肺炎克雷伯菌的耐药基因序
临床产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐药性分析及耐药基因和Ⅰ类整合子的检测
自 １８ ９ ３年在德 国首次从 肺炎克 雷伯菌 中分离 到质粒介
四 、 Ｓ Ｌ 表 型 测 定 ＥＢ ｓ
导 的超广谱 Ｂ内酰胺 酶以来 ， 一 随着广谱抗 菌药物尤其 是 １一 ３ 内酰胺类药物的大量使用 ， Ｅ Ｂ ｓ的肠 杆菌科 细菌耐药性 产 ＳＬ
日益严重 ， 目前 已成为 医院感染 的主要病原菌 ， 临床治疗和 给
材 料 与 方 法
一
采用 Ｋ Ｂ琼脂 扩散法 检测 ８ — ５株大肠埃希菌 和 ４ 株肺炎 １ 克雷伯菌对 １ ８种抗 菌药 物的耐药性 ， 严格按照美国临床 实验
室标准化委员 会（ ｒ ｉ文 件 ２ ０ 版标 准规程操作 。 ｃｓ） ０８
六、 模板制备与 Ｐ Ｒ扩增 Ｃ 采用 煮沸裂解法制备模板 Ｄ Ａ。参 照文献 ．设计合成 Ｎ ３
严格按照 Ｎ Ｃ Ｓ规定 的确证试验方法操作 ， Ｍ —Ｈ琼 ＣＬ 在
脂上分别贴上含及不含克拉维酸的头孢他啶及 头孢 噻肟纸片
对 比。任何一种含克拉维酸的药敏纸片比不含 克拉维酸 的相 应纸片抑 菌环直 径 ≥５ ｍ Ｅ为 Ｅ Ｂ ｓ表型 阳性 ， ＳＬ 大肠埃 希菌 Ａ Ｃ ５ ２ Ｔ Ｃ２ ９２在每 二对纸 片间直 径差 ≤２ ｈ 肺 炎克雷 伯菌 ｉ ｍ，
Ａ Ｃ ０ ６ ３在头孢他 啶一 对纸片 中的抑菌直径 差 ≥５ｍ Ｔ Ｃ７０ ０ Ｅ，
控制医药感染造 成很 大 困难 … 。大肠 埃希 菌和肺 炎克 雷伯
菌是产 Ｅ Ｂ ｓ Ｓ Ｌ 的主要病原 菌。近年来 ， Ｅ Ｂ ｓ的大肠埃希 产 ＳＬ
菌和肺炎克雷伯 菌 的检 出率 不 断增加 ， 且不 同 国家、 区 而 地 ＥＢｓ Ｓ Ｌ 的流行株各有差异 ， 携带 的耐药基 因型各不相 同 ， 其 水
肺炎克雷伯菌对多黏菌素的耐药机制研究进展
肺炎克雷伯菌对多黏菌素的耐药机制研究进展作者：徐特钱妍李頔来源：《中国药房》2022年第17期摘要随着抗生素的大量使用，肺炎克雷伯菌呈现出多药耐药性趋势，尤其是耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的出现，意味着可用于治疗肺炎克雷伯菌感染的抗生素越来越少。
多黏菌素以其独特的抗菌机制已成为治疗耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌感染的最后一道防线，但随着其使用增加，国内外肺炎克雷伯菌耐药株的报道也呈上升趋势，严重危害着患者的生命安全。
笔者就肺炎克雷伯菌对多黏菌素的耐药机制进行总结，发现肺炎克雷伯菌对多黏菌素的耐药机制主要包括细菌外膜脂多糖的结构修饰、荚膜多糖的过表达、多药外排泵的过表达等，可为该药的合理使用及耐药肺炎克雷伯菌的防治提供依据。
关键词肺炎克雷伯菌;多黏菌素;耐药性;耐药机制中图分类号 R965; R978.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2022）17-2172-05DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.17.25Progress in resistance mechanism of Klebsiella pneumoniae to polymyxinXU Te，QIAN Yan，LI Di（Dept. of Pharmacy，the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China）ABSTRACT With the massive use of antibiotics，Klebsiella pneumoniae has shown a trend of multiple drug resistance，especially carbapenem-resistant K. pneumoniae，which means that fewer and fewer antibiotics can be used to treat K. pneumoniaeinfection. Polymyxin has become the last line of defense for the treatment of carbapenem-resistant K. pneumoniae infection due toits unique antibacterial mechanism. However，with the increase of its use，the reports of