肿瘤细胞侵袭试验(Tumour Invasion Assay)
一原理
Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。
滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel的滤膜，这与体内情况较为相似。
铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间，铺有Martrig el面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关，选择25ugMartrigell铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。另外用Transwell小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel，加入细胞72h后观察结果。值得注意的是，细胞在Trans Wll腔中培养72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。
在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。
二材料
1. Matrigel 基质胶（威格拉斯生物技术（北京）有限公司），10mg/ml，5ml，分装成0.5ml/只10个EP管中；用时加入0.5ml的DMEM；
Matrivgel在冰上维持液态，室温时可迅速凝结成胶。使用前应从-20℃转移至4℃待其自然溶化（如过夜放置），避免反复冻融。使用时需接触Matrivgel的试管、
移液吸头等均应预冷于4℃；
注意无菌操作；
2. 24-transwell (Coster)；
3. 结晶紫染料溶液：结晶紫用甲醇配成0.5%的母液，使用浓度为0.1％，用P BS按1：4稀释后即为染色液；
4. 33%醋酸；
1. 溶液配制：
（1）. 溶DMEM 500ml；
NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）
母液0.1ml（5mg）+ ddH2O up to 5 ml ；过滤消毒，-20℃保存。
NE-DMEM（-6M）
NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μl
DMEM UP TO 100 ml
过滤消毒，4℃保存
（2）. NE+CGRP-DMEM（-6M，100ng）
NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μl
CGRP-储存液50 μl
DMEM UP TO 100 ml
过滤消毒，4℃保存
（3）. NE+IFN-DMEM（-6M，50ng）
NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μl
IFN-γ（25ng/μl）25 μl
DMEM UP TO 100 ml
过滤消毒，4℃保存
（4）. 低血清DMEM培养基（上室）
（5）. 20%FBS-DMEM培养基（下室）
2. 准备
（1）. 溶胶，4℃过夜（Thaw Matrigel at 4℃overnight.）
（2）. 室温下基质胶易成凝胶，所以，步骤2和3种使用试管和枪头要在试验
前-20C预冷。（Matrigel tends to form gel very quickly at room temeratur e, therefore, pipets and tips using in steps 2 and 3 have to be chilled at prior to experiements.）
3. 包被基底膜（冰上操作）
（1）. 用无血清的冷细胞培养基DMEM稀释Matrigel胶（10mg/ml to 5 mg/ ml)）（Dilute Matrigel (10mg/ml to 5 mg/ml) in serum free-cold cell cult ure media (RPMI1640, EMEM, DMEM, etc).）
（2）. 取100ul稀释胶加到24-well transwell上室中（Put 100 ul of the dil uted matrigel into upper chamber of 24-well transwell）
（3）. 37℃孵育transwell至少4-5h （Incubate the transwell at 37C at lea st 4 to 5 h for gelling.）
4. 水化基底膜
用无血清培养基轻洗凝胶（Gently wash gelled matrigel with warmed seru m free-culture media.）
5. 准备细胞悬液和小室
（1）. 消化法从细胞培养瓶中获取细胞；（Harvest cells from tissue cultur e flasks by Trypsin/EDTA；）
（2）. 用培养基洗3遍（Wash the cells 3 times with culture media (RPMI 1640, EMEM, DMEM etc) containing 1 % FBS.）
（3）. 重选细胞，5×105 cells/ml，1% FBS （Resuspend the cells in medi a containing 1% FBS at a density of 5×105 cells/ml.）
（4）. 上室加200 ul细胞悬液（Put 200 ul of the cell suspension onto th e matrigel.）
（5）. 下室中加入600 ul细胞培养基，含有5 ug/ml fibronectin作为黏连亚族（lower chamber of the transwell is filled with 600 ul of culture media containing, as an adhesive subtrate.）
6. 孵育，37℃，20 to 24 h （Incubate at 37C for 20 to 24 h.
