猪卵母细胞极体排出的规律
核移植中卵母细胞激活方法的研究进展
核移植中卵母细胞激活方法的研究进展作者：王爱萍来源：《湖北畜牧兽医》2013年第04期摘要：核移植后的重构胚，只有卵母细胞质被激活后才能启动发育，低的核移植胚发育率可能与卵母细胞质未充分激活有关。
对核移植中卵母细胞激活方法进行了综述。
对常用的几种激活方法及其激活原理进行了介绍。
关键词：核移植；卵母细胞；激活方法中图分类号：S813.3 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2013）04-0074-04核移植后的重构胚，只有卵母细胞质被激活后才能启动发育，低的核移植胚发育率可能与卵母细胞质未充分激活有关。
目前，用于卵母细胞激活的方法主要分为单一激活和联合激活。
常用的单一激活主要有电激活、钙离子载体A23187、离子霉素（Ionomycin）及乙醇等；联合激活主要是单纯的物理刺激或化学刺激以后再用蛋白质合成抑制剂或蛋白质磷酸化抑制剂或细胞松弛素B联合处理的一种激活方式。
现在越来越多的研究证明联合激活比单一的电激活或化学激活效果好，下面简要介绍几种常用的激活方法及其激活原理。
1 激活方法1.1 电激活电刺激是在核移植中常用的激活方法。
因该方法具有操作方便、激活率高和无化学毒副作用等特点而被广大研究者所青睐。
早在1989年，Onodera和Tsunoda的研究表明小鼠和兔卵母细胞在施以直流电脉冲后可发育到囊胚期。
在小鼠、兔、牛、猪的研究中都发现一次直流电脉冲只诱发一个钙离子瞬间波峰，而不是象受精一样引起的是钙离子波动。
尽管如此，一次或两次电脉冲就可以激活大部分卵母细胞。
电激活的原理是卵母细胞在短暂高压直流电脉冲的作用下，膜的磷酸二酯双分子结构的稳定性发生改变，细胞膜上形成很多可恢复的微小孔洞，使细胞外的Ca2+进入细胞，并使胞质内Ca2+浓度升高，细胞内Ca2+浓度的增加导致CSF活性消失，cyclinB被迅速降解，MPF活性消失，细胞被激活完成第二次减数分裂并进入下一细胞周期。
早期的研究表明核移植胚胎进行简单的电激活就如同卵母细胞孤雌激活一样，虽然可以得到进一步的发育，但激活效率较低而且电激活常常依赖于卵母细胞成熟时间[1]，卵龄越高CSF对Ca2+就越敏感，进而卵母细胞就越容易激活。
2024年高中生物新教材同步选择性必修第三册第2章 细胞工程第3节 胚胎工程
2024年高中生物新教材同步选择性必修第三册第2章细胞工程第3节胚胎工程第3节胚胎工程第1课时胚胎工程的理论基础课程内容标准核心素养对接1.简述受精和胚胎早期发育的基本过程。
2.说明胚胎的形成经过了受精及早期发育等过程。
1.生命观念——从精子和卵细胞的结构理解受精作用过程。
2.科学思维——构建模型分析早期胚胎发育中相关物质和结构的变化。
知识点1受精和受精阶段1.胚胎工程的概念2.受精(1)概念：精子与卵子结合形成合子(即受精卵)的过程。
(2)场所：哺乳动物的受精在输卵管内完成。
(3)过程知识点2胚胎早期发育1.场所：输卵管。
2.过程(1)动物排出的卵子都是次级卵母细胞，需进一步成熟(×)(2)当精子入卵后，立即发生透明带反应，阻止后来的精子进入(×)(3)胚胎发育早期，有一段时间是在透明带内进行分裂的(√)(4)成熟的精子并不具有受精能力，必须获能后才具备受精能力(√)(5)囊胚的滋养层细胞具有全能性(×)(6)胚胎发育过程中开始分化的阶段是原肠胚期(×)(7)囊胚内的内细胞团将来发育成胎盘和胎膜(×)(8)胚胎发育的场所是输卵管(×)教材P57“图2－20”拓展1.下图表示哺乳动物受精过程不同时期的示意图，请写出标号代表的内容。
哺乳动物的受精过程主要包括：①精子穿越卵细胞膜外的一些结构；②精子入卵；③形成雌、雄原核；④形成合子。
