发光细菌的研究和应用
天津市地表水水体污染发光细菌的急性毒性表征研究
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发光 菌 在 进行 新 陈 代 谢 时会 发 光 ， 当某 种 因素 影 响 其 正常 新 陈 代谢
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线 （ 范围），作为水质突变和 毒性应急的指 导依据 。 关键 词： 地表水 ：发光 细菌；急性毒性 中图分类号 ：Ｘ 文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：Ｉ ７ 一７ ９ ２ １ ）０ １ １ ２ ９ ６ ｜ ５ ７（ ０ ０ ４ ０ ３ —０ Ｔ
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２ ）测 定条件 。室 温要 求： １—０Ｃ ５ ３＂
４结 累厦 讨论 我 们在 ４ ｉ月期 间 通过 对地 表 水发 光 细菌 的 急性 毒性 试验 发 光损 失 ～ １
率 测定 结果见 表 ｉ ，通 过计 算初 始算术 平均值 Ａｏ ｃ及标 准偏 差值 Ｓｏ ｃ ，得 控制
范 围Ａ ｏ Ｓ ｏ ｃ ±３ｃ 。建 立综合 毒性 基准线 ，作 为应 急 （ 发地控 制 ： 培养 块 １＋． ℃， ５０ ５ 读数井 １＋ Ｙ 。 ５ Ｉ ￣
３ ）步骤 。① 将Ｍ ｃｏ ｏ ｉｒ ｔｘ Ａ ｏ ｏ ０ ｏ ｏ №ｄ ｌ ５ ０ 析仪 模 式钮 调置 “ ｅ ０ 分
Ａｕｅ 模 式 ， 使 用 ８．％ ｃｔ” １９ ＳｒｅｉｇＴｓ实验检测方式 。 ｃｅｎｎ ｅｔ
尔弧 菌为 弧菌 属发光 细菌 。 细菌 发光 可概 括 为细菌 体 内合成 的 细菌发 光 酶催化 还 原型 的黄 素单核 苷 酸 （ＭＩ ）和 长链 脂肪 醛 （Ｃ Ｏ 至少含 ８ ｃ ＦＮ１ ２ ＲＨ ， 个 ）并 在０的参 与下 发生氧 ２ 化 还原 反应 而放 出光 子 。细 菌 的发光 涉 及 多种物 质 的参 与 。而且 这些 物质 的合 成 或产 生是 细菌 的 生理代 谢 的一 个 组成 部分 ， 因此 ，只 有在 外界 条件 适 宜时 。发 光才 比较 理想 。 所 以发光 细 菌 的发光 状况 对外 界 条件 的变 化极 为 敏感 ，并 可通 过发 光 强度 的 改变很 快 反映 出来 ，这就 是为 什么 可 以利用 发 光细 菌来 检测 环境 中 有毒 、有 害物 质 的基 本原 理 ，也 是发 光细 菌 能应用 于 快速 的环 境污 染监 测 的根 本 原因 。此 方法 利用 灵 敏的 光 电测量 系 统测 定 毒 物对 发光 细菌 发 光强 度 的影 响 。毒 物 的毒 性可 以用发 光损 失率 表 示 ，也
发光细菌法测定有机污染土壤的生物毒性
Ｄ Ｙ一 Ｘ ２型生物 毒性测试仪 （ 中国科学 院南京
土壤 研究 所 ） 。
生物毒性测定仪。相对 于传统 的毒物检 测方法如 Ａ ｓ ， 方法 具有灵 敏 、 ｍｅ 等 该 快速 、 成本 低 等优 点 。 国 内也研制出相关的仪器并制定 了相应 的国家标准。 近年来该方法 已成功应用于某些污染水体和土壤的 生 物毒性 评价 上 Ｊ 。在利用 发光 细菌 对 环境 样 本 进 行生 物毒性 评 价分 析 时 ， 往 采用 样 品 的水 浸 提 往 液或稀释液。由于在 自然环境 中存在的大量有机污 染 物为非 极性 物质 ， 水溶 性差 ， 因此 其水 浸提 液或 稀 江苏Βιβλιοθήκη 业科学２０ ０ ８年第 ５期