7. 染色和计数
（1）. 棉签擦去上室上面的非侵袭细胞（Scrape off noninvaded cells on the
top of the transwell with a cotton swab）
（2）. 移去transwells，倒置，风干（Remove transwells from 24-well plate s and stained with Diff-Quick solution.）
（3）. 24孔板中加入500μl含0.1%结晶紫，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃30min后取出，PBS清洗。
（4）. 直径上取4个视野，照相，计数。
（5）. 24孔板中加入500μl 33%醋酸，将小室置于其中，浸膜，振荡10min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上570nm测OD值，间接反应细胞数。
小技巧：照相前一定要晾干，照相时将小室正置于载玻片上，在倒置显微镜下观察、照相。经济、实用、方便。
细胞迁移和侵袭实验
细胞迁移和侵袭实验 实验准备： 细胞，24孔板，transwell小室（8μm，24孔板专用），ECM Gel，10%FBS+培养基，无血清培养基，10 μ、200 μL、1000 μL移液器及配套枪头，1.5 mL EP 管，冰盒 实验设计： 实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素），实验组（按照实验需要，上层或者下层加入趋化因素），对照组（趋化因素与实验组中的相反）。如果有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素）。 实验操作（请细读注意事项）： 一、细胞侵袭实验 1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。 2.将1.5 mL EP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后，置于冰上预冷。 3.根据自己的使用量，按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5在冰上稀释成使 用液。 4.把枪头剪去一小段（约3 μm）后在冰上吸取40 μL/孔ECM Gel使用液轻轻 加入transwell上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。 5.放在37 ℃孵箱15 min，让胶凝固。 6.消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104 / mL用无血清培养基稀释细胞， 制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。 7.按照每孔200 μL，将细胞悬液加入transwell上室，同时在transwell下室加 入10%FBS+培养基500 μL，放入37 ℃孵箱培养。 8.若干小时后取出，吸去transwell上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒 在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。 9.在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液， 再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。 10.在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照。 11.在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。
Transwell侵袭实验全面总结
Transwell侵袭实验全面总结 第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1．Transwell trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable support s）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（T ranswell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有－μm，根据不同需要
可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。下图是一个Trans well装置的纵切面 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养 液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择μm以下孔径。常用、μm。我们实验室用的是μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。
肿瘤细胞表达的整合素通过促进侵袭和穿越血管壁