drug-resistant K. pneumoniae strains athome and abroad are also on the rise，seriously endangering the lives of patients. The author summarizes the resistance mechanismof K. pneumoniae to polymyxin，and find that the resistance mechanism of K. pneumoniae to polymyxin mainly includes thestructural modification of lipopolysaccharide in bacterial outer membrane，the overexpression of capsular polysaccharide and theoverexpression of multidrug efflux pump，which can provide a basis for the rational use of the drug and the prevention andtreatment of drug-resistant K. pneumoniae.KEYWORDS Klebsiella pneumoniae;polymyxin;drug resistance;resistance mechanism肺炎克雷伯菌是肠杆菌科克雷伯菌属中最主要的一种病原菌，广泛存在于自然环境中，同时其也可定植于人的肠道、口腔以及皮肤等部位。
肺炎克雷伯菌耐药分析
肺炎克雷伯菌耐药分析【摘要】目的探讨医院分离1094株肺炎克雷伯菌的产酶情况。
方法采用2012年clsi推荐产超广谱β内酰胺酶（esbls）和碳青霉烯酶的检出方法，主要是纸片扩散法和改良hodge试验。
结果1094株肺炎克雷伯菌产esbls率为69.7%，改良hodge试验阳性株22株。
结论肺炎克雷伯菌的产esbls率一直居高，对碳青霉烯类抗生素的耐药现状十分严峻，临床工作人员应做到密切观察，提前预防。
【关键词】肺炎克雷伯菌；产超广谱β内酰胺酶；碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌是一种重要的条件致病菌，常引起血液、痰液、尿液、胆汁、手术切口、软组织损伤等多个部位感染，也在逐渐成为医院感染重要病原菌之一。
1 资料1.1 菌株来源临床分离肺炎克雷伯菌1094株，采用美国bd公司phoenix100全自动细菌鉴仪进行菌株鉴定。
1.2 质控菌株大肠埃希菌atcc25922。
1.3 药敏纸片与培养基药敏纸片均来自于英国oxoid公司；mh 平板来自于郑州安图生物试剂公司。
2 方法2.1 whonet5.5软件进行统计分析。
2.2 esbls检测方法满足任一抑菌环直径头孢他啶/克拉维酸（30/10 μg）头孢他啶（30 μg）≥5 mm或头孢噻肟/克拉维酸（30/10 μg）头孢噻肟（30 μg）≥5 mm条件的肺炎克雷伯菌为esbls阳性株。
2.3 改良hodge试验取atcc25922配制0.5 mcf，1：10稀释成0.05 mcf，将制备的菌悬液均匀涂满整个mh平板，干燥3～5 min，将10 μg美罗培南纸片贴在mh平板中心，然后用无菌棉签蘸取待测菌或质控菌3～5个菌落，从美罗培南纸片边缘向mh琼脂板边缘划线（20～25 mm），16～20 h观察结果。
3 结果3.1 1094株肺炎克雷伯菌产esbls率为69.7%，对头孢他啶的耐药率为68.2%，对头孢噻肟的耐药率为71.3%，对头孢吡肟的耐药率为68.5%。
碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中KPC基因分布
碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中KPC基因分布杨朵;胡智颖;辛续丽【摘要】目的检测碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中KPC基因分布情况,为此类菌感染的预防与控制提供理论依据.方法改良Hodge试验检测医院临床分离肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶表型;PCR法检测KPC基因的携带率.结果 642株碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌中,Hodge试验阳性率为96.6％.KPC基因的携带率为50.9％,均为KPC-2型.