最新 丝状真菌常见的筛选标记方法综述-精品
丝状真菌霉菌
➢ 分布及与人类的关系 ➢ 细胞的形态和结构 ➢ 霉菌的菌落特征 ➢ 霉菌的繁殖 ➢ 霉菌的代表属
霉菌和酵母同属于真菌。
霉菌：丝状真菌的统称。凡是在营养基质上能形成绒毛状、 网状或絮状菌丝体的真菌（除少数外），统称为霉菌。 按Smith分类系统，霉菌分属于真菌界的藻状菌纲 、子 囊 菌纲和半知菌类。
3、子囊孢子 在子囊内形成的有性孢子。形成子囊孢子是子囊菌纲的主 要特征。 子囊：两性细胞接触以后形成的囊状结构。子囊有球形、 棒形、圆筒形、长方形等，因种而异。 子囊内孢子通常是1~8个。 子囊孢子的形状、大小、颜色也各不相同。 不同的子囊菌形成子囊的方式不同。 最简单的是两个营养细胞结合形成子囊，细胞核分裂形成 子核，每一子核形成一个子囊孢子。例：酿酒酵母。
四、霉菌的繁殖
（一）霉菌的无性繁殖
繁 殖方式
孢子
菌 丝片段
不经过两个性细胞的结合， 只是由营养细胞分裂或分化而 形成同种新个体的过程。
霉菌的无性繁殖主要通过 产生以下四种类型的无性孢子 来实现。
有性孢子
无性孢子
卵孢子 接合孢子 子囊孢子 担孢子
孢囊孢子 分生孢子 节孢子 后垣孢子
1、孢囊孢子 由于生于孢子囊内，又叫内生孢子。 它是由气生菌丝顶端膨大形成特殊 囊
营养菌丝的特异化 ①假根：是根霉属（Rhizopus）真菌的匍匐枝与基质接触处 分化形成的根状菌丝，它起固着和吸收营养的作用。 ②匍匐菌丝：毛霉目真菌在固体基质上常形成与表面平行、 具有延伸功能的菌丝，称匍匐菌丝 ③吸器：是某些寄生性真菌侵入寄主细胞内形成指状、球 状 或丛枝状结构，用以吸收寄主细胞中的养料。 ④子实体：是由真菌的营养菌丝和生殖菌丝缠结而成的具 有 一定形状的产孢结构，如伞菌的子实体呈伞状。 ⑤菌核：是由菌丝团组成的一种硬的休眠体，一般有暗色 的 外皮，在条件适宜时可以生出分生孢子梗、菌丝子实体等。
检测真菌的方法
检测真菌的方法真菌是一类具有菌丝体结构的生物，它们在自然界中广泛分布，并且在很多生物体中起着重要的生理作用。
然而，真菌也能够引发人类和动植物的病理反应，影响生产和健康。
因此，如何检测真菌成为了一个重要的问题。
本文将介绍几种检测真菌的方法。
一、直接镜检法该方法是直接观察病原微生物（包括真菌）的生长繁殖和形态特征。
直接镜检法简单、快速、较为经济，是常规检测方法之一。
它适用于疾病的早期诊断和病原微生物初步分类、计数等方面。
但是，该方法不能确定种属和菌株的差异，有误判的可能性。
二、培养法其原理是利用不同的培养基制备环境，为病原微生物的生长提供必要的生理和营养条件，并通过形态、生理、生化、分子生物学等特征分析，确定分离出的病原微生物属种和种属。
培养法在临床医学和食品工业中得到广泛应用。
该方法能够准确分离和鉴定真菌，但是培养时间和环境条件对结果产生影响；而且对于一些新的真菌品种，由于其生长繁殖特点和生理生化过程不同，使用的培养基种类、组成和培养条件也都需要不同的优化。
三、免疫学方法免疫学方法是运用生物学、生物技术、免疫学等学科知识的一种检测方法。
它包括免疫荧光法、免疫印迹法、酶联免疫法等。
特别是近年来的分子生物学技术进步，使免疫学方法在真菌检测中越来越得到重视和应用。
该方法准确度高、快速、灵敏性强，但目前仍有很多真菌无法检测。
四、核酸检测法该方法是通过对真菌的核酸特征进行检测，确定其属种和种属甚至公共和个体差异。
这种检测方法通常与PCR技术相结合，克服了繁琐、耗时的传统方法的缺点，可以在较短的时间内准确检测出真菌。
核酸检测法适用于疾病的早期诊断和预防，它是一种非常有效的检测方法。
总之，选择不同的检测方法应根据需要、条件、目的和实际情况进行综合考虑。
当然，随着科技的发展和现代生物技术的进步，相信真菌检测技术处理能力将会朝着完整、精准、高效和自动化的方向发展。
植物病原真菌的鉴定方法
植物病原真菌的鉴定方法植物病害是农业生产中的重要问题之一，而真菌是引起植物病害的主要病原体之一。
因此，准确鉴定植物病原真菌对于病害的防治至关重要。
本文将介绍几种常用的植物病原真菌鉴定方法。
1. 形态学鉴定法形态学鉴定法是最常用的植物病原真菌鉴定方法之一。