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发光 细菌法测定有机污染土壤 的生物毒性
吴 向 华
（ 京晓庄 学院生命科学 系， 南 江苏南京 ２ １７ ） １ １ １
摘要 ： 在研究发光细 菌培养 方法 、 同有机溶剂对土壤 中有机毒 物提 取效率 、 不 土壤有机 毒物对发光 细菌 的生 物毒性基础上 ， 用发光细菌法测定 了不同来源石油污染土壤 的生物毒性 。结果表 明 ， 利 发光细菌 的发光强度 与污 染土壤的 Ｄ Ｍ Ｄ Ｏ提取 液浓度呈负相关 ， Ｃ ／ ＭＳ 但土壤 的生物毒性与其 中的污染 石油含量并 不成对应关系 。 关键词 ：土壤 ； 有机污染 ；生物 毒性 ； 测定 ；发光细菌法
释液 往往 不能 完全反 映环 境样 品 的生物 毒性 。尽 管 很多 有机溶 剂 对土壤 中有 机污 染物 具有 很好 的提 取 效果 ， 但是 大多数 有 机 溶 剂本 身对 发 光 细 菌 也具 有 较强 的生物 毒性 ， 很 大 程 度 上 限制 了发 光 细 菌 在 在 环境生 物毒 性检 测上 的应用 。本 研究 首先 筛选 对有 机污染 物具 有较 强浸 提 效 率 、 对 发 光 细 菌无 毒 或 但
生物技术在水环境监测中的应用研究
生物技术在水环境监测中的应用研究摘要：随着人类活动的不断增加，环境问题日益凸显，其中水体污染更是备受关注。
为了有效监测和修复受污染的水体，科学家们不断探索和创新，发展出了基于生物监测的技术和方法。
这些技术和方法以其独特的原理和特点，为环境保护和人类健康提供了重要的支持和指导。
本文将探讨生物监测技术的特点、原理及分类，并介绍基于生物监测的水体修复方法，旨在加深对这一领域的理解和应用。
关键词：生物技术；水环境监测；水体修复方法1 生物监测技术特点生物监测技术具有显著特点。
首先，它利用生物对环境的敏感反应，实时、准确地反映出环境质量变化，起到预警作用。
其次，生物监测技术涵盖多个生物层次，从微观的细胞到宏观的生态系统，都能提供有力的信息。
再者，此项技术非破坏性，能够长期连续监测，有利于保护生态环境。
最后，生物监测技术操作简便，成本较低，数据解读直观，使得它在环境监测、生态保护等领域被广泛应用。
总而言之，生物监测技术以其独特的优势，为维护生态安全和人类健康做出了重要贡献。
2 生物监测技术原理2.1 利用指示生物监测水质指示生物是对环境中某些污染物或环境变化特别敏感的生物。
例如，某些水生昆虫和藻类在特定的水质条件下生长或死亡。
通过观察这些生物的种群变化，可以推断出水质的状况。
若水质受到污染，这些生物的数量或种类会发生变化，从而为提供水质的信息。
2.2 借助生物测试监测水质除了观察指示生物，还可以直接利用生物测试来监测水质。
这通常涉及将某种生物置于待测水样中，观察其生长、死亡率或其他生理反应。
例如，使用鱼类或其他水生生物进行急性或慢性毒性测试，可以判断水样中的有毒物质是否超标。
这种方法可以更直接地反映水质对生物的实际影响，因此被广泛应用于水质监测中。
3 生物监测技术分类生物监测技术，主要是利用生物体及其组成部分对环境变化的敏感反应来评估环境质量。
随着科技的进步，这种技术已经发展出多种方法，以适应不同环境和监测需求。
什么是生物发光它在自然界中的作用是什么
什么是生物发光它在自然界中的作用是什么什么是生物发光？它在自然界中的作用是什么生物发光是指一些生物体能够产生并发出可见光的现象。
这种现象在自然界中非常常见，包括很多动物、植物、微生物等都能够发光。