结论该医院临床分离的碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌中KPC基因主要为KPC-2基因.【期刊名称】《中国感染与化疗杂志》【年(卷),期】2016(016)004【总页数】3页(P465-467)【关键词】肺炎克雷伯菌;碳青霉烯酶;KPC基因;Hodge试验【作者】杨朵;胡智颖;辛续丽【作者单位】首都医科大学附属北京世纪坛医院中心实验室,北京100038;首都医科大学附属北京世纪坛医院检验科,北京100038;首都医科大学附属北京世纪坛医院检验科,北京100038【正文语种】中文【中图分类】R378肺炎克雷伯菌是常见的医院感染病原菌，碳青霉烯类抗生素是治疗包括产ESBL在内肺炎克雷伯菌感染的重要抗菌药物。
但近年来碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的出现，给临床感染控制提出了严重挑战。
目前研究认为，对碳青霉烯类抗生素产生耐药机制主要包括细菌外膜蛋白通透性下降、产碳青霉烯酶等［1］，其中产碳青霉烯酶，特别是KPC型酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC）是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药的重要机制。
我院从2009年首次检出碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌，近年来此类菌已成为本院感染的重要致病菌，了解其对碳青霉烯类抗生素的耐药机制，了解KPC基因的分布情况，将有助于此类菌医院感染的有效控制。
1.1 材料1.1.1 菌株来源 642株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌分离自本院2011年1月-2013年12月临床标本（剔除同一患者的同一部位重复菌株）。
肺炎克雷伯菌耐药机制的研究进展
２ ． １ ． １ ｐ 一 内酰 胺 酶
革兰阴性杆菌 产生的 Ｂ ＿ 内 酰 胺 酶 是 细 菌
耐药的重要机制之一 ， 肺炎克雷伯菌几乎可以产生所有 的 内 酰胺 酶 ， 可通 过 水 解 内 酰胺 环 使 抗 菌 药 物 失 去 抗 菌 活 性 。肺 炎克 雷伯菌的 ｐ 一 内酰 胺 酶 耐 药 机 制 主 要 通 过 产 生 超 广 谱 ８ 一 内
・１ ２ ４・
西部 医 学 ２ ０ １ ４年 １月 第 ２ ６卷 第 １ 期 Ｍｅ ｄ Ｊ Ｗｅ ｓ ｔ Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ， Ｊ ａ ｎ ｕ ａ ｒ ｙ ２ ０ １ ４ ， Ｖ ｏ １ ． ２ ６ ， Ｎ ｏ ． １
肺 炎 克 雷伯 菌 耐药 机 制 的研 究进 展
贺 晓珊 综述 梅 传 忠 审校
肺 炎 克 雷 伯 菌 引 起 的 免 疫 低 下 患 者感 染 或 院 内 感染 不 断 增 多 ， 且 由 于 广 谱 抗 菌 药 物 的 广 泛 应用 甚 至 滥 用 ， 导 致 肺 炎 克 雷 伯 菌
报道的 Ａ ｍｐ Ｃ酶 有 ４ Ｏ 余 种 基 因 型 。不 同 国家 不 同地 区 Ａ ｍｐ Ｃ
洲［ ３ ］ ， 在我国以 Ｄ ＨＡ一 １基 因 型 为 主［ 。在 不 同 国家 和 地 区 ， 临
肺 炎 克 雷 伯 菌 的耐 药 机 制 主 要 包 括 ： 产生 药物灭活 酶、 形 成生物被膜 、 外膜孔蛋 白缺失 、 基 因变异 、 外排泵 作用增 强、 存
在 基 因盒 一 整合子系统 。
（ 蚌埠 医学 院 医 学检 验 系 ， 安徽 蚌埠 ２ ３ ３ ０ ３ ０ ）
【 摘要】 随 着 抗 茵 药 物 日新 月异 及 其 在 临床 治 疗 中 的广 泛 应 用 甚 至 滥 用 ， 迫使 细 茵 不 断产 生新 的 耐 药机 制 以 适 应
耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药机制研究
耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药机制研究黄峰;许元元;秦淑国【摘要】目的:探讨耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药基因及耐药特性.方法:对42株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌进行药敏试验、改良Hodge试验,并采用聚合酶链反应(PCR)方法检测细菌肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)基因.