肿瘤细胞表达的整合素促进侵袭和穿越血管壁，便于肿瘤转移。αV整合素受体在活化的血管内皮细胞和肿瘤细胞中高度表达，但在安静的血管内皮细胞和多数正常组织中不表达，这为抗血管新生策略提供了潜在的靶点。采用mAbs、环形RGD肽拮抗剂和模拟肽对αV整合素受体活性的抑制可以诱导血管内皮细胞凋亡、抑制血管新生并增加内皮渗透性。多数动物实验表明整合素αvβ3活性的抑制与肿瘤体积的减小密切相关。 无创可视化且定量分析整合素αvβ3表达为确证肿瘤（肿瘤细胞和新生肿瘤血管）整合素水平，更适当地选择适于抗整合素治疗的病人以及监测疗效提供了新的契机。除了易于被非靶向微泡检测的肿瘤微血管血容量和血液流速外，针对血管内皮细胞表达的αv整合素的靶向超声微泡造影还可用于肿瘤整合素显像。Sipkin在动物实验中证实使用MRI和抗体修饰的顺磁性脂质体可方便地对整合素αvβ3表达进行显像。同时近红外荧光染料共轭的环状RGD肽能显示皮下接种的整合素阳性肿瘤。目前，许多研究关注于适宜SPECT或PET显像的放射性核素标记的小RGD肽类拮抗剂。与SPECT相比，PET的灵敏度更高。高计数统计的获得对于使用少量的放射性物质就可以检测单位体积内更少的细胞尤其可贵。整合素表达PET显像探针在持续研发中。 Haubner等最初对RGD肽单体（c(RGDyV)进行了125I标记。该化合物亲脂性强，在肿瘤中快速清除且通过肝肠进行代谢。肝脏和肠的高放射性活度浓聚限制了其的进一步应用。RGD肽的乳糖化降低了亲脂性并相应地减小了肝的摄取。通过辅基18F-氟丙酸可对相同的乳糖化肽进行18F标记。M21黑色素瘤移植瘤模型表明1整合素αvβ3阳性肿瘤对18F-Galacto –RGD特异性摄取。最初在健康志愿者和少量肿瘤患者上进行的临床测试表明该示踪剂安全且能检测出整合素阳性表达的病灶。威尔科克森符号秩检验测试显示RGD/PET标准摄取值（SUV）与肿瘤血管密度（CD31染色）相关。 近年来，我们研发了一系列RGD肽探针用于肿瘤整合素表达多模式显像，包括PET（18F, 64Cu, 86Y, 和124I),SPECT（125I,99mTc, and 111In), 和NIR 荧光(荧光染料和)。我们首先通过辅基氟苯甲酸对RGD肽单体c(RGDyK)进行18F标记。[18F]FB-RGD虽具有良好的肿瘤/血液和肿瘤/肌肉摄取比，但在肿瘤中快速摄取且通过肝肠进行代谢。这使得该示踪剂难以显示腹腔底部的病灶。除了引入一个氨基糖分子增加亲水性外，我们插入了一个两亲性（聚乙二醇）连接剂以改善药代动力学。聚乙二醇化显著延长肿瘤保留值且从肝和肾中快速清除。胆汁代谢的减少使肠中放射性活度摄取最小化且增加靶与非靶比。但是，聚乙二醇化也会降低RGD肽的亲和力。总体而言，[18F]FB-RGD在肿瘤中的摄取值与未修饰的RGD 肽相近，但药代动力学得到改善。然而，聚乙二醇（M.W.=3400）不是单一分子而是许多平均分子量为3400Da分子的集合，这使得示踪剂的表征较复杂。 由于C（RGDyK）已在弯曲的构象上进行了优化，以适应进入整合素αvβ3的α和β单位之间的深裂，因此不太可能通过微调五肽的构象从而进一步改善RGD肽单体与整合素的亲和性和选择性。基于此，我们，应用多价效果，即利用谷氨酸将环五肽单元进行连接，研发RGD肽二聚体和多聚体。与相应的C（RGDyK）单体相比，RGD肽二聚体E[c(RGDyK)]2和受体的亲和力几乎增加了一个数量级。该二聚体的18F标记产物，[18F]FB-E[c(RGDyK)]2（缩写为[18F]FRGD2）优先通过肾脏排泄。同一个动物模型实验表明，[18F]FB-E[c(RGDyK)]2在肿瘤中的摄取值是C（RGDyK）单体的2倍。RGD肽二聚体示踪剂的优良显像性能可能来源于多价协同作用和改善的药代动力学。另外，我们在多种移植瘤模型上进行了动态扫描。通过示踪剂动态分析得到的亲和力值与经SDS-PAGE/自显影测量所得肿瘤整合素表达水平相关性良好。这是首例报道通过体内非创伤性PET显像定量测定整合素表达水平，这为无需活检且精确确定肿瘤整合素水平提供了基础。由小鼠分布数据估算出的人体辐照剂量表明，[18F]FRGD2的有效辐照剂量低于[18]FDG扫描。 尽管[18F]FRGD2能定量PET显像整合素αvβ3表达。但是受产率低的影响，其在临
肿瘤细胞迁移实验(细胞划痕法)讲义
抗肿瘤药物5氟尿嘧啶对肿瘤细胞 迁移的影响 欧阳学文 （细胞划痕法） 实验导读 瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。 肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官，长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。 图1 肿瘤转移示意图 根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细
胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力，核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即所谓异质性。异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。 肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时，往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。当纤维母细胞生长过程中在培养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。 针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。
肿瘤细胞侵袭实验(Tumour Invasion Assay)
肿瘤细胞侵袭实验（Tumour Invasion Assay ） 肿瘤细胞侵袭实验（TumourInvasionAssay ）可以：（1）研究各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响；（2）一些抑制血管生成的新药研究；（3）研究肿瘤细胞侵袭和转移机制。 实验方法 Matrigel 基质膜模型 实验方法原理 Matrigel 是从小鼠EHS 肉瘤中提取的基质成分，含有LN 、IV 型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM 培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。 滤膜孔径一般为8um ，而且膜孔都被Matrigel 覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。 