通过观察真菌的菌丝、分生孢子、子实体等形态特征，结合菌丝生长速度、色素产生等特征，可以初步判断真菌的种类。
这种方法简单直观，适用于广泛的真菌鉴定，但对于形态相近的真菌种类鉴定可能存在一定的困难。
2. 分子生物学鉴定法随着分子生物学技术的发展，分子生物学鉴定法逐渐成为植物病原真菌鉴定的重要手段。
常用的分子生物学鉴定方法包括PCR、DNA 条形码技术、扩增子测序等。
这些方法通过分析真菌的基因序列，可以准确鉴定真菌的种类，并进一步研究其亲缘关系和进化途径。
分子生物学鉴定法具有高度的准确性和灵敏度，但需要一定的实验条件和设备。
3. 生理生化鉴定法生理生化鉴定法是通过观察真菌在特定生理和生化条件下的反应，来判断真菌的种类。
这种方法主要通过检测真菌的代谢产物、酶活性、生长特性等来鉴定真菌。
常用的生理生化鉴定方法包括碳源利用试验、酶谱分析、生长温度范围等。
生理生化鉴定法简单易行，不需要复杂的实验条件，但对于一些形态相似的真菌鉴定可能存在局限性。
4. 免疫学鉴定法免疫学鉴定法是利用真菌特异性抗原与抗体的反应，来鉴定真菌的种类。
常用的免疫学鉴定方法包括免疫荧光、酶联免疫吸附实验等。
这些方法通过检测真菌特异性抗原与抗体结合的反应，可以快速准确地鉴定真菌的种类。
免疫学鉴定法具有高度的特异性和灵敏度，但需要一定的实验条件和设备。
总结起来，植物病原真菌的鉴定方法有形态学鉴定法、分子生物学鉴定法、生理生化鉴定法和免疫学鉴定法等。
不同的鉴定方法各有优劣，可以根据具体情况选择合适的方法。
同时，多种鉴定方法的综合应用可以提高鉴定的准确性和可靠性，为植物病害的防治提供重要的科学依据。
ITS2序列鉴定临床分离丝状真菌共4页
ITS2序列鉴定临床分离丝状真菌随着免疫抑制剂、广谱抗生素的广泛应用以及临床侵入性诊疗技术的广泛开展，临床深部真菌感染病例增多，尤其是丝状真菌引起的感染，对该类疾病的早期诊断对抗真菌治疗效果相当关键[1]。
丝状真菌采用传统的形态学检查，需要丰富的经验，而且耗时较长，不利于临床的快速、准确诊断。
随着分子生物学技术的飞速发展，人们发现真菌的5.8S rRNA基因和28S rRNA基因具有保守序列，它们之间的ITS2序列为可变区，具有属种差异[2]。
本研究建立以ITS2为靶序列鉴定临床分离丝状真菌的分子生物诊断方法。
1 材料和方法1.1真菌菌株本院微生物室和皮肤科实验室保存的真菌菌株，包括白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、新生隐球菌。
阴性对照为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、人类血细胞基因组。
1.2 临床分离丝状真菌临床分离7株丝状真菌，标本来源分别是血液3例、眼分泌物2例、耳道脓液2例。
1.3 DNA模板制备真菌菌株的DNA提取采用TaKaRa公司试剂盒（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）提取。
具体步骤如下：①50μl Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR于灭菌的 EP管中。
②用灭菌枪头挑取单菌落，置于EP管中搅动几下后取出。
③80℃热变性 15 分钟后，低速离心，取1～5μl 裂解后的上清液作为 PCR 反应的模板。
1.4 真菌ITS2序列扩增通用引物序列[3]ITS86-F：5'-gtgaatcatcgaatctttgaac-3'，ITS4-R：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'，目的片段194bp～494bp。
PCR反应总体积50μl，10×buffer 5μl ，dNTP终浓度为200μmol/L，上下游引物终浓度分别为0.2μmol/L， DNA 模板5μl，TaqDNA聚合酶1.25 U，加入灭菌去离子水至50μl。
菌种分离筛选
菌种分离筛选的意义
促进科学研究
拓展生物技术应用
通过菌种分离筛选，可以发现新的微 生物资源，揭示微生物的多样性和生 态分布规律，为微生物学和生态学研 究提供有力支持。