生物发光是由生物体内部的化学反应所引起的，具有独特的生理和生态学意义。
一、生物发光的机制生物发光的机制主要有两种：生物发光蛋白质的化学反应和生物染色体改变。
第一种机制中，生物体内产生的酶会与发光底物发生反应，产生能够发出光的产物。
这种机制主要存在于昆虫、鱼类和浮游生物等。
第二种机制中，生物通过改变染色体的排列和状态来产生发光效应，这种现象主要存在于细菌和一些植物中。
二、生物发光的作用1. 防御和捕食：生物发光在自然界中起到了重要的防御和捕食作用。
例如，有些昆虫在受到威胁时会发出亮光，吸引天敌或干扰敌人；一些深海动物利用发光能力吸引猎物或迷惑捕食者。
2. 繁殖和交流：生物发光在繁殖和交流中也起到了重要的作用。
很多生物在求偶或繁殖过程中会通过发光来吸引异性或进行交流。
例如，萤火虫利用发光来吸引交配对象，它们的光信号能够传递种类、性别和交配能力等信息。
3. 导航和生物钟：生物发光还被用于导航和调节生物钟。
例如，一些浮游生物会在夜间发光，帮助它们定位和追踪养分。
另外，一些海洋生物会随着昼夜的改变而发光，调节自身的生物钟。
4. 吸引伴侣和猎物：生物发光能够吸引伴侣和猎物。
一些动物通过发光吸引伴侣，提高繁殖的成功率。
而其他一些动物则会利用发光吸引猎物，方便捕食。
5. 生态平衡：生物发光对于维持生态平衡也有一定的作用。
例如，一些发光的浮游生物能够吸引其他浮游生物前来摄食，从而控制浮游生物的数量，保持海洋生态系统的平衡。
三、生物发光的应用生物发光除了在自然界中发挥重要的作用，还被广泛应用于科学研究、医学领域和生物技术等方面。
科学家们通过研究生物发光现象，可以探索更多生物内部的化学反应和生理机制。
在医学领域，生物发光被用于生物荧光成像技术，用于检测细胞、组织和器官的活动情况。
有色样品在发光细菌测试研究中的可能和局限性
卢 布林 大学 （ 兰 ） 波
伊斯 坦布 尔技 术大 学（ 土耳其 ） 鲁 汶大 学（ 比利 时 ）
发光 细 菌 测试 以标 准 化形 式 已被
摘 要 ： 究了废 水净化 和新型 染料 开发 的新方 法。除废 水脱 色和 工业适 用性 外， 研 毒 性 测试也 必不可少 作为筛选 ， 光细 菌测试适 用于迅速评 价有 色样 品的毒 发
可自动进行颜色校正。
１２ 样 品制备 ．
光密 度 （ ９ ｍ） ４０ ｎ 必须 最 大 化至
Ｎ ａｅ 大 学（ ｅｐ ｌ 意大利 ）
Ｃ ｌｂ ｒｓｒ（ 利 时 ） ｅａ ｏ ｃｌ 比
Ｃ ｕ ｇ ａｓ Ｄ ｃｌｓ ｒ ．Ｊｎ ｈｎ ， ．Ｓｈｏｓ ｅ
Ｕ Ｚ莱比锡 （ 国） Ｆ 德
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Ｑ ｅｔ 中心 （ 国） ｕｓ ｒ ｏ 英
Ａ ａｏｚ ｌｏ ｚａ Ａ ｌ ｅｓａ ．Ｊｒｓ— ｋｌ ｋ ， ．Ｏｓ ｗｋ Ｗｉ ａ ｚ Ｋ ｅｉｄｌ ．Ｙ ｓａａ ｌ ｉ Ｅ ｎｕ ， ．Ｖ ｎｕｌ ．Ｅ ａｄ Ｓ ａｈｌ ｅ
酸性染浴（ 皮革）
菌株 ｒ ３４和ｉＳ３ ￣４ ｉ ３３ Ｇ
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直 接染浴
活性染浴
菌株 Ｐ３４和ｉ ３３ 活性污泥 Ｓ４ ｇ ３ ； Ｓ
ｊ 株 Ｐ３４ Ｇ ３ ； 性污泥 菌 Ｓ Ｊ Ｓ３ 活 ４ 和ｉ ３
到试 管 中 （ ａｈＬ ｎｅ公 司 Ｌ Ｐ Ｈ ｃ ａｇ Ｚ １７ 。 ８ ） 再经 １ ｉ 开 始 测量 。每 ５ｍｎ后
纺 梁 织 整
有色 样品在发光细菌测试研 究中的可能和局限性
Ｉ ￣ｅ ， ．Ｈ ￣ｅ ， ．Ｈ ｒｈ ｒ ．ＪｇｒＣ ａ ｒ Ｃ ｅｃ ｅ ｉ Ｈ ｄｏ ｘ 司（ 国） ｙｒｏ 公 ｔ 德