教材P58“图2－21”拓展2.写出图中A～D各部分结构名称。
A.透明带；B.内细胞团；C.囊胚腔；D.滋养层。
探究点一受精的过程受精是精子与卵子结合形成合子(即受精卵)的过程。
它包括受精前的准备阶段和受精阶段。
观察哺乳动物受精过程，并回答相关问题：(1)防止多精入卵的两道屏障为透明带反应和卵细胞膜反应。
(2)在精卵相遇之前，精子在雌性动物生殖道发生相应的生理变化，具有了受精能力，这个过程叫作精子获能。
卵子一般在排出后都要在输卵管中进一步成熟，当达到减数第二次分裂时，才具备与精子受精的能力。
母猪胚胎的形成过程及胎儿的几个死亡高峰
母猪胚胎的形成过程及胎儿的几个死亡高峰为提高母猪的利用效率，实现高产多产的目的，必须要降低胚胎形成过程中胎儿的死亡，因此有必要了解下胚胎形成过程及胎儿的几个死亡高峰，以指导我们的生产。
一．母猪胚胎的形成过程。
从精子与卵子结合、胚胎着床、胎儿发育直至分娩，这一时期称为妊娠期，对新形成的生命个体来说，称为胚胎期。
分析胚胎期的生长发育情况可以发现，胚胎期前1/3时期，胚胎重量的增加很缓慢，但胚胎的分化很强烈，而胚胎期的后2/3时期，胚胎重量的增加很迅速。
所以加强母猪妊娠前、后两期的饲养管理是保证胚胎正常生长发育的关键。
1．胚胎着床期又叫胚胎的第一死亡高峰，大约在母猪配种后９─１３天，精子与卵子在输卵管的壶腹部受精形成受精卵，受精卵呈游离状态，不断向子宫游动，到达子宫系膜的对侧上，在它周围形成胎盘。
这个过程大约12－24天。
胚胎着床期主要是做好母猪的饲养管理，尽可能降低应激。
2．胚胎器官形成期，又叫胚胎的第二个死亡高峰，大约在母猪配种后３周左右3．胎儿迅速生长期，又叫胚胎的第三个死亡高峰，大约在母猪配种后６０─７０天。
二．母猪胚胎的死亡过程胚胎在妊娠早期死亡后被子宫吸收称为化胎。
胚胎在妊娠中、后期死亡不能被母猪吸收而形成干尸，称为木乃伊。
胚胎在分娩前死亡，分娩的随仔猪一起产出称为死胎。
母猪在妊娠过程中胎盘失去功能使妊娠中断，将胎儿排出体外称为流产。
胚胎死亡化胎、死胎、木乃伊和流产都是胚胎死亡。
母猪每个发情期排出的卵大约有10％不能受精，有20％～30％的受精卵在胚胎发育过程中死亡，出生仔猪数只占排卵数的60％左右。
受精卵的死亡有三个高峰时期。
1、前期死亡受精卵第九至第十三天的附植初期和第十五至第二十一天的器官形成期，容易受到各种不利因素的影响而死亡，如热应激、饲养管理不当等。
这是胚胎死亡的第一个高峰。
要减少在第一个胚胎死亡高峰期的胚胎损失，在配种前和平时生产中，应注意观察每头母猪的健康情况，有病及时治疗，不要把疾病带到妊娠期去。
猪卵巢卵母细胞采集方法的比较研究
随着现代胚胎工程技 术的发展 ， 哺乳动物卵母 细胞体外 成熟 、 体外受精 、 胚胎冷冻保存 、 转基 因 、 细胞克隆等技术 体 日趋完善 ， 卵母细胞 的需求在迅速增加。传统的超 数排 卵技 术所获得的成熟 卵母细胞 已不能满 足研究和生产需求 。 卵巢 卵母细胞的采集和体 外成熟技术发展 ， 使人们 可获得大量 卵 巢卵母细胞用于胚胎体外 生产 和研究 ， 但如何改进卵母 细胞
１１ 试剂耗材 ．３ ．
１２ 方 ． 法
Ｔ Ｍ １９ 氯霉素 、 Ｃ 一９ ， 青霉素 、 透明质酸酶 、 四
孔培养皿均购 自 Ｓｇ 公司（ 国）其它试剂为 国产分析纯。 ｉ ｍａ 美 ， １ ． 抽 吸法和剖切法采集猪卵巢卵母细胞在采卵室 内， ．１ ２ 分 别采用抽吸法和剖切法采 集猪卵巢卵 丘 一卵母 细胞复合体 （ Ｏ ｓ ，抽 吸法用带有 １Ｇ针头的 ５ Ｃ Ｃ） ６ ｍＬ注射器抽 吸卵巢表 面 ２ ｍｍ大小 卵泡 ， —８ 吸卵液为 ｍ Ｂ ； Ｐ Ｓ 剖切 法是将 清洗干净 的卵巢置于 内有 ５ Ｐ Ｓ吸卵液 的无菌培养皿 中， ｍＬ ｍ Ｂ 然后用 灭菌手术刀片对 卵巢表 面所有 卵泡 （ ６ ｍ） ２ ｍ 进行纵横方 向 切剖。 考文献介绍的方法进行 收集 、 参 分级 、 记录 ， 分为 Ａ、 Ｂ、