稀释分离法的操作步骤包括将菌液进 行连续稀释、涂布、培养和挑选单菌 落。
稀释分离法适用于从大量菌液中分离 单菌落，尤其适用于难以在固体培养 基上生长的微生物。
选择性培养基分离法
选择性培养基分离法是根据不同微生物的营养需求和代谢特点，配制具有选择性抑 制某些微生物生长的培养基，从而分离特定微生物的方法。
智能化和高通量筛选技术 的研发
利用人工智能和机器人技术， 实现菌种筛选的自动化和高通 量，提高筛选效率和准确性。
跨界融合与协同创新
加强不同学科之间的交叉融合 ，如生物学、化学、物理学、 工程学等，以多学科的视角和 方法推动菌种筛选技术的发展 和应用。
伦理和安全问题关注
随着菌种分离筛选技术的不断 发展，伦理和安全问题也日益 凸显。应关注技术应用可能带 来的生态风险、健康风险等问 题，制定相应的伦理规范和安 全评估体系。
对分离得到的单菌落进行纯化培养，通过反 复划线分离和培养，获得纯化的菌种。
菌种的筛选和鉴定
筛选
根据需要筛选具有特定性质的菌种，如高产酶、高抗菌等。
鉴定
采用形态学、生理生化、基因测序等方法对筛选得到的菌种进行鉴定，确定其分类学地位和特性。
05
菌种筛选的应用
在工业生产中的应用
01
02
03
生物发酵
通过筛选具有高发酵活性 的菌种，提高发酵产物的 产量和品质，如酒精、酵 母、抗生素等。
植物病原真菌的鉴定方法
植物病原真菌的鉴定方法
1.细胞学观察方法
细胞学观察是一种基本的方法，可以通过显微镜观察到真菌的形态特征，包括菌丝、分生孢子、子囊果或担子菌等。
通常需要在标本中涂抹或切片，并使用染色技术（如孢子染色）增强对真菌结构的观察。
这种方法可以快速初步确定是否存在真菌感染。
2.分离培养方法
将病部组织切片或分离的孢子直接接种在富含营养物质的培养基上，可以有效地分离出感染的真菌。
不同真菌对培养基的需求不同，例如选择富含蔗糖、白蛋白、琼脂（PDA）的培养基，则可以培养出广泛的真菌种类。
培养后真菌形成的菌落形态也是进行鉴定的重要参考依据。
3.DNA分子鉴定方法
分子鉴定方法基于真菌特定的DNA序列进行分析，通过PCR扩增和测序技术可以确定真菌的物种。
这种鉴定方法具有高度的准确性和重复性，可以快速识别具有高度相似形态特征的真菌。
4.抗体检测方法
抗体检测方法利用特异性抗体与真菌的抗原结合，通过形成特定的免疫复合物来确定真菌的存在。
这种方法常用于快速筛查和初步鉴定真菌感染，但受到抗体的特异性和敏感性的限制。
5.生物学鉴定方法
生物学鉴定方法通过观察真菌的生物学特性，如生长速度、菌落形态、分生孢子形态和产孢情况，进行鉴定。
这些特性可能受到环境条件的影响，因此需要与其他鉴定方法相结合使用。
微生物育种的相关筛选的方法及其重要价值
微生物育种的相关筛选的方法及其重要价值微生物育种是通过选择和培育具有特定性状的微生物菌株，以满足特定需求或发展新的工业功能。
为了实现这一目标，筛选方法是不可或缺的工具。
本文将介绍微生物育种中常用的筛选方法，并探讨其重要价值。
一、筛选方法1.传统筛选方法：传统筛选方法是指基于微生物生长、代谢、生理特征以及形态特征等方面进行的筛选。
常见的传统筛选方法包括菌落形态分析、生理生化检测、生产物质分析等。
这些方法简单易行，成本较低，适用于分离和鉴定微生物菌株。
2.高通量筛选方法：高通量筛选方法利用自动化和机器学习等技术，实现对大量样品的快速筛选。
常见的高通量筛选方法包括微孔板筛选、微阵列技术、流式细胞术等。
这些方法能够高效地筛选出具有特定产物或特定代谢能力的菌株，并加速微生物育种的进程。
3.分子筛选方法：分子筛选方法基于微生物的遗传信息，通过检测特定基因或基因群的表达和变异情况，实现对菌株的筛选。
常见的分子筛选方法包括聚合酶链反应（PCR）、基因芯片技术、基因测序等。
这些方法具有高灵敏度和高分辨率，能够准确地鉴定菌株，并筛选出具有特定基因组或基因表达特征的菌株。
4.代谢组学筛选方法：代谢组学筛选方法通过分析微生物代谢产物的组成和变化，实现对菌株的筛选。
常见的代谢组学筛选方法包括气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）等。