化学发光荧光成像系统用途
化学发光荧光成像系统用途化学发光荧光成像系统是一种基于化学发光和荧光原理的先进成像技术，广泛应用于生命科学研究、药物开发、环境监测等领域。
它能够提供高灵敏度和高分辨率的成像能力，使研究人员能够观察和分析生物体内的细胞、组织和分子水平的变化和交互作用。
化学发光荧光成像系统在生命科学研究中具有重要的应用。
通过标记特定的分子或细胞结构，研究人员可以使用化学发光荧光成像系统观察和研究细胞的生物过程，如细胞分裂、细胞凋亡和细胞信号转导等。
同时，该系统还可以用于研究生物分子的表达和定位，如蛋白质、核酸和糖类等。
通过观察这些分子在细胞内的分布和活动，可以深入了解生物体内的分子机制和生物过程。
化学发光荧光成像系统在药物开发中具有重要的作用。
药物研发过程中，研究人员需要评估药物在体内的药代动力学和药效学特性。
化学发光荧光成像系统可以用于药物在体内的分布和代谢动力学的研究，为药物吸收、分布、代谢和排泄过程提供可靠的数据。
此外，该系统还可以用于药物靶点的筛选和评价，通过观察药物与靶点的结合情况，评估药物的活性和选择性。
化学发光荧光成像系统在环境监测中也具有广泛的应用。
环境污染对人类健康和生态系统造成严重影响，因此，及时、准确地监测和评估环境污染物的分布和浓度对环境保护具有重要意义。
化学发光荧光成像系统可以用于监测环境中的各种污染物，如重金属、有机污染物和细菌等。
通过标记特定的分子探针，可以对污染物进行定量分析和定位，为环境污染的防治提供科学依据。
总结起来，化学发光荧光成像系统在生命科学研究、药物开发和环境监测等领域具有重要的应用价值。
它通过利用化学发光和荧光原理，提供高灵敏度和高分辨率的成像能力，使研究人员能够观察和分析生物体内的细胞、组织和分子水平的变化和交互作用。
随着技术的不断发展和创新，化学发光荧光成像系统在更多领域的应用前景将更加广阔。
发光细菌法在环境督查中的应用
当其 与 有 毒 有 害 物 质 （ 重 金 属 和 有 机 化 合 物 ） 如
对含余 氯 的 水 样 用 ｌ 硫 代 硫 酸 钠 溶 液 脱 氯 ， ％ 对ｐ Ｈ不 在 ６ ０～８ ０范 围 内 的水 样 用 氖 氧 化 钠 溶 ． ． 液或 盐酸溶 液 调 节 ，对 浑 浊 样 本 作 离 心 处 理 ，有 色样本 用蒸 馏 水或 去离 子水稀 释 。
１ ３ ４ 菌 种活 化 ．．
试 剂 水 合 （ 种 活 化 ） 时 ｆ 统 一 控 制 在 ｌ 菌 Ｈ Ｊ ５
分钟 。
１ ３ ５ 检 测 模式 ．．
１ 实 验 部 分
１ １ 样 品 来 源 ．
Ｄ ｌ Ｔ ｘ分析 仪分 别 没定 了 Ｂ—Ｔ Ｘ一 ％高 毒 ｅａｏ ｔ Ｏ ２ 性 样本 测 试 模 式 、Ｂ—Ｔ Ｘ一４ ％ 中 毒性 样 本 测 试 Ｏ ５ 模 式及 Ｂ— Ｏ ８ ． ％ 低 毒性 样 本 测试 模 式 ≥ 种 Ｔ Ｘ一 １９
发光 度 的变 化 判 断 污染 物 毒 性 大 小 ，用 相 对 发 光 度表 征毒物 所在 环境对 生 物总 体急 性毒 性 。
发 光细 菌法 已在水 质 、土壤 （ 积 物 ） 沉 、环 境 评 价 、环保 验 收 以及 生 态 规 划 中得 到 了广 泛 的应
虽然本 检 测 系统 能 在 较 宽 的温 度 范 围 （ ０～ １ ２ ￣ 内满 意地 作 ，但 是 还 是 可 以 看 到 在 不 同 ８Ｃ） 温 度下 ，测 试 数 据 有 一 定 的 变 化 ，为 加 强 测 试 所
冻 ） 及试 剂 。
分析 ，这 些 方 法 存 在 待 测 项 目多 、成 本 高 、工 作