的影响进行比较研 究， 并分析在 卵巢收集时不 同的保存 温度 、 运输时间对 卵母细胞体 外成熟的影响。结果表 明： 剖切 法
高中生物思维导图-选修一-胚胎工程
卵原细胞初级卵母细胞次级卵母细胞MⅡ合子精子MⅠ第一极体＋第二极体＋马猪、牛、羊排卵后在输卵管内发育至M Ⅱ中期中期（2n ）（2n ）（n ）（2n ）胎儿期初情期后有丝分裂精原细胞初级精母细胞（2n ）（2n ）有丝分裂精子细胞（n ）初情期后减数分裂高尔基体-顶体中心体-尾线粒体-线粒体鞘细胞核-头其他-原生质滴变形获能受精（n ）①精、卵相遇，发生顶体 反应，精子穿入放射冠③精子接触卵细胞膜， 发生透明带反应②精子接触透明带，顶 体酶溶出一条孔道④精子入卵，发生卵细胞 膜反应，同时卵子完成 M Ⅱ分裂，释放第二极体⑤雌、雄原核形成⑥核膜消失，两个原 核融合，形成合子受精的重要标志受精过程完成的标志2细胞32细胞分化原肠胚全能细胞胎儿组织胎膜和胎盘输卵管子宫卵巢受体牛供体牛超数排卵配种或人工授精胚胎的收集与检查分割用激素进行同期发情处理注射促性腺激素发情发情7天（冲洗出子宫内胚胎，冲卵）同期发情早期胚胎（桑椹胚或囊胚）-196℃液氮保存内细胞团均等分割取滋养层细胞，做DNA 分析性别鉴定。
胚胎移植手术法非手术法妊娠检查生产卵母细胞的采集精子的采集卵母细胞的培养精子的获能处理M Ⅱ期卵母细胞获能精子滋养层透明带内细胞团①促性腺激素，输卵管中冲取卵子②屠宰母畜卵巢中采集③活体取卵①假阴道法②手握法③电刺激法①啮齿、兔、猪：培养法（获能液）②牛、羊：化学诱导法（肝素、钙离子A23187）体外受精受精卵牛、羊：桑椹胚或囊胚人：8-16细胞胚胎的早期培养胚胎移植胚胎移植技术基础理论几种技术胚胎工程胚胎分割技术体外受精技术胚胎早期培养技术。
不同月份猪卵母细胞体外成熟效果比较
不同月份猪卵母细胞体外成熟效果比较许惠艳;胡林林;归婧;杨小淦;卢克焕【摘要】[目的]分析卵母细胞发育与不同季节(月份)的相关性,为提高猪卵母细胞的体外成熟效率奠定基础.[方法]2012年2～6月从南宁市某屠宰场收集猪卵巢采集卵母细胞,经体外成熟(IVM)40～44 h,然后随机挑出成熟后的卵母细胞进行地衣红染色,相差显微镜下观察、记录卵母细胞发育成熟的各个时期,并分析卵母细胞发育时期与不同月份温度、湿度的相关性.[结果]随着月份的增加,GV期和GVBD期卵母细胞所占比例整体上呈下降趋势,AT期所占比例呈上升趋势,除5月外,MⅡ期所占比例整体上也呈上升趋势,6月MⅡ期所占比例最高,为42.31％.2、3、4月的GVBD期所占比例显著高于6月所占比例(4.40％)(P＜0.05).从卵母细胞发育时期与不同月份温度、湿度的相关性分析结果可知,GV期、GVBD期、MⅠ期3个时期与温度变化呈负相关,与湿度变化呈正相关；而AT期、MⅡ期与温度变化呈正相关,与湿度变化呈负相关.[结论]不同月份猪卵母细胞的IVM效果存在一定差异.在高湿低温月份,GV期和GVBD期的卵母细胞所占比例较大,MⅡ期所占比例较小；而在低湿高温月份,GV期和GVBD期所占比例较小,MⅡ期所占比例较大.