结果:42株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌中,药敏试验结果显示耐药情况严重,仅对替加环素、阿米卡星、妥布霉素、复方新诺明较敏感.改良Hodge试验及KPC基因检测全部阳性,基因测序为KPC-2型.结论:KPC-2是引起肺炎克雷伯菌耐药的主要原因,应引起临床及实验室的关注.%Objective:To explore the drug resistance gene of Klebsiella pneumoniae carbapenemase,and its resistant features.Methods:The drug sensitivity test and modified Hodge test in 42 strains of Klebsiella pneumoniae carbapenemase were performed,and the KPC gene of bacterium was detected using PCR.Results:The drug resistance in 42 strains of Klebsiella pneumoniae carbapenemase were severe,which was sensitive to the tigecycline,amikacin,tobramycin and cotrimoxazole.The detection results of modified Hodge test and KPC gene were positive,and the type KPC-2 gene was identified.Conclusions:KPC-2 is the major cause of drug resistance of Klebsiella pneumoniae,which should be paid attention to in clinic and laboratory.【期刊名称】《蚌埠医学院学报》【年(卷),期】2017(042)003【总页数】4页(P379-382)【关键词】耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌;耐药机制;改良Hodge试验【作者】黄峰;许元元;秦淑国【作者单位】皖北煤电集团总医院(蚌埠医学院第三附属医院) 检验科,安徽宿州234000;皖北煤电集团总医院(蚌埠医学院第三附属医院) 检验科,安徽宿州234000;皖北煤电集团总医院(蚌埠医学院第三附属医院) 检验科,安徽宿州234000【正文语种】中文【中图分类】R378.99肠杆菌科细菌作为医院感染和社区获得性感染的重要病原菌，可引起呼吸道、尿路等各种部位的感染以及菌血症，近年来由于抗菌药物的大量及不合理使用促进了耐药菌株的迅速扩散。
肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗菌药物的基因型研究
ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｉ ｎ ｇ ｃ ａ ｒ ｂ ａ ｐ ｅ ｎ ｅ ｍａ ｓ ｅ ｓ ， ｅ ｔ ｈ ｙ ｌ ｅ ｎ ｅ ｄ ｉ ａ ｍｉ ｎ ｅ ｔ ｅ ｔ ｒ ａ ａ ｅ ｅ ｔ ｉ ｃ ａ ｃ ｉ ｄ（ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ） ｄ ｉ ｓ ｋ ｄ ｉ ｆ ｆ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｗａ ｓ ｕ ｓ ｅ ｄ
Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｂ ｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ １ ０ ０ ０ １ｏ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇ ａ ｕ ｔ ｈ ｏ ｒ ： Ｗ Ａ ＮＧ Ｘｉ ａ ｏ － ｊ ｉ ｅ ， Ｅ ｍａ ｉ ｌ ： ｗ ｊ ｗ ｗ ｘ ｊ ＠ｙ ａ ｈ ｏ ｏ ． ｃ ｏ ｎ． ｒ ｃ ｎ 【 Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｕ ｎ ｄ ｅ ｒ ｓ ｔ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｄ ｒ ｕ ｇ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｃ ｅ ｇ ｅ ｎ ｏ ｔ ｙ ｐ ｅ ｏ ｆ Ｋｌ ｅ ｂ ｓ ｉ ｅ ｌ ｌ ａ ｐ ｎ ｅ ｕ ｍｏ ｎ ｉ ａ ｅ