发光细菌法快速检测水发产品中甲醛毒性的研究
束琴霞 ， 张 鹏， 张
２ ０ １ ３ 年第 ４ １ 卷第 ｌ １ 期
林， 等．发光细菌法快速检测水发产 品中甲醛毒性 的研 究［ Ｊ ］ ．江苏农 业科 学， ２ ０ １ ３ ， ４ １ （ １ １ ） ： ３ ２ ９ — ３ ３ ２
发光 细菌法快速检测水发产 品中 甲醛 毒性 的研究
束 琴 霞 ，张 鹏 ，张 林 ，邹 勇平
（ １ ． 扬州市职业大学 ， 江苏扬州 ２ ２ ５ ０ ０ ０ ； ２ ． 江苏省扬 州市产品质量 检验所 ， 江苏扬州 ２ ２ ５ ０ ０ ０ ）
摘要 ： 介 绍一种 以发光细菌 （ 青海 弧菌 Ｑ ６ ７ ） 作为检测 活体 检测水发 产品 中甲醛 毒性 的方法 。检测发 现随着 甲醛 浓度 的升高 和作用 时间延 长 ， 青海弧菌 Ｑ ６ ７的相对发光强度逐 渐降低 ， 作用 时间在 ５ ｍｉ ｎ左右 时 ， 甲醛对青海 弧菌 的
１ ． ３ ． １ 菌剂 复苏 与培 养
（ １ ） 取 ～２ ０ ｏ Ｃ保 存 的青 海 弧菌
Ｑ ６ ７冻干粉 ， 加入 ５ ｍＬ ０ ． ８ ５ ％（ 质 量分数 ， 下同 ） 的Ｎ ａ Ｃ １ 溶 液， 充分混合后于 ２ ０℃放置 １ ５ ｍ ｉ ｎ ， 使青海弧菌 Ｑ ６ ７恢 复稳 定 发光 ， 所得 菌液 待 用。 （ ２ ） 发 光 细菌 的培养 ： 青海 弧 菌培 养。培养基 配方 ： Ｉ 号， 混合盐 ｌ ２ ． ４ ９ ｇ ， 酵母膏 ５ ｇ ， 胰胨 ５ ｇ ， 甘油 ３ ｍ Ｌ ， 加水至 １ ０ ０ ０ ｍ Ｌ ， ｐ Ｈ值 ９ ． ０； Ⅱ号 ， 混 合盐 １ ０ ｇ ， 硫 酸铵 ４ ． ２ ｇ ， 葡萄糖 １ ０ ｇ ， 甘油 ３ ｍ Ｌ ， 胰胨 １ ｇ ， 加 水 至
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发光细菌的研究和应用①杜宗军② 王祥红 李海峰 池振明(中国海洋大学海洋生命学院 青岛266003)
摘 要 发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌,主要分布在海洋环境中。发光细菌及其发光基因在环境监测等领域中具有广泛的应用价值。本文综述了发光细菌的分类、发光机理及其应用。关键词 发光细菌,分类,发光基因,环境监测
1 发光细菌的分类发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌,这种可见荧光波长在450～490nm
之间,在黑暗处肉眼可见。目前,全世界已命名的发光细菌有以下几种[1,2]:①属于异短杆菌属(Xenorhabdus)的有发光异短杆菌(Xenorhabduslu2minescens);②属于发光杆菌属(Photobacterium)的有明亮发光杆菌(Photosbacteriumphosphoreum)和鳆发光杆菌(P.leiognathi);③属于希瓦氏菌属(Shewanella)的有羽田希瓦氏菌(Shewanellahanedai),以前也曾经把它归类为交替单胞菌属(Alteromonas)的海氏交替单胞菌(Alteromonashanedia);④属于弧菌属(Vibrio)的有哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、美丽弧菌生物型Ⅰ(V.splen2didusbiotypeⅠ)、费氏弧菌(V.fischeri)、火神弧菌(V.logei)和东方弧菌(V.orientalis)。