这些方法能够全面地分析菌株的代谢产物，了解其代谢通路和代谢谱系，从而筛选出具有特定代谢能力的菌株。
二、重要价值1.发现新的功能菌株：微生物具有丰富的代谢和生理功能，通过筛选方法能够发现新的微生物菌株，探索其新的功能和应用价值。
例如，通过高通量筛选方法发现了具有高温耐受性、低成本生产重要生化物质等特点的菌株，为工业领域和生物制药领域提供了新的应用途径。
2.提高产物产量和质量：微生物育种的目标之一是提高目标产物的产量和质量。
通过筛选方法能够选择出优良的菌株，通过优化培养条件和代谢调控等手段，实现特定产物的高效生产。
菌种筛选方法
常用的菌种的筛选方法如下：（1）施加选择性压力分离法主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势。
而得以快速分离纯化的目的。
如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。
在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。
如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。
（2）随机分离方法有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。
A、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。
实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。
B、抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。
原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。
B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。
B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。
C、生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。
首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3天后，用紫外线杀司长好的菌落，再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液，培养16小时后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。
菌的筛选方法有哪些
菌的筛选方法有哪些
菌的筛选方法有以下几种：
1. 形态学筛选：根据菌落的形态特征（如大小、形状、颜色等）来进行初步筛选。
2. 生理生化特性筛选：通过对菌株的生理生化特性进行分析，如对不同营养源的利用能力、产酶能力、耐受性等进行测试来筛选。
3. 抗生素敏感性筛选：利用不同抗生素的敏感性测试，通过测定菌株对抗生素的敏感性来筛选。
4. 基因组学筛选：通过对菌株的基因组进行测序和分析，筛选出具有特定基因特征的菌株。
5. 代谢产物筛选：通过检测菌株产生的次生代谢产物，如抗生素、酶、激素等来筛选。
6. 生物活性筛选：通过对菌株的抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等生物活性进行测试来筛选。
7. 分子生物学筛选：利用PCR、RT-PCR等技术，对菌株进行特定基因的检测
和表达分析，筛选出特定基因表达水平高的菌株。
8. 一般筛选方法：菌落刺激、利用各类介质进行培养筛选、蓝白斑筛选等方法。
菌种鉴定方法及手段真菌细菌检测
菌种鉴定方法及手段真菌细菌检测菌种鉴定是指通过特定的方法和手段，对样品中存在的真菌和细菌进行鉴定和分类的过程。
下面将介绍几种常见的菌种鉴定方法及手段。