铺有Martrigel 的滤膜放在以Blind Well 腔或MICS 腔上下室之间，铺有Martrigel 面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN 、FN 或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel 的用量有关，选择 25ugMartrigell 铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE 染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel 的细胞数。另外用Transwell 小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell 小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel ，加入细胞72h 后观察结果。值得注意的是，细胞在TransWll 腔中培养 72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。 在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel 而直接将8um 孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN 或FN 或在滤膜下表面铺上LN 或FN ，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。 实验材料 Matrigel 基质胶试剂、试剂盒 DMEM 结晶紫染料溶液醋酸低血清DMEM 培养基FBS-DMEM 培养基IFN-γ仪器、耗材 24-transwell (Coster)离心管冰箱离心机移液枪枪头枪头盒实验一、溶液配制
循环肿瘤细胞(CTC)检测
循环肿瘤细胞（CTC）检测 一、什么是循环肿瘤细胞（CTC）？ 循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落，进入外周血循环的肿瘤细胞。 CTC非常稀少，每毫升血液中109血细胞只有几个CTC。大部分CTC在进入外周血后会发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者的死亡风险。 二、肿瘤的发生及检测诊断 全国肿瘤登记中心发布的2015年年报显示，2011年我国新增癌症病例约337万例，比2010年增加28万例——这相当于每分钟有6人被诊断为癌症。然而，令人担忧的是这样的情势似乎仍未到达峰顶，未来可能还会不断增加。 美国约翰-霍普金斯大学Kinmel 癌症中心的Bert-Vogelstein 等专家在2013年3月份的一篇综述文章中写道：在今年将死于癌症的一百万人里，绝大部分是因为他们的癌症没有在发生、发展的前90%的时间内被发现。因此，我们需要明确一点：癌症是一种慢性病，它只是被突然发现，并非是突然发生的。我们需要尽可能早的发现它，从而提高治愈率。 伴随肿瘤的发生过程，肿瘤细胞的大小也随之增大。传统方法诊断出癌症的时候，大部分已经是晚期。晚期癌症的治愈率极低，其五年生存率也很低。在肿瘤的发生过程中，早期到中期之间是最佳治疗期，因此，如果在早期就可以发现肿瘤的存在，必然可以提高治愈率。临床癌症研究（Clinical Cancer Research）杂志上发表的荟萃分析（Meta-analysis）证实CTC
在乳腺癌预测中的价值，结果表明早期和转移性乳腺癌患者的循环肿瘤细胞CTC检测是一个稳定的预测和预后工具。 如果将肿瘤易感性基因检测和循环肿瘤细胞检测完美结合，那么能够将肿瘤的早期发现率提高数倍。肿瘤易感性检测是对未来可能患有癌症的一种风险预测。如果风险等级高，除了改变生活方式外，还可以定期做循环肿瘤细胞检测，即CTC检测，而且检查频率可以适当增加，每2-3个月检查一次，从而达到实时监控的目的。 三、CTC 检测临床意义有哪些？ CTC 检查的临床意义主要表现在体外早期诊断，血液中肿瘤在1mm时，即可检出CTC，抓住最佳治疗期；另外还可以进行预后判断，根据治疗前后CTC个数判断预后与存活时间，制定最佳治疗方案；此外，还有肿瘤复发检测、耐药性检测、化疗药物的疗效评价以及新药的研发等。 四、哪些人需要做CTC检测？ 1. 普通健康人：通过检查血液中是否存在循环肿瘤细胞来早期检测肿瘤的发生，建议每年检测一次，以期在肿瘤萌芽阶段就能检测到，从而保证早期治愈率。 2. 肿瘤易感人群：有癌症家族史人群，患有HPV阳性、慢性肝炎、慢性胃炎、慢性肠炎等人群，长期吸烟者，经常接触有毒有害物质者，生活压力大、精神高度紧张的亚健康人群，以及基因检测肿瘤易感性风险等级高者，建议每3个月或者半年检测一次。 3. 癌症患者：已经确诊的癌症患者，通过CTC计数，用于预后判断、疗效评价、复发检测等；通过CTC单细胞基因组分析，选择精准治疗方案，实现真正的液体活检。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验（cell migration assay） 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 2.1基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2.2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2.3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2.4结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。 0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 实验材料
循环肿瘤细胞的检测