，
Ｗ Ａ Ｎ Ｇ Ｘｉ ａ ｏ － ｊ ｉ ｅ ，Ｇ ＡＯ Ｈｕ ａ － ｙ ｉ ｎ ｇ ， Ｚ Ｈ Ａ ＮＧ Ｊ ｉ ｎ — ｑ ｉ ａ ｎ ． Ｃ ＨＥ ＮＧ Ｊ ｕ ｎ ｖ ． ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｌ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｏ ｆＣ ｈ ｉ ｎ ａ
肺炎克雷伯菌的临床分布及细菌耐药情况分析
2023-11-06
目录
• 引言 • 肺炎克雷伯菌的临床分布 • 细菌耐药性机制研究 • 耐药性检测与防控措施 • 结论与展望
01
引言
研究背景与意义
肺炎克雷伯菌是一种常见的医院感染病原菌，可引起肺炎、败血症和脑膜炎等严重感染，对人类健康 构成威胁。
随着抗生素的广泛使用，细菌耐药问题日益严重，肺炎克雷伯菌的耐药性也逐年上升，给临床治疗带 来极大的挑战。
03
不同地区、不同医院的细菌耐 药性存在差异，因此需要针对 不同地区和医院进行具体分析 和研究。
研究不足与展望
目前的研究还存在不足之处，如样本量不足、研究时间较短等，需要进一步扩大样本量和延长研究 时间，以获得更加准确的数据。
针对细菌耐药性的研究还需要加强，需要进一步探索和了解耐药机制和传播途径，以便更好地控制和 预防细菌耐药性的传播。
02
肺炎克雷伯菌的感染率与患者的免疫力、基础疾病、住院时间
等因素有关。
肺炎克雷伯菌的传播途径主要为呼吸道飞沫传播，也可通过接
03
触污染的医疗器械、医护人员的手等途径传播。
肺炎克雷伯菌的感染部位及临床症状
感染部位
肺炎克雷伯菌主要引起肺部感染，也可导 致其他部位感染，如脑膜炎、败血症等。
VS
临床症状
肺炎克雷伯菌感染的临床症状包括发热、 咳嗽、咳痰、气促、呼吸困难等，其他症 状还包括胸痛、乏力、食欲不振等。
感谢您的观看
THANKS
需要加强国际合作，共同应对细菌耐药性的问题，分享经验和研究成果，为全球公共卫生事业做出贡 献。
未来研究方向与价值
未来研究方向
进一步深入研究肺炎克雷伯菌的耐药机制和传播途径 ，探索有效的预防和控制方法；同时需要加强国际合 作和交流，共同应对全球细菌耐药性的问题。
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产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的耐药基因序列分析摘要：目的研究大庆地区产超广谱β-内酰胺（extended-spectrumβ-lactamases, ESBLs）肺炎克雷伯菌的基因型分布及序列变化。
方法采用聚合酶链反应（PCR）扩增对分离14 株耐药性强的产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌株的TEM 型、SHV 型、CTX-M1 型、CTX-M2 型、CTX-M8 型、CTX-M9型、OXA 型ESBLS 基因，1%琼脂糖凝胶电泳，回收DNA 片段，测序分析各基因型在耐药的产超光谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌株中的分布。
结果TEM-1、SHV-1、CTX-M-1 基因扩增阳性数分别为4、4、7、4、2。
结论分离的ESBLs 阳性的肺炎克雷伯菌存在多个耐药基因。
关键词：超广谱β-内酰胺酶；肺炎克雷伯菌；耐药性；基因型Sequencing analysis of drug resistance gene of ESBL -producing KlebsiellapneumoniaeAbstract：Objective To investigate the genetic distibution of extended-spectrum β-lactamases- (ESBLs ) producing Klebsiella pneumoniae in Daqing City. Methods The genotypes of TEM, SHV, CTX -M -1 ESBLs gene of ESBL -producing Klebsiella pneumoniae isolated from inpatients in Daqing oilfield general hospital were amplified by using PCR and the DNA fragments were recovered after electrophoresis with 