1.形态学鉴定：形态学鉴定是根据菌落形态、菌丝形态和孢子形态等特征来鉴定菌种的一种方法。
常见的形态学鉴定方法包括裸眼观察、显微镜观察、染色观察等。
裸眼观察主要通过观察菌落的颜色、形状、质地等特征，结合菌丝形态进行初步判断。
显微镜观察可以观察到菌丝的形态、孢子的形状、颜色等细节特征，通过比对菌种鉴定手册等资料进行鉴定。
2.生理代谢鉴定：生理代谢鉴定是通过菌株在不同培养基上的生理代谢特点来鉴定菌种的方法。
常见的生理代谢鉴定方法包括生理生化鉴定、生长温度范围鉴定、碳源利用鉴定、氮源利用鉴定等。
通过测定菌株在不同培养基上的生长速率、产酶能力、酸碱度变化、利用不同碳源和氮源等特征，判断菌株所属的种属。
3.分子生物学鉴定：分子生物学鉴定是通过检测菌株的DNA序列来鉴定菌种的一种方法。
常见的分子生物学鉴定方法包括PCR技术、基因测序、DNA指纹图谱鉴定等。
通过提取菌株的DNA，选择合适的引物进行PCR扩增，再通过基因测序获得菌株的DNA序列，通过比对菌株的DNA序列与数据库中已知的菌种进行比对，确定菌株所属的种属。
4.免疫学鉴定：免疫学鉴定是通过检测菌株与特定抗原的反应关系来鉴定菌种的方法。
常见的免疫鉴定方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹等。
通过与特定抗原结合，通过特异性抗体的反应来进行菌种的鉴定。
5.生化鉴定：生化鉴定是通过检测菌株的生化活性来鉴定菌种的方法。
常见的生化鉴定方法包括生化试剂盒、色谱分析、质谱分析等。
通过检测菌株在不同生化试剂上的产物或反应物的变化，进行菌种的鉴定。
综上所述，菌种鉴定方法及手段包括形态学鉴定、生理代谢鉴定、分子生物学鉴定、免疫学鉴定和生化鉴定等多种方法和手段。
不同的鉴定方法可以互相补充，提高鉴定的准确性和可靠性。
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丝状真菌常见的筛选标记方法综述摘要：随着基因组时代的发展，主要丝状真菌基因组测序基本完成而被广泛应用于工业，农业，等领域。
然而丝状真菌的遗传转化效率极低，为了保证在大量非转化子背景下能筛选到目标转化子，恰当的筛选标记显得尤为重要。
目前，在丝状真菌的遗传转化过程中常用的筛选标记可分为两类:药物抗性筛选标记和营养缺陷型筛选标记。
但两者均具有一定的局限性，为此科研人员利用最新研究的基因组编辑技术对筛选标记加以修饰改造，以更好地用于遗传筛选。
本文综述了目前常用的遗传筛选系统的分子机制及运用基因组编辑技术改造的新型筛选标记理论，为丝状真菌在各领域更广泛的应用奠定基础。
关键词：丝状真菌; 筛选标记; 营养筛选; 抗性筛选; 基因组编辑 ;Abstract：With the booming of the genome era, the whole genome sequencing of important filamentous fungi has been basically completed and is widely used in the fields of industry, agriculture and medicine. However, the genetic transformation efficiency of filamentous fungi is extremely low. In order to ensure that positive transformants can be picked out from a large number of non-transformed colonies. Therefore appropriate selectable markers are particularly important. At present, the commonly used selectable markers in the genetic transformation of filamentous fungi can be divided into two categories: drug-resistance