Detection of Androgen Receptor Mutations in Circulating Tumor Cells: Highlights of the Long Road to Clinical Qualification Hans Lilja 1,2,3*and Howard I.Scher 3 There is evidence that androgen receptor (AR )4gene function not only is necessary for the growth and dif-ferentiation of the healthy prostate gland but also may contribute critically to treatment failure in progressive stages of castration-resistant prostate cancer (CRPC)5(1–3).The mechanisms include AR overexpression,AR gene amplification,an increase in the levels of the androgen synthetic machinery leading to increased in-tratumoral androgens,ligand-independent activation,and gain-of-function mutations in the gene itself (2).The clinical importance of these findings has been val-idated in trials of the novel androgen receptor antago-nist MDV3100,which was developed in a cell-based screen for activity in cells with overexpressed AR,and of abiraterone acetate,a 17,20lyase inhibitor that blocks androgen synthesis in the testis,the adrenals,and the tumor (3,4). The development and validation of reliable,repro-ducible protocols to accurately assess functional status,frequency,and functional relevance of mutations in AR could then be critical for the successful development and clinical implementation of novel targeted strate-gies for patients with advanced stages of prostate can-cer,particularly those with progressive CRPC.Al-though a recent study on the integrative genomic profiling of human prostate cancer was limited by the interrogation of only a modest number of genes and patient samples,the reported data strongly suggested that the overall rate of mutations may be low in pros-tate cancer (5).In particular,mutations were infre-quent among common,broadly mutated oncogenes,such as PIK3CA (phosphoinositide-3-kinase,catalytic, alpha polypeptide),KRAS (v-Ki-ras2Kirsten rat sar-coma viral oncogene homolog),and BRAF (v-raf mu-rine sarcoma viral oncogene homolog B1).Impor-tantly,however,the study reported a higher frequency of AR mutations.Alterations in AR ,including muta-tions,gene amplification,and overexpression,were common in the metastatic tumor samples analyzed but were notably absent in tumor samples representing un-treated localized disease (5).Assessing the frequency of specific molecular changes in CRPC,however,is lim-ited by the general unavailability of metastatic tumor samples for profiling,as well as by a lack of analytically valid assays for measurement. Circulating tumor cells (CTCs)isolated from blood have been hypothesized to be capable of fulfilling the unmet need for tumor tissue for molecular profil-ing for biomarkers that predict sensitivity to treat-ment.Biomarker qualification requires analytically valid assays that can then be studied in prospective clinical trials designed for a specific context of use.A variety of CTC assays are available and under study,but at present only 1,CellSearch ?