霍乱弧菌(V.cholerae)和地中海弧菌(V.mediterranei)中的某些菌株有发光现象,曾有报道易北河弧菌(V.albensis)有发光现象,后将其重新分类归入霍乱弧菌(V.cholerae)。另外,我国学者分离得到一株淡水发光细菌青海弧菌(V.qing2haiensis)[3],目前还没有进入伯杰氏手册。在以上发光细菌中,发光异短杆菌(Xenorhabdusluminescens)、霍乱弧菌(V.cholerae)和青海弧菌(V.qinghaiensis)属于淡水发光菌,其余都是海洋细菌。发光细菌主要分布在海洋环境中。2 发光细菌的发光机理发光机理的研究表明[4,5],不同种类的发光细
菌的发光机理是相同的,是由特异性的荧光酶(LE)、还原性的黄素(FMNH2)、八碳以上长链脂肪
醛(RCHO)、氧分子(O
2)所参与的复杂反应,大致历
程如下:
FMNH2+LE→FMNH2・LE+O2→LE・FMNH2・O2
+RCHO→LE・FMNH2・O2・RCHO→LE+FMN+
H2O+RCOOH+光概括的说就是,细菌生物发光反应是由分子氧作用,胞内荧光酶催化,将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪
酸,同时释放出最大发光强度在波长为450～490nm
处的蓝绿光。其中三步反应产生三种中间产物,寿命极短,很难分离出来。荧光素酶是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称,细菌荧光素酶是含α、β两个多肽亚基的单加氧酶,只有两个亚基共存时才有活性。从不同海洋细菌中提取到的细菌荧光素酶其分子量差别较小。王安平等分离纯化了东方弧菌的荧光酶并对其酶学性质进行了研究,分离得到了两个分子量分别为44kD和41kD的亚基,该酶反应的最佳温度在18℃,超过25℃酶即迅速失活。
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杜宗军等:发光细菌的研究和应用①②男,1974年生,硕士,讲师;研究方向:海洋微生物学;联系人。(收稿日期:2003201223)
达尔文计划(162/8/065)资助项目。3 发光细菌的应用3.1 发光细菌在环境监测中的应用 环境中的污染物种类和数量日益增多,传统的分析鉴定手段难以达到实时、迅速、在线分析的要求。发展新的快速、准确评价各类污染物的毒性的有效方法显得非常迫切、必要。在急性毒性分析方面,新的检测手段在不断建立,其指示物包括酶、细菌、藻类、海洋浮游生物和鱼等。发光细菌由于其独特的生理特性、与现代光电检测手段完美匹配的特点而备受关注,在环境监测中的应用也越来越广泛。发光细菌在正常的生理条件下能发出波长在450～490nm的蓝绿色可见光,
在一定的试验条件下发光强度是恒定的。与外来受试物接触后,由于毒物具有抑制发光的作用,发光细菌的发光强度即有所改变,变化的程度与受试物的浓度在一定范围内呈相关关系,同时与该物质的毒性大小有关。外来受试物主要通过下面两个途径抑制细菌发光:①直接抑制参与发光反应的酶类活性;
②抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程。凡能够干扰或破坏发光细菌呼吸、生长、新陈代谢等生理过程的任何有毒物质都可以根据发光强度的变化来测定。传统的毒性测试方法用鱼或原生动物进行试验,费用昂贵且费时较多,用细菌的生长状况或死亡率作为测定环境中毒物的指标,也需要较长时间。利用发光细菌来检测有毒物质,由于有毒物质仅干扰发光细菌的发光系统,费时较少且灵敏度高,操作简便,结果准确,所以利用发光细菌的发光强度作为指标来监测有毒物质,在国内外越来越受到重视。吴自荣等[6]利用发光细菌快速分析大气污染;张秀君等[7]利用发光细菌监测废水的综合毒性;李彬等[8]利用发光细菌诊断重金属污染土壤毒性;Yates