【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2013(044)004【总页数】5页(P676-680)【关键词】猪;卵母细胞;体外成熟;不同月份;发育;地衣红染色【作者】许惠艳;胡林林;归婧;杨小淦;卢克焕【作者单位】广西亚热带生物资源保护利用重点实验室;广西大学动物科学技术学院,南宁530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室;广西大学动物科学技术学院,南宁530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室;广西大学动物科学技术学院,南宁530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室;广西大学动物科学技术学院,南宁530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室;广西大学动物科学技术学院,南宁530005【正文语种】中文【中图分类】S828.350 引言【研究意义】卵母细胞体外成熟（In vitro maturation，IVM）作为胚胎工程的基础环节，其成熟效果直接影响到体外受精、核移植、转基因等后续相关研究的开展。
2-3-1胚胎工程的理论基础(教学课件)高中生物人教版(2019)选择性必修3
B.胚胎干细胞是一类未分化的细胞，可以从早期胚胎中分离获得
C.桑葚胚的细胞一般都具有全能性，囊胚的细胞逐渐分化
D.受精卵早期分裂时，胚胎中细胞数目不断增加，但胚胎的总体积并不增加
二、拓展应用
P59 练习与应用
1.精母细胞在变成精子的过程中，很多结构会消失，而细胞核与线粒体都保留了下来，
囊胚 原肠胚
卵裂期
（4）原肠胚
囊胚孵化后，内细胞团表层的细胞形成外胚层，下方的细胞 形成内胚层，出现由内胚层包围的空腔叫做原肠腔。 由 原 肠 胚的三个胚层进一步发育为不同的组织、器官、系统。
二 胚胎早期发育 P58
受 卵裂 桑
精
椹卵胚Fra bibliotek囊 胚
原 肠 胚
透明带
桑葚胚（32细胞）
原肠胚
小结
全能细胞
卵裂期
【课堂小结】
精子和卵子的结构
胚
胎 工
受 精
程
受精前的准备 受精的过程
精子穿越透明带
的
精子进入细胞膜
理
论 基
早期胚胎发育
雌雄原核的形成 核膜重构成受精卵
础
卵裂
桑葚胚
囊胚
原肠胚
一、概念检测
P59 练习与应用
1.判断下列有关哺乳动物受精的表述是否正确。
× (1)在自然条件下，受精在子宫中完成。（ ） × (2)精子需要获能才能与卵子结合，而卵子一经排出就具备受精能力。（ ） √ (3)精子入卵后，卵细胞膜会发生反应阻止其他精子入卵。（ ） A 2.下列有关哺乳动物早期胚胎发育的叙述，错误的是（ ）
②内细胞团将来发育成胎儿的各种组织。
③滋养层将来发育成胎盘和胎膜
H3K4me3对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响
曾毅仁, 张彩玉, 侯晗琦, 恽雪丹, 李湘萍
亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,广西大学,南宁 530004
摘要:哺乳动物卵母细胞的成熟与组蛋白甲基化修饰密切相关.CPI-455是一种组蛋白去甲基化酶 抑 制 剂,可 特 异
性抑制组蛋白去甲基转移酶 KDM5A/B 的活性,提高 H3K4me3(组 蛋 白 H3 第 4 位 赖 氨 酸 三 甲 基 化)的 表 达 水 平.
本实验在猪卵母细胞体外成熟过程中添加 CPI-455,探究 H3K4me3组蛋白甲基化对猪卵母细胞体外 成 熟 和 早 期 胚
胎发育的影响.首先,用不同浓度 CPI-455在不同时间处理猪卵母细胞,发现在0~22h添加5μmolCPI-455的 处
理方法效果最佳,卵母细胞成熟率与囊胚形成率均显著高于未处理组(p<0.05).0~22h 添 加 5μmolCPI-455 处
卵母细胞中相关基因的表达,上调囊胚中多能性基因的表达,调控 H3K4me3的甲基化水平,从而促 进 猪 卵 母 细 胞
体外成熟和早期胚胎发育.