(Veridex/Johnson &Johnson),has undergone full analytical validation for enumeration (6)and been shown in prospective trials to provide prognostic information at baseline and after treatment in patients with breast,colorectal,or pros-tate cancer (7–9).The US Food and Drug Administra-tion (FDA)clearance is as an “aid to monitoring”dis-ease in conjunction with other measures.The assay is not cleared for the assessment of predictive markers. A limitation of CellSearch is that CTCs are not detected in patients with clinically localized disease or in patients who are in the clinical state of increasing prostate-specific antigen (10,11).To address this is-sue,we measured the mRNA copy number in 2AR -regulated prostate-specific genes [KLK3(kallikrein-related peptidase 3)and KLK2(kallikrein-related peptidase 2)](11)in blood prepared with the PAXgene Blood RNA System (PreAnalytiX).A direct compari-son of the 2assays revealed highly concordant results that were significantly associated with the presence of skeletal metastases and with overall https://www.360docs.net/doc/cc16810201.html,bin-ing these measures,however,did not seem to contrib-ute importantly to enhancing the predictive accuracy 1 Departments of Clinical Laboratories,2Surgery (Urology),and 3Medicine (Genito-Urinary Oncology),Memorial Sloan-Kettering Cancer Center,New York,NY. *Address correspondence to this author at:Memorial Sloan-Kettering Cancer Center,1275York Ave.,Box 213,New York,NY 10021.Fax 646-422-2379;e-mail liljah@https://www.360docs.net/doc/cc16810201.html,. Received July 1,2010;accepted July 6,2010. Previously published online at DOI:10.1373/clinchem.2010.1508964 Human genes:AR ,androgen receptor;PIK3CA ,phosphoinositide-3-kinase,cat-alytic,alpha polypeptide;KRAS ,v-Ki-ras2Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog;BRAF ,v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1;KLK3,kallikrein-related peptidase 3;KLK2,kallikrein-related peptidase 2.5 Nonstandard abbreviations:CRPC,castration-resistant prostate cancer;CTC,circulating tumor cell;FDA,US Food and Drug Administration. Clinical Chemistry 56:91375–1377(2010) Editorials 1375
循环肿瘤细胞检测系统(CTC)仪器购买可行性报告
循环肿瘤细胞检测系统（CTC）设备购置 可行性报告 一、制造商基本情况 美国强生(Johnson & Johnson)成立于1886年，是世界上规模最大，产品多元化的医疗卫生保健品及消费者护理产品公司。1999年全球营业额高达275亿美元。强生在全球60个国家建立了250多家分公司，拥有约11万5千余名员工, 产品销售于175个国家和地区。 强生公司是世界上最具综合性、分布范围最广的卫生保健产品制造商、健康服务提供商，产品畅销于175个国家地区，生产及销售产品涉及护理产品、医药产品和医疗器材及诊断产品市场等多个领域。 美国强生公司研发的循环肿瘤细胞检测系统（CTC）2012年进入中国市场，立即被运用于肿瘤科研和临床检测，并受到业界好评。二、项目意义 随着循环肿瘤细胞检测技术的不断发展，循环肿瘤细胞（CTC）在肿瘤临床实践以及肿瘤基础科学研究领域得到了越来越多的重视。CTC数目已经被证实与晚期转移性乳腺癌，结直肠癌，前列腺癌等各种患者的无进展生存期和总生存期密切相关，CTC已经成为转移性乳腺癌等癌种的一种全新的，独立的预后因子，并被作为一种新的肿瘤生物标志物而广泛应用于新药开发，癌症机制研究等不同的领域。三、国内外研究 CTC是指存在于外周血循环中的肿瘤细胞，其含量非常稀少（1ml血液中可能只能检出1个CTC）。CellSearch系统是目前为止唯一获得FDA批准的可以应用于病人管理的自动化循环肿瘤细胞检测系统。检测技术的不断进步CTC越来越成为国内外癌症领域研究的热点。2004年，Cristofanilli等完成的前瞻性多中心临床研究表明治疗前
(基线期)和首次随访时的CTC水平对于转移性乳腺癌患者的无进展生存期和总生存期都是独立的预测指标。在177例转移性乳腺癌患者中，CTC水平较高者(≥5个/7.5ml全血)的平均无进展生存期只有2.7个月，总生存期只有10.1个月；CTC水平较低者则分别为7.0个月(P<0.001)和超过18个月(P<0.001)。随后又有多个研究证明治疗期间任何时间点CTC水平的升高都提示着疾病的快速进展和较差的预后。同时也出现了越来越多的不同癌种的关于CTC的研究，其结果也提示了CTC在前列腺癌，结直肠癌中也发挥了相同的预后作用。由于FDA 的批准，在美国CTC已经可以与传统肿瘤诊断检测方法相结合用于临床实践。国外也有较多的研究集中在了CTC的生物特性上，例如研究CTC表面的Her2抗体表达情况，进行CTC与原发肿瘤的抗体表达对照研究等。 此前，国内也有一些实验室开展了关于CTC的研究，但局限于手工磁珠法，PCR法等方法学问题，并没有取得国际认可的结果。不过随着CellSearch方法逐渐进入中国，越来越多的学者已经开始了关于CTC的研究。国内正在进行CellSearch的注册临床研究，将会验证CellSearch系统在中国人群中的有效性及安全性。同时一些国内的实验室也已经开始在CellSearch这一平台上进行不同的基础科学研究，包括CTC表面多重生物标志物分析，CTC分子生物学分析，CTC细胞FISH检测等，希望通过CTC这个全新的肿瘤标志物得到更多关于癌症发病机制，癌症转移机制等问题的答案。 四、国内开展现状 基于CellSearch平台的CTC检测技术是一种安全可靠的被美国FDA批准的癌症临床辅助诊断技术，随着中国注册临床试验的进行，CTC检测将会在中国得到越来越多的重视并迎来更加广阔的临床及科研应用前景。目前国内已有解放军307医院，复旦大学附属肿瘤医院，
肿瘤细胞侵袭和迁移研究的实验技术改进
肿瘤细胞侵袭和迁移研究的实验技术改进 【摘要】肿瘤的基础研究一直是医学类研究的热点，研究者发现恶性肿瘤细胞具有高度侵袭和迁移的特性，对于侵袭和迁移特性的研究具有现实指导意义，而实验技术是基础研究中重要的一个环节，本文针对研究肿瘤细胞侵袭和迁移的几种常用实验技术，提出相应的改进建议。 【关键词】肿瘤；侵袭；迁移；实验技术 肿瘤的治疗一直是生物医学类研究很重要的一部分，恶性肿瘤成为威胁人类健康和生命的主要疾病之一，近些年来，我国及全世界的恶性肿瘤发病率和死亡率都呈上升趋势。近年来肿瘤相关研究取得了很大的进展，但恶性肿瘤具有的高度侵袭和迁移特性成为肿瘤治疗失败的主要原因之一，因此肿瘤细胞的侵袭和迁移是抗肿瘤研究中的热点。 1.检测肿瘤细胞的侵袭性和迁移性的常用实验技术 基础研究对临床工作有着推动作用，注重基础研究不仅利于提高医务工作者的素质，并且利于开展交流合作，推动行业发展，肿瘤疾病治疗的研究工作最终还是要从基础研究做起。实验技术对于基础研究的发展有着至关重要的作用，实验技术的发展推动基础研究的进步。研究肿瘤细胞侵袭和迁移特性时，常用的实验技术有Western blot、免疫组化、Transwell小室测定法、划痕实
验等，对这几种实验技术进行优缺点分析能够为科研工作者提出建议，让科研工作者在研究过程中少走弯路，具有一定的现实意义。 1.1检测肿瘤细胞侵袭和迁移相关蛋白 肿瘤细胞侵袭和迁移相关蛋白有CD147、MMP-2、MMP-9、VEGF 等。CD147是免疫球蛋白家族中一个高度糖基化的跨膜蛋白，能够调控MMPs的表达，刺激MMP-2、MMP-9的产生，MMP-2、MMP-9能降解细胞外基质的蛋白成分，并且诱导VEGF的产生，促进血管的生成，在恶性肿瘤的侵袭和转移中起关键性作用。研究证实，这些蛋白的表达水平都与肿瘤细胞的恶性程度、肿瘤的侵袭和迁移有着密切的联系，通过实验来检测蛋白的表达水平，一定程度上可了解肿瘤细胞的侵袭和迁移特性。 在基础研究中，通常可以通过Western blot来检测侵袭和转移相关蛋白的表达水平，从而确定肿瘤细胞的侵袭性和迁移性是否存在差异，这种方法一定程度上是可以让研究者间接了解肿瘤细胞的侵袭性和迁移性的变化，并且Western blot的方法可以量化蛋白的表达水平，但缺点是检测蛋白表达水平对于判断侵袭性和迁移性不够直观，实验步骤较为复杂，抗体和蛋白的亲和力存在差异，并且抗体价格相对比较昂贵，因此此方法存在一定的局限性。 1.2Transwell小室测定法 Transwell小室测定法可用于测定肿瘤细胞的侵袭性和迁移性，
肿瘤学研究常用实验技术及方法
肿瘤学研究常用实验技术及方法复习题 1.表观遗传的科学内涵 三个特点？ a)基因功能完全、稳定地丧失，有遗传性； b)细胞外环境长期作用的结果，有可逆性； c)分析方法灵敏，可检出少数细胞的变化 2.变性高效液相色谱(DHPLC)技术在肿瘤研究中的应用 DHPLC 的主要应用？ Separation of DNA, MSI, LOH, STRs, Q-PCR, detection of mutation , SNPs, oligos, RNA. 3. 蛋白质分离纯化及鉴定 i.分离纯化蛋白质的方法有哪些？ 盐析，透析，离心，凝胶过滤（分子筛）层析，离子交换层析，亲和层析，高效液相层析。 ii.等电聚焦电泳（IEF）与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）有何不同？ 等电聚焦电泳：利用蛋白质分子等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。 SDS-PAGE:蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子，所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷的差异。在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以 说是取决于蛋白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷量无关 iii.两种等电点相近的，分子量相差较大的蛋白质应该首选那种分离方法？SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 iv.蛋白质印迹（Western Blotting）过程中应注意的事项有哪些？ 1.丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时一定要注意 防护。 2.制备聚丙烯酰胺凝胶时，小心防止凝胶渗漏。 3.蛋白加样量要合适，加样量太小，条带不清晰，加样量太大，则泳道超 载，条带过宽而重叠，甚至覆盖至相邻泳道。
《肿瘤学概论》考试题及答案(一)
《肿瘤学概论》考试题目参考答案 名词解释 1．癌前病变：从正常组织到发生癌变的中间阶段称为癌前病变2．直接致癌物：本身直接具有致癌作用，在体内不需要经过代谢活化即可致癌。 3．间接致癌物：大多数的致癌物不是其原型致癌(直接致癌物)，而是需要在哺乳动物体内经过代谢激活后才有致癌作用，这些致癌物又称间接致癌物。 4．肿瘤的放射治疗：广义的放射治疗既包括放射治疗科的肿瘤放射治疗，也包括核医学科的内用同位素治疗；狭义的放射治疗一般仅指前者，即人们一般所称的肿瘤放射治疗。 5．肿瘤的姑息治疗：通过对患者疼痛等症状以及其他生理、心理和精神方面问题的早期诊断和正确评估，来缓解和处理患者痛苦的治疗措施。姑息治疗目的是提高癌症患者生活质量，帮助患者及家属面对与威胁生命疾病相关的各种问题 6．肿瘤的分子靶向治疗：针对可能导致细胞癌变的环节，如细胞信号传导通路、原癌基因和抑癌基因、细胞因子及受体、抗肿瘤血管形成、自杀基因等，从分子水平来逆转这种恶性生物学行为，从而抑制肿瘤细胞生长，甚至使其完全消退的一种全新的生物治疗模式。 7．肿瘤的免疫耐受：指免疫活性细胞接触抗原性物质时所表现的一种异性的无应答状态。当肿瘤长期存在时，与未成熟或幼稚免疫活性细胞接触，就可能诱发机体对肿瘤抗原产生免疫耐受性。
8．无瘤原则：指应用各种措施防止手术操作过程中离散的癌细胞直接种植或播散。 9．三阶梯止痛法：是一种根据患者疼痛等级为治疗原则的止痛方法，一阶是指轻度疼痛给予非甾类抗炎药加减辅助止痛药，二阶中度疼痛给予弱阿片类加减非甾类抗炎药和辅助止痛药，三阶重度疼痛给予阿片类加减非甾类抗炎药和辅助止痛药。 10．根治术放射治疗：利用手术拨开正常组织和器官，对肿瘤进行单次大剂量冲击性放射杀伤。 问答题 1.细胞癌基因的分类 ?1、细胞外的生长因子 ?2、跨膜的生长因子受体 ?3、胞内信号传递体 ?4、核内转录因子 2.肿瘤转移的基本过程 细胞脱离原发瘤群体、通过浸润在周围间质中生长、与局部毛细血管或淋巴管密切接触并穿透其管壁、被转运到达靶组织或靶器官、再逸出毛细血管或淋巴管壁并在间质中不断增生形成新的继发瘤。 3.肿瘤化疗的适应症 （1）造血系统恶性肿瘤，对化疗敏感，通过化疗可完全控制甚至根治，如白血病，多发行骨髓瘤，恶性淋巴癌等。 （2）化疗效果较好的某些实体瘤，绒毛膜上皮癌，恶性葡萄胎，生
cellsearch循环肿瘤细胞(CTC)试剂盒说明书自译中文版
7900001 16 人份试剂盒 Cell Search 循环肿瘤细胞检测试剂盒（上皮细胞） IVD
使用须知 本试剂盒仅用于体外诊断 Cellsearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒用于外周血中循环肿瘤细胞（ CTC ）的计数，这些细 胞来源 于上皮细胞，即表现为 CD45 阴性（ CD45- ）， EpCAM 阳性（ EpCAM+ ），细胞角 蛋白 8,18 阳性（ CK8,18+ ）和（或者） CK19 阳性 （CK19+） 的细胞。 用CellSearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒检测的 CTC ，存在于外周血中，这类细胞与乳腺癌、 结直肠癌和前列腺癌 *转移患者的无进展生存期和总生存期相关。因此， CTC 可以用来监控 乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的肿瘤细胞是否发生转移。 CTC 应该进行持续检测，并 与其他临床诊断方式联合起来监控上述肿瘤细胞的转移。在肿瘤发生过程中的任何时间段， 对 CTC 数量进行评估，可以预估肿瘤患者治疗后的无进展生存期和总生存期。 *在该研究中， 转移性前列腺癌患者定义为血清标志物 PSA 在标准激素基准上， 高于参考水 平具有 两次连续增加。 这些患者通常描述为具有非雄激素依赖性， 激素抗性， 或去势抗性的 前列腺癌。 摘要说明 肿瘤转移是指当肿瘤细胞从原发灶或转移灶剥落后， 这些肿瘤细胞进入循环系统并在机体的 远端定植生长的情况。 血液循环中的肿瘤细胞源自于上皮细胞， 而这类细胞在血液循环系统 中是极罕见的。基于此，本公司推出的细胞自动化捕获仪 （CELLTRACKS R? AUTOPREP System ） 通过预设程序并配合使用 CellSearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒 （CELLSEARCH Kit ） 可以对样本进行标准化和自动化检测。 用 CELLTRACKS II 分析仪或者 CellSpotter 分析 仪，一种半自动荧光显微镜， 可以对肿瘤细胞进行分析和计数。 这种方法只计具有上皮细胞 特性（ EpCAM+, CK8,18+ ，和/或者 CK19+ ）的细胞数量。 检测原理 CellSearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒 包括磁流体捕获试剂和荧光免疫试剂。磁流体试剂是 一种具有磁芯的颗粒。其表面包被识别 因此，该磁微粒可以捕获 CTC 。经过免疫捕获和富集后，荧光试剂用来鉴定 计数。荧光试剂包 括以下组成：抗 白抗体（上皮细胞特性）； DAPI ， 胞特异性抗体。 试剂