等[9]对黄曲霉素B1、桔霉素等8种霉菌毒素进行了发光细菌分析,结果发现8种毒素的毒性次序与哺乳动物细胞毒性试验结果一致。利用发光细菌制作生物传感器,是人们研究的热点之一。目前制作生物传感器识别元件的生物材料有酶、菌体细胞、抗原类物质和核酸等,其中纯化的酶类经常用作生物敏感材料。但是纯酶价格很高而且容易失活,难以长期保存及使用,与酶相比,微生物细胞易于制备和保存,而且其中的活性酶类始终保持稳定状态,可以有效延长识别元件的使用寿命。因此,微生物细胞作为制备识别元件的生物材
料,具有一定的优势。研究表明,发光细菌的发光强度与某些污染物的浓度呈较好的线性关系,能够稳定、灵敏、快速地反映环境中污染物的浓度变化,因此,利用发光细菌制备识别元件,成为国内外传感器研究和发展的热点。20世纪80年代初美国Beck2man公司推出功能完备的生物毒性测试仪,它具有应用范围广,灵敏度高,相关性好,反应速度快等优点,发光细菌毒性测试(Luminescentbacteriatoxicity
test,L.B.T.)技术在世界范围内迅速推广。黄正
等[10,11]利用发光细菌作为生物敏感材料,研制了用于污染物毒性监测的传感器,并且进行了环境中有毒污染物的快速检测。AlisonM.Horsburgh等[12]利用基于发光细菌的生物传感器对水环境中的工业污染物进行了检测。随着科技的进步,L.B.T.技术与其他分析技术联合应用,扩大了应用范围,取得了很多成果。黄正等[13]将L.B.T.技术与Ames致突变试验、色谱/质谱分析方法结合起来,分析了武汉市工业废水的急性毒性、遗传毒性和主要毒物。近年来,利用发光细菌毒性试验检测环境污染物急性毒性备受重视,我国于1995年将这一方法列为环境毒性检测的标准方法(GB/T1544121995)。相信这一技术会在我国的环保事业中发挥更大的作用。3.2 发光基因的应用3.2.1 发光基因的组成发光基因(luxgene)系统中包括结构基因lux
C,D,A,B,E和调节基因luxI和luxR等。从不同发光细菌中分离得到的发光基因其种类和数量有所差异,例如luxF仅发现于明亮发光杆菌,但以上五个结构基因luxC,D,A,B,E是普遍存在于已知的所有发光细菌中的。编码菌荧光素酶的基因是luxA和luxB,在lux操纵子中,luxA和luxB是紧密相连的。以哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)为例,其luxA基因中含有1065bp,编码的α亚基是355个氨基酸的多肽,分子量为40kD;luxB基因中含有972bp,编码的β亚基是有324个氨基酸的多肽,分子量为36kD。由α、β两亚基组成的荧光酶的分子量为76kD。编码脂肪酸还原酶(多肽转移酶和还原酶)的luxC和luxD位于luxA、luxB基因的上游一侧,编码合成酶的luxE基因位于luxA,luxB基因的下游一侧。luxC含有1431bp,编码的蛋白质含有477个氨基酸,分子量为55kD;luxD编码的蛋白质分子量为33kD;luxE编码的蛋白质分子量为42kD。在明亮发光杆菌中还发现有luxF基因,