selectable markers and auxotrophic selectable markers. However, both of them have distinct limitations. For this reason, researchers use the latest genome editing technology to modify the selectable markers for better genetic selection. This article reviews the current genetic selection system and new screening marker theory modified by genome editing technology, which lays a foundation for a broader application prospect of filamentous fungi in various fields.Keyword：Filamentous fungi; Selectable marker; Auxotrophic selection; Drug-resistant selection; Genomic editing;丝状真菌(Filamentous fungi)是一类重要的真核微生物，广泛存在于自然界中，并在工业、农业和医药等领域发挥着重要作用。
例如，里氏木霉(Trichoderma reesei)、黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)被广泛用于生产工业酶制剂(如纤维素酶、葡萄糖淀粉酶和淀粉酶等)和有机酸(如柠檬酸等)。
与细菌、酵母相比，丝状真菌具有较高的蛋白质分泌能力。
例如，传统诱变后的里氏木霉经发酵工艺优化后，自身纤维素酶分泌水平可达40 g/L，甚至更高[1]。
而且它还具有转运分泌蛋白到胞外的能力，这对蛋白产物的分离纯化非常有利；目前仅有几种酵母菌的分泌蛋白可达到g/L级的水平[2]，而黑曲霉分泌的葡萄糖淀粉酶水平可达25?30 g/L[3]。
因此，丝状真菌作为细胞工厂生产外源蛋白也受到广泛关注。
除此之外，黑曲霉也是柠檬酸工业化生产的主要发酵菌株，并有科研人员成功构建由原生质体-PEG介导的高产柠檬酸黑曲霉菌株的遗传转化体系，为柠檬酸工业化发展提供可能[4]。
农业上，丝状真菌一方面会引起农作物病害，如引起水稻稻瘟病的病原真菌——稻瘟菌(Magnaporthe grisea)可侵染多种禾本科植物；另一方面则具有生物防治和土壤修复功能，木霉属具有产生多种抗生素物质的能力以及寄生其他真菌的能力，如绿色木霉(Trichoderma viride)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)可诱导一系列植物产生对多种植物病原体局部和系统的抗性。
当其孢子添加到土壤中时，它们与植物根部接触并在根表面上发芽和生长，同时会产生引发植物防御反应的化合物，除此之外，还可以增加养分吸收和氮利用效率，溶解土壤中的养分，起到修复的作用[5]。
医药上，临床上广泛使用的抗生素——青霉素和头孢菌素分别由产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)产生。
在现代生物技术不断发展的今天，遗传操作体系的建立对丝状真菌在各领域的进一步发展具有重要意义。
构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)等因结构相对简单而被作为真核微生物的“模式”菌在基础研究领域发挥着不可替代的作用。
1979年首次将DNA重组技术应用于粗糙脉孢菌，这对丝状真菌产物形成的分子基础研究及代谢工程育种具有重大意义[6]。
但大多数非模式丝状真菌的分子遗传学基础研究尚不明确。
近年来，1 000个真菌基因组计划的完成(/)为非模式丝状真菌的研究提供更有力的手段[7]。
在功能基因组时代，从分子遗传水平上深入研究丝状真菌，尽可能发挥其在工业、农业、医药及基础生物研究等方面的作用，对其遗传转化的研究是十分必要的。