1%aglucose gel. Then seqquence analysis was conducted for investigating the distribution of drug resistant genetic strains of Klebsiella pneumoniae. Results The positive rates of genotypes of TEM, SHV, CTX-M-1 ESBLs gene were 58.0% ,90.3% , 16.1%, respectively. Conclusion There are several drug resistant genotypes in the isolated ESBLs –producing Klebsiella pneumoniae.Key words: ESBLs；Klebsiella pneumoniae；Drug resistance；Genotype 超广谱β－内酰胺酶（ESBLs）主要分布于医院环境中，其基因多编码于可移动的质粒中，并由质粒介导的能赋予细菌对青霉素类、头孢菌素类、单环B2内酰胺类药物耐药的一类酶, 产ESBL s 的细菌有较高的交叉耐药和多重耐药性特点[1]。
ESBLs 的编码基因可随质粒在同种或不同种革兰氏阴性细菌间传递，对临床就诊和住院病例构成危害。
迄今为止已发现ESBLs 200 多种，主要为TEM 型，SHV型，CTX-M 型和OXA 型，PER、VEB、GES、BES 等少见类型也在增加[2]。
TEM 及SHV 型ESBLs通常编码TEM-1 和TEM-2 和SHV-1 的结构基因突变，导致酶活性中心附近的氨基酸残基被其他氨基酸或衍生物取代。
由于各地区使用抗菌素种类及剂量不尽相同，因此对本地区产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌基因型开展研究，及时准确检ESBLs，对防止ESBLs 流行、控制医院内感染和指导临床治疗有着非常重要的意义。
为此，我们对大庆油田总医院2009 年分离的16 株耐药性强的产ESBLs 肺炎克雷伯菌的基因型进行研究。
1 材料与方法1.1 菌株的来源2009 年1月~2009年12月大庆油田总医院住院患者痰、尿、血液、胸腹腔积液和各种创面分泌物中分离耐药性强的产ESBLs 肺炎克雷伯菌14 株。
1.2 试剂及仪器DNA 分子量Marker （DL2,000TM DNAmarker）、dNTP、TaqDNA 聚合酶、PCR 离心管购自TaKaRa 公司；Tris,琼脂糖（BBI 公司）；PCR 扩增仪（BIO-RAD C1000TM Thermocycler）；凝胶成像系统（美国Kodak 公司Dolphin-DOC）,台式高速低温离心机（Eppendorf 公司）；电泳仪和电泳槽（BIO-RAD）PH仪（sartorius Basic ph Meter PB-10）。
1. 2.1 细菌鉴定和药敏试验采用VITEK- Ⅱ全自动微生物分析鉴定系统,鉴定卡: GN ; 药敏测试卡:GN09。
质控菌株:大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603 和铜绿假单胞菌ATCC27853。
判定标准采用美国临床实验室标准化委员会NCCLS 2009 年推荐的方法。
1. 2.2 ESBLs检测按照美国临床实验室标准化研究所(NCCLS)标准( 2009)推荐的表型确证方法之一K-B扩散法进行操作[3],使用头孢他啶与头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟与头孢噻肟/克拉维酸纸片抑菌环直径进行比较, 2对纸片中任1对或2对加克拉维酸者比不加克拉维酸者抑菌圈直径≥5ｍｍ为ESBLs阳性,说明产超广谱β-内酰胺酶。
1.2.3基因提取将肺炎克雷伯菌转接到血平板上，37℃培养16h，单个菌落生长到直径2~3mm 时，挑取菌落至1.5ml EP 管中，加入500μl 双蒸水高温煮沸20分钟，高速离心机10000转4℃离心5min 收集菌液，吸取上清。
1.2.4 ESBLs 基因的PCR 扩增根据GenBank 公布的各型ESBLs 耐药基因序列设计TEM、SHV、CTX-M基因引物[4-5]，物序列见表1。
反应体系25u循环参数为95℃预变性10min,95℃1min,55℃50sec,72℃1min,35 个循环,最后72℃延伸10min。
PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。