关 键 词:猪;卵母细胞;CPI-455;H3K4me3;体外成熟
中 图 分 类 号 :S828
文 献 标 志 码 :A
文章编号:1673 9868(2021)07 0045 07
收集不同时期的猪卵母细胞和孤雌囊胚,清洗干净后移入装有细胞裂解液的 EP 管中并于-80 ℃冰箱 保存.微量反转录按照试剂盒说明书进行操作,反转录得到的样品存放于-20 ℃备用.将反转录得到的产 物作为模板,进行qRT-PCR 检测,观察不同处理组基因的表达情况(表1).反应程序为:95 ℃进行5min, 95 ℃进行30s,60 ℃进行1min,共40个循环.猪的18S 作为内参基因,目的基因的相对表达量用2-ΔΔCT 法 计 算 ,引 物 设 计 和 试 验 方 法 参 考 文 献 [1]和 文 献 [5]. 1.3 统计与分析
韩国母猪卵泡发育的基本过程
韩国母猪卵泡发育的基本过程【原创实用版】目录1.韩国母猪卵泡发育的基本过程概述2.韩国母猪卵泡发育的各个阶段3.韩国母猪卵泡发育的影响因素4.韩国母猪卵泡发育的研究意义正文一、韩国母猪卵泡发育的基本过程概述卵泡发育是母猪生殖系统中一个重要的生理过程，它直接影响到母猪的繁殖能力。
韩国母猪卵泡发育的基本过程可以分为四个阶段：原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡。
在每个阶段，卵泡的形态、功能和内部结构都会发生一定的变化。
二、韩国母猪卵泡发育的各个阶段1.原始卵泡：原始卵泡是卵泡发育的最初阶段，它们位于卵巢皮质内。
在这个阶段，卵泡由单层扁平上皮细胞包围，内部含有一个卵原细胞。
2.初级卵泡：原始卵泡发育到一定程度后，会进入初级卵泡阶段。
此时，卵泡周围的上皮细胞开始折叠，形成一个单层的卵泡囊。
卵泡内部含有一个卵原细胞和一群颗粒细胞。
3.次级卵泡：初级卵泡继续发育，卵泡囊进一步扩大，颗粒细胞数量增加，卵原细胞开始进入减数分裂，形成一个大的初级卵母细胞和一个小的第一极体。
此时，卵泡进入次级卵泡阶段。
4.成熟卵泡：次级卵泡发育到一定程度后，颗粒细胞会分泌大量的雌激素，促使卵泡进一步发育成熟。
成熟的卵泡囊壁变薄，卵泡内部含有一个成熟的卵母细胞、一个第一极体和一些颗粒细胞。
三、韩国母猪卵泡发育的影响因素卵泡发育受到多种因素的影响，包括遗传因素、激素水平、营养状况和环境因素等。
这些因素的共同作用，决定了卵泡能否正常发育和排卵。
四、韩国母猪卵泡发育的研究意义研究韩国母猪卵泡发育的基本过程，有助于我们深入了解母猪的生殖生理机制，为提高母猪的繁殖力提供理论依据。
实验八、卵母细胞的体外培养
实验八、卵母细胞的体外培养一、实验目的了解卵母细胞体外培养操作要领，掌握卵母细胞体外培养的方法。
二、实验材料1、卵巢、冷冻精液、M199培养液、血清、促性腺激素、雌激素、石蜡油、A23187、1%BSA、Tyrode’s改良液。
2、器械：培养皿、15ml试管、胶塞、注射针头、培养箱、吸管、离心管。
三、实验内容（一）卵母细胞的获得从屠宰场废弃卵巢中抽取卵母细胞已为大多研究者所接受。
真空泵法是一种有效的猪卵母细胞采集方法。
手动抽吸法在卵母细胞的成熟率方面优于真空泵法。
应用乙醚、乌拉糖、846麻醉药（耳静脉注射只）等麻醉后，再按外科手术要求打开腹腔。
将母兔背朝下方固定于兔手术台上。
在兔腹部最后两对乳头的腹中线部剪毛，用沾满肥皂液的纱布清洗局部，再用剃须刀片刮毛，先后用碘酒和酒精棉球由内向外进行消毒。
然后盖上创巾并固定。
用手术刀在腹部正中线处皮肤切开2～3cm长的术口，再在腹壁肌白线上切一小口，用中指垫着以手术剪来扩大剪口。
打开腹腔后，沿着子宫轻轻引出输卵管及卵巢。
与卵巢下脂肪组织处，用长夹夹住以固定卵巢。
仔细观察卵巢的变化。
记录排卵点（卵巢排过卵后的小红点）。
先在卵巢上找到卵泡，用手指固定卵巢，用10ml注射器配上9号针头，吸一些冲卵液（也可用生理盐水代替）,把针头插入卵泡中吸去取卵母细胞。
从卵巢中获得的卵母细胞为什么通常是未成熟：因为卵细胞形成过程中的减数第二次分裂是在精卵结合过程中完成的，所以只有完成受精后卵细胞才是成熟的，当然也已经完成受精了。
人工获取的卵细胞一般都是只完成了减数第一次分裂。
卵母细胞受精过程卵母细胞(oocyte)：在卵子发生过程中进行减数分裂的卵原细胞。
分为初级卵母细胞、次级卵母细胞和成熟的卵母细胞，它们分别是卵原细胞分化和DNA复制分裂后产生、第一次减数分裂和第二次减数分裂的产物。
（二）卵母细胞的体外培养1、培养液的准备用于卵母细胞体外成熟的基础培养液应用最广泛的是M199。
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龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 猪卵母细胞极体排出的规律 作者：刘西梅 华再东 魏庆信 乔宪凤 李莉 肖红卫 来源：《湖北农业科学》2011年第24期