自1973年Tatum等利用肌醇缺陷型(inl?)粗糙脉孢菌进行转化实验以来[8]，尤其近10年，丝状真菌遗传转化系统研究发展迅速。
据统计，到目前为止已在100多种丝状真菌中成功进行了转化[9]。
我们课题组长期从事于玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、谷子弯孢菌(Cochliobolus lunatus)、粟弯孢霉叶斑病菌(Curvularia lunata)等丝状真菌在生长，发育及致病性机理相关基因的研究。
如构建玉米大斑病菌的漆酶基因Stlac2敲除突变体，发现该基因参与细胞壁完整性，黑色素生物合成以及附着体和分生孢子形成的重要过程[10]；构建灰葡萄孢致病相关基因的RNAi突变体，探究病菌侵染与致病的分子机制，为制定持久控制灰霉病提供理论依据及实验基础[11,12]；利用RACE技术成功克隆谷子弯孢病菌中编码海藻糖酶基因——citre基因，研究发现该基因参与病菌生长发育及致病过程，为以海藻糖酶为靶位点的化学农药防控研究奠定基础[13]；粟弯孢霉叶斑病是由新月弯孢病菌引起的一种重要谷子叶部病害，通过粟弯孢霉叶斑病菌致病相关基因的克隆和功能分析，对致病机制及防御具有重要指导意义[14]。
然而在基因转化过程中，为保证从大量非转化子背景下能快速筛选到目标转化子或在转化子纯培养过程中避免重组基因的丢失，必须依赖于特异性筛选标记基因，使其在特定的生长压力下得到选择性培养[15]。
筛选标记基因可使转化子获得自身所不具备的新的遗传特性；是遗传转化载体所必备的基本元件；是利用特定的选择培养基，筛选转化子的一类特殊标记基因。
目前，常见的筛选标记主要分三类：第一类为营养筛选，包括氮源和碳源营养基因及营养缺陷型互补型标记基因，通过转入的标记基因与受体菌突变基因互补，使受体菌恢复野生型；第二类为药物抗性标记基因，该基因的转入使受体菌在一定药物浓度下正常生长，表现药物抗性；第三类是功能附加型筛选标记，因质粒携带宿主细胞本身没有的基因而赋予转化子新的基因功能，进行特异性筛选。
1 营养筛选营养筛选是因营养缺陷型菌株合成或分解代谢途径异常而通过外源物质补救进行遗传转化筛选的方式。
营养缺陷型菌株是指经自然或人为突变致使代谢途径中某一过程发生缺陷，丧失合成某种物质的能力，必须外源添加该营养物质才能正常生长的突变菌株。
目前常用的营养筛选分为两类：第一类是氮源和碳源营养基因；第二类是营养缺陷型互补基因。
氮源和碳源营养基因标记在受体菌染色体中无同源序列，将标记基因插入到受体菌染色体的特定位点产生突变型表达，结果显示只有转化子能够在含特定氮源或碳源培养基上正常生长，野生型则不能。
此类应用较为广泛的有：amdS基因、niaD基因、glmS基因等。
营养缺陷型互补基因是通过转入的标记基因与相应营养缺陷型菌株遗传互补恢复正常生长，为转化子提供一种正向选择。
此类应用最为广泛的有pyrG基因、trpC基因、agaA基因及argB基因等。
1.1 氮源和碳源营养基因1.1.1 amdS氮源营养筛选基因构巢曲霉中amdS基因编码的乙酰胺酶能将乙酰胺降解成氨从而获得其生长所需氮源，而黑曲霉、产黄青霉及其它丝状真菌则不能合成此酶，即没有能力利用乙酰胺。
为此，它们只有从载体上获得乙酰胺基因来表达乙酰胺酶，才能在以乙酰胺作为唯一氮源的培养基上正常生长，而不含amdS的野生型则生长较差，实现转化子筛选[16]。
因此，amdS基因是大多数丝状真菌(除构巢曲霉)转化很好的筛选标记。
1.1.2 niaD氮源营养筛选基因niaD编码的硝酸盐还原酶是真菌氮素代谢过程中的关键酶，可使转化子获得硝酸盐代谢能力。
真菌吸收并利用外界NO3?需经过2个同化反应：首先NO3?经硝酸还原酶还原为NO2?，再经亚硝酸还原酶还原为NH4+，进一步利用氮源完成氨基酸及蛋白质的合成。
同化反应中两个酶易受外界条件影响导致基因功能缺失，使微生物不能利用硝酸盐。
但niaD功能缺失的突变株能耐受高浓度的氯酸盐[17]，而野生型则不能。
因此，通过氯酸盐的选择易获得niaD自然突变株可用于转化子的筛选。