、琼脂粉2%，pH自然，121℃，灭菌20Min，备用。

2、制作摇瓶种子
将在平板中培养的乳酸菌菌落挑选典型的单菌落，接种到乳酸菌液体培养基中，采
用常规方法在1000ml三角瓶液体培养基上于37℃培养8-12h,得到乳酸菌摇瓶种子；
所述培养基为按下述比例配置的混合液：大豆蛋白胨1%、葡萄糖1%、酵母浸粉
0.7%、牛肉膏0.5%、无水乙酸钠0.6%、磷酸氢二钾0.5%、柠檬酸三铵1.5%、吐
温-80 0.5%，pH自然，115℃，灭菌20Min，备用。

（有条件可加入西红柿汁10%、胡萝卜汁10%、蘑菇汁5%具体制法：将西红柿、胡萝卜、蘑菇按照2:2:1比例加入水中煮沸后，慢火煮20Min后，过滤去渣，最后用自来水补齐所需要的溶液。

）
3、生产一级种子液：按照以下配方配制一级种子培养基，经121℃，灭菌45Min，pH
自然，冷却到40℃以下，将上述步骤得到的摇瓶种子以8%（体积分数）的接种量，接种于生产用的一级种子罐中，37℃培养8-12小时，
原料% 100mL/g 1L/g 1ooL/kg 1KL/Kg
豆粕粉(80目) 0.5 0.5g 5g 0.5kg 5kg
鱼粉(80目) 0.5 0.5g 5g 0.5kg 5kg
鱼蛋白胨0.5 0.5g 5g 0.5kg 5kg
乳糖0.2 0.2g 2g 0.2kg 2kg
玉米面(80目) 0.5 0.5g 5g 0.5kg 5kg
葡萄糖 1 1g 10g 1kg 10kg
氯化钠0.1 0.1g 1g 0.1kg 1kg
磷酸氢二钠0.15 0.15g 1.5g 0.15kg 1.5kg
增效剂0.05 0.05g 0.5g 0.05kg 0.5kg
消泡剂0.03 0.03g 0.3g 0.03kg 0.3kg
4、二级发酵（生产发酵）：将得到的乳酸菌一级种子，以10%体积比例接种到生产发
酵培养液的发酵罐中，发酵液培养液的配方和控制条件同生产一级种子液，发酵
12h，得到发酵菌液。

最后按照乳酸菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对乳
酸菌发酵液的活菌含量进行常规平板计数检测。

5、三级发酵：
在工业生产时，当需要更大规模（20T以上发酵罐）的生产量时，还需要进行三级发酵。

6、根据发酵活菌含量检测结果和目标菌数，计算出投料量。

7、投料搅拌：
8、喷雾干燥：。