摘要：试验把猪卵丘－卵母细胞复合体（Ｃｕｍｕｌｕｓ－ｏｏｃｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，ＣＯＣｓ）于体外分别培养２４、３２、３８、４４、４８和５４ ｈ，观察它们在不同时间排出的极体数，以研究体外卵母细胞排出极体的规律。结果表明，Ａ级和Ｂ级的ＣＯＣｓ培养４８ ｈ的极体排出率最高 （８３．２％和65.7％），明显高于同级水平培养２４、３２和３８ ｈ的；不同级别ＣＯＣｓ体外培养相同时间后，Ａ级与Ｂ级的极体排出率差异不显著（Ｐ﹥０．０５），但两者与Ｃ级的差异显著 （Ｐ﹤０．０５）。由此可见，Ａ级、Ｂ级ＣＯＣｓ 能获得高的极体排出率，培养４８ ｈ的极体排出达到高峰，排出过程呈现前期上升快、后期下降慢的变化趋势。
关键词：猪；卵丘－卵母细胞复合体；体外成熟；极体 中图分类号：Ｓ８２８；Ｓ８１４．８ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）24－5172-03
Ｔｈｅ Ｒｕｌｅ ｏｆ Ｐｏｌａｒ Ｂｏｄｙ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｐｉｇ Ｏｏｃｙｔｅｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ
ＬＩＵ Ｘｉ－ｍｅｉ１，ＨＵＡ Ｚａｉ－ｄｏｎｇ２，ＷＥＩ Ｑｉｎｇ－ｘｉｎ１，ＱＩＡＯ Ｘｉａｎ－ｆｅｎｇ１，ＬＩ Ｌｉ１，ＸＩＡＯ Ｈｏｎｇ－ｗｅｉ１
（１ Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｅｍｂｒｙｏ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅs， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ；
２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｐｏｌａｒ ｂｏｄｙ ｅｘｔｒｕｄｅｄ ｆｒｏｍ ｐｉｇ ｃｕｍｕｌｕｓ－ｏｏｃｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ （ＣＯＣｓ） ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ｓｕｃｈ ａｓ ２４ ｈ， ３２ ｈ， ３８ ｈ， ４龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn ４ ｈ， ４８ ｈ ａｎｄ ５４ ｈ， ｗｅｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｕｌｅ ｏｆ ｐｏｌａｒ ｂｏｄｙ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒｕｄｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｏｌａｒ ｂｏｄｙ ｆｒｏｍ ＣＯＣｓ ｏｆ ｌｅｖｅｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｏｒ ４８ｈ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ （８３．２％ ａｎｄ 65.7％）， ａｎｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌｅｖｅｌ ＣＯＣｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｏｒ ２４ ｈ， ３２ ｈ ａｎｄ ３８ ｈ． Ｔｈｅ ｐｏｌａｒ ｒａｔｅ ｏｆ ＣＯＣｓ ｏｆ ｌｅｖｅｌ Ａ ａｎｄ Ｂ ａｔ the ｓａｍｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＞０．０５）， ｂｕｔ ｂｏｔｈ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ Ｃ（Ｐ﹤０．０５）． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＣＯＣｓ ｏｆ ｌｅｖｅｌ Ａ ａｎｄ Ｂ ｍｉｇｈｔ ｏｂｔａｉｎ ｈｉｇｈｅｓｔ ｐｏｌａｒ ｂｏｄｙ ｒａｔｅ ａｔ ４８ ｈ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ． Ｔｈｅ ｅｘｔｒｕｄｉｎｇ ｏｆ ｐｏｌａｒ ｂｏｄｙ ｓｈｏｗｅｄ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｑｕｉｃｋｌｙ ｉｎ ｆｏｒｅｐａｒｔ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｓｌｏｗｌｙ ｉｎ ａｆｔｅｒｐａｒｔ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｉｇ； ｃｕｍｕｌｕｓ－ｏｏｃｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ； ＩＶＭ； ｐｏｌａｒ ｂｏｄｙ
猪的体细胞克隆技术研究远远落后于其他动物，其主要原因是猪卵母细胞的体外成熟质量比较差、显微操作难度大，加上妊娠维持困难等问题还没有得到解决，所以直到２０００年才有所突破，获得了体细胞克隆后代［１－３］。但猪体细胞核移植重构胚的体外发育率仍然相当低，只有大约１％的克隆胚移植后能完成妊娠；其中去核是体细胞克隆的一个重要环节，去核能否成功直接影响到核移植的效率［４］。目前，盲吸法在猪卵母细胞去核中的应用比较多；尽管盲吸辅助荧光染料Ｈｏｅｃｈｅｓｔ ３３３４２的染色法能提高去核的效率，但有些学者并不支持这种做法。然而盲吸去核的质量好坏和效率高低与卵母细胞的成熟时期密切相关，成熟时间延长，卵龄增加，会使第一极体与中期染色体的位置发生偏转；若去核不完全则会导致克隆胚染色体出现不完整性，造成卵裂异常，影响克隆胚的发育。因此，确定猪卵母细胞体外成熟的最佳时期，是体细胞核移植中盲吸去核成败的关键。试验根据猪卵丘－卵母细胞复合体（Ｃｕｍｕｌｕｓ－ｏｏｃｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，ＣＯＣｓ）的卵丘细胞层数，把ＣＯＣｓ分成Ａ、Ｂ、Ｃ和 Ｄ ４个级别，并把前３级的ＣＯＣｓ分别体外培养２４、３２、３８、４４、４８和５４ ｈ，以比较它们在不同时间里的发育情况，从而确定ＣＯＣｓ体外成熟的最佳时期，为后续研究奠定基础，也为提高猪体细胞核移植技术提供理论依据。
１ 材料与方法 １．１ 材料 龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 杜氏磷酸缓冲液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＤＰＢＳ）购自Ｇｉｂｃｏ公司，孕马血清促性腺激素（ＰＭＳＧ）、人绒毛膜促性腺激素（ｈＣＧ）为宁波激素制品厂产品，其他试剂如未特别注明的，均购自Ｓｉｇｍａ 公司。卵母细胞体外培养液为改良的Ｍ１９９（ｍＴＣＭ１９９），在其中添加了３．０５ ｍｍｏｌ／Ｌ 葡萄糖、０．９１ ｍｍｏｌ／Ｌ丙酮酸钠、０．５７ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－半胱氨酸、１．００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－谷氨酰胺、１０ ＩＵ／ｍＬ ｈＣＧ、１０ ＩＵ／ｍＬ ＰＭＳＧ、20万ＩＵ／ｍＬ 青霉素、５０万ＩＵ／ｍＬ 硫酸链霉素、１０％猪卵泡液（ｐＦＦ）；洗卵液用ＤＰＢＳ；融合／激活液由０．２５ ｍｏｌ／Ｌ 甘露醇、０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钙、０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ 硫酸镁、０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ４－羟乙基哌嗪乙磺酸［Ｎ－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－Ｎ′－（２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ），ＨＥＰＥＳ］缓冲液以及质量浓度为０．１ ｍｇ／ｍＬ的聚乙烯醇（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ，ＰＶＡ）组成；脱卵液用质量浓度为1．0 ｍｇ／ｍＬ的透明质酸酶DPBS液；胚胎培养液为ＮＣＳＵ－２３（Ｎｏｒｔｈ cａｒｏｌｉｎａ sｔａｔｅ uｎｉｖｅｒｓｉｔｙ－２３）加质量浓度为４ ｍｇ／ｍＬ的牛血清白蛋白（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｎ ａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ）组成。
１．２ 方法 １．２．１ ＣＯＣｓ的采集和分级培养 猪卵巢采自当地屠宰场，置于盛有２８～３７ ℃ 生理盐水（含青霉素２０万ＩＵ／ｍＬ、链霉素１５万ＩＵ／ｍＬ）的保温瓶内，２ ｈ内送回实验室，用适量生理盐水（２８～３７ ℃）冲洗３～５遍，采用１０ ｍＬ注射器（１６号针头）抽吸卵泡，卵泡液置于３７ ℃水浴保温的５０ ｍＬ离心管中，静置１５～２０ ｍｉｎ，弃上清液，实体显微镜下观察，捡取ＣＯＣｓ，转移到ＤＰＢＳ 液滴中冲洗３遍。根据卵丘细胞的层数将ＣＯＣｓ分为４ 级，其中Ａ级为包裹５层以上的卵丘细胞；Ｂ级为包裹３～５层的卵丘细胞；Ｃ级为包裹１～３层的卵丘细胞；Ｄ级则是裸卵、死卵。各级别的ＣＯＣｓ再用体外培养成熟（Ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ， ＩＶＭ）培养基洗涤３遍，放入３９ ℃、１００％相对空气湿度、５％（体积分数，下同）ＣＯ２含量的培养箱中进行培养。另取Ａ、Ｂ、Ｃ ３个级别的ＣＯＣｓ用于体外培养，培养时间分别为24、32、38、44、48、54 h，Ａ、Ｂ、Ｃ ３个级别的ＣＯＣｓ形态见图１。
１．２．２ 猪卵泡液制备 抽取卵巢上直径３～８ ｍｍ的卵泡，将抽取液放入离心管中，以１ ６００ ｒ／ｍｉｎ离心１８ ｍｉｎ，上清液用０．２２ μｍ滤膜过滤后，分装于０．５ ｍＬ离心管中，－２０℃冷冻保存备用。
１．２．３ ＣＯＣｓ体外成熟 将体外培养不同时间的ＣＯＣｓ，在实体显微镜下观察卵丘细胞扩散情况，用含１.0 ｍｇ／ｍＬ透明质酸酶的ＤＰＢＳ液脱除包裹在周围的卵丘细胞，选择胞质均匀且排出第一极体的卵母细胞做孤雌激活。 龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn １．２．４ 培养不同时间ＣＯＣｓ的孤雌激活 取上述脱去卵丘细胞的ＣＯＣｓ，用激活液洗涤３遍。再将ＣＯＣｓ转移到已经铺满激活液、电极宽度为１ ｍｍ的融合槽（美国ＢＴＸ ＥＣＭ ２００１电融合仪配套电激活槽）中，电融合参数设定为１个１０Ｖ、５ ｓ的交流电（ＡＣ）刺激，紧接着是１个１．６ ｋＶ／ｃｍ、６０ μｓ的直流脉冲（ＤＣ）。之后用ＮＣＳＵ－２３加４ ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ的胚胎培养液洗涤ＣＯＣｓ ５遍，洗涤后将ＣＯＣｓ转移到ＮＣＳＵ－２３加４ ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ液滴内，放入３９ ℃、１００％相对空气湿度、５％ ＣＯ２含量的培养箱中培养４８ ｈ后，观察细胞发育的卵裂情况。试验所得数据应用ＳＰＳＳ（Ｖｅｒｓｉｏｎ １１．０）软件进行χ２检验。
２ 结果与分析 ２．１ ＣＯＣｓ的培养 将ＣＯＣｓ分别培养２４、３２、３８、４４、４８和５４ ｈ，然后加入１．０ ｍｇ／ｍＬ的透明质酸酶，反复吹打去除卵丘细胞，用ＤＰＢＳ液清洗２～３次，于倒置显微镜下观察极体的排出情况，结果见图２。
２．２ ＣＯＣｓ极体排除规律 试验在同样的条件下培养相同的时间，观察、统计排出极体的ＣＯＣｓ数量。结果见表１。从表１可见，Ａ级和Ｂ级ＣＯＣｓ极体排出率之间在相同时间内差异不显著（Ｐ﹥０．０５），但两者与Ｃ级ＣＯＣｓ极体排出率相比差异显著（Ｐ﹤０．０5）。而各级ＣＯＣｓ极体的排出都是从培养２４ ｈ开始出现的，随着时间延续而上升，于培养４４～４８ ｈ达到高峰；之后开始下降。这说明ＣＯＣｓ是在逐渐成熟，并于极体排出高峰之后开始老化。同时，从各级ＣＯＣｓ在体外培养的极体排出动态（图３）可以清晰地看出，不同级别ＣＯＣｓ于体外培养同一时间的极体排出率变化基本呈现出前期上升快、后期下降慢的变化趋势。
３ 讨论 试验根据ＣＯＣｓ的卵丘细胞层数将ＣＯＣｓ分成Ａ级、Ｂ级和Ｃ级，并分别进行培养，获得Ａ级、Ｂ级和Ｃ级ＣＯＣｓ极体排出的最佳时期，同时对Ａ级、Ｂ级和Ｃ级ＣＯＣｓ体外培养相同时间排出极体的数量进行了比较。结果表明，ＣＯＣｓ周围卵丘细胞层数对ＣＯＣｓ的极体排出具有明显的影响，Ａ级、Ｂ级ＣＯＣｓ有利于体外培养，能获得较高的极体排出率，这可能与ＣＯＣｓ的卵丘细胞层数有关。据报道，ＣＯＣｓ的卵丘细胞层数和质量是影响ＣＯＣｓ极体排出的重要因素之一［５，６］。ＣＯＣｓ的体外成熟是伴随卵丘细胞的扩散发生的，扩散的卵丘细胞能够调节诸如氨基酸、核苷酸、磷脂酸、激素、蛋白质等物质在ＣＯＣｓ内的进出，诱导从ＣＯＣｓ排出有害因子，从而有效地抑制ＣＯＣｓ的退化［７］。而ＣＯＣｓ在生长发育中所释放的生长因子对卵丘细胞的发育也有一定的促进作用。ＣＯＣｓ与卵丘细胞的这种相互作用使得两者共同发育生长，最终促进了ＣＯＣｓ的成熟而排出极体［８，９］。