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高技术通讯 2003112它通常位于luxB和luxE之间,其编码的蛋白质分子量为26kD左右,但luxF基因在弧菌属和异短杆菌属中的发光基因系统中尚未被发现。在以上所有菌株的操纵子中,这些基因的顺序都相同,均为luxCDAB(F)E。在lux系统中,结构基因上游有2个调节基因,它们是luxI和luxR。它们分别属于两个不同的操纵子之中,luxI在右面的操纵子中,右面的操纵子中还含有luxCDAB(F)E基因,luxI位于luxC的上游。lux系统的整个结构如下:luxR,luxICDAB(F)E。luxI编码的是发光细菌自诱导物(autoin2ducer)因子合成酶,luxR编码的是发光系统的调节蛋白。研究表明,luxI和luxR基因的表达产物都是lux系统完整表达并产生发光的调节物质,任何一个基因的有效突变都会改变lux系统的表达水平,甚至使发光细菌变为暗变种。3.2.2 lux基因作为标记基因和报告基因发光细菌所含的发光基因(luxgene)表达的直接结果是产生生物发光,非常直观而且易于检测,因而被广泛应用于基因操作,作为标记(marker)基因和报告(reporter)基因来研究基因的转导、表达和调控。另外,通过基因工程而产生的很多基因工程发光细菌的研究和应用也很有价值。完整的发光基因系统已经被成功地转入其他细胞中,如原核细胞、真核细胞和哺乳动物细胞。lux基因可以作为一个很好的标记基因重组在质粒载体或其他载体上。若将发光基因系统中的结构基因放在一个被试的启动子的下游,一并插入载体DNA中进行转导实验,可通过宿主细胞是否发光确定转导是否成功,并通过宿主细胞的发光强度的高低来确定发光基因的转录表达水平和结构基因上游的启动子的活性大小。另外,还可以用发光基因来研究终止子(terminator)的活性大小,以及研究其他细胞内的某些基因的表达与调控的规律。利用含有lux系统的具有感染力的载体(噬菌体)在感染宿主细胞时能产生生物发光的现象,可以研究其感染的过程和机理。3.2.3 基因工程发光细菌及其应用基因工程发光细菌是指通过基因工程技术将lux系统导入其他非发光宿主细胞后,形成一类能够发光的细菌。利用基因工程发光细菌可以快速测定化学物质及环境污染物的毒性,确定生物的存活能力,快速确定环境污染的程度以及进行环境质量的评价。还可以利用基因工程发光细菌进行细菌在土壤和水体中分布的研究等。lux基因作为报告基因,用其构建基因工程微生物,通过对光线的检测可以对微生物在环境中的生长、分布、活性等进行实时在线监测。王平等[14]研究了发光酶基因标记的荧光假单胞菌在小麦根圈的定植动态。柏建玲等[15]利用发光酶基因标记技术跟踪棉花根圈中的绿针假单胞菌。刘健等[16]通过三亲本杂交方法成功地用发光酶基因标记巨大芽孢杆菌ATCC14581,获得的标记菌株ATCC145812L在不同条件下能稳定发光。将该标记菌株制成微生物制剂,并将其接种小麦,进一步研究了它在小麦根际的定殖动态和散布规律,取得了满意的结果。某些细菌长期生活在含有某种化学物质的环境中,细菌基因组中含有对该物质具有特异性的诱导基因和降解基因,或具有对该物质的抗性基因。将这些基因与lux基因融合构成重组体,在特异的化学物质存在时产生诱导作用,启动诱导基因并导致lux基因表达,而由重组体的发光与否就可得知某化学物质是否存在。研究者们利用细菌对汞的抗性是依赖于Hg2+与merR(汞抗性基因的调节基因)基因产物的结合和表达激活的原理,构建了由merR基因和luxAB基因融合的质粒载体,建立了发光强度与汞含量的关系。该系统灵敏度高而且专一性很强,用这种方法可检测出环境中纳克级的汞[17]。O.Selifonova等[18]将汞依赖性基因工程发光细菌做成光纤传感器,其检出灵敏度可达1nmol/