表1 超广谱β- 内酰胺酶基因引物序列引物序列（5，-3，）产物大小（bp）TEM F: AAACGCTGGTGAAAGTA 750R: AGCGATCTGTCTATSHV F:ATGCGTTATATTCGCCTGTG700 R: TGCTTTGTTATTCGGGCCAACTX-M1 F: GCTGTTGTTAGGAAGTGTGC510 R: CCATTGCCCGAGGTGAAGCTXM9 F: GCAGATAATACGCAGGTG450 R: CGGCGTGGTGGTGTCTCTOXA23 F: GATGTGTCATAGTATTCGTCG460 R: TCACAACAACTAAAAGCACTG1.2.5 测序分析将PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，将PCR 扩增产物进行冷冻回收，将部分样品送大连（宝生）生物有限公司进行自带引物测序。
2 结果2.1 ESBLs 编码基因扩增结果14 株ESBLs 表型阳性的肺炎克雷伯菌中以t1、t2 为引物扩增的片段有18 个，以s1、s2 为引物扩增的片段有28 个，以c1、c2 为引物扩增的片段有5 个。
TEM-1、SHV-1、CTX-M-1 组基因扩增阳性率分别为4、4、7、2；图1 为TEM-1、SHV-1 基因PCR 扩增产物电泳结果。
图1 CTX-M1 PCR 扩增电泳结果2.2 测序结构及序列分析将TEM-1 和SHV-1 基因阳性的肺炎克雷伯菌进行编码基因DNA 测序，所得结果与GenBank序列进行比对（BLAST）,同时利用DNAStar 分析软件对测序结果和GenBank 序列进行MegAlign 基因比对和氨基酸序列比对分析结果，见表2。
表2 基因测序与GenBank序列比对结果基因菌株数对比序列号核苷酸突变TEMSHVCTX-M1CTX-M9OXA233 讨论肺炎克雷伯杆菌是人群和院内感染的重要病原体，在过去的20 多年中主要检测到了含有K1/K2 荚膜血清型的致病菌在人群中传播[1]。
随着三代头孢菌素等超广谱β-内酰胺酶类抗生素在临床上的广泛应用，产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯菌感染日益增多，这也是新一代β-内酰胺类抗菌素耐药的主要原因。
ESBLs 主要由质粒介导，易在同种属甚至不同种属细菌间传递造成爆发流行[6]。
在医院内，大量抗菌素的使用，增加了肺炎克雷伯杆菌对多种药物的拮抗。
2009 年1 月~2009 年11 月大庆油田总医院住院患者痰、血液、胸腹积液和各种创面分泌物中分离出的产ESBLs 肺炎克雷伯菌14 株，进行DNA 测序结果分析比对，结果显示TEM-1、SHV-1、CTX-M-1 基因扩增阳性率分别为58.0%、90.3%、16.1%。
产ESBLs 肺炎克雷伯菌具有多个耐药基因和多种耐药酶。
这种具有多种耐药酶的肺炎克雷伯菌的抗药性比单独产一种耐药酶的耐药性更强，也更加难以治愈，给临床的治疗带来了一定的困难，应引起临床高度重视。
参考文献：[ 1 ] 王晓梅，白玉兰，楮云卓. 产超广谱β- 内酰胺酶肺炎克雷伯菌的耐药基因序列分析[J]. 中国热带医学, 2009 ,9 (3 ):430-431.[ 2] 陈茶，黄彬，罗强，等. 产ESBLs 大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的耐药特征和基因分型研究［J］. 中国微生态学杂志，2006，18 （5）：373～375.[3]J Sambrook,E F fritsch,T Maniatis.分子克隆实验指南[Ｍ].第2版.北京:科学出版社,1999:19-21.[ 4 ] Arakawa, Y., M. Ohta, N. Kido, Y. Fuja, T. Komatsu, and N.Kato. 1986. Close evolutionary relationship between the chromosomally encoded β-lactamase gene of Klebsiella pneumoniaeN and the TEM β-lactamase gene mediated by R plasmids. FEBS Lett. 207:69-74.[ 5 ] JOSEE MERCIER AND ROGER C. LEVESQUE.1990. Cloning of SHV-2, OHIO-1, and OXA-6β-Lactamases and Cloning and Sequencing of SHyV-1 , β-Lactamase . 1577-1583[ 6 ] 陈淑贞，石蓉林，姚芬，等. 肺炎克雷伯菌产ESBLs 基因型分析［J］. 中国感染与化疗杂志，2006，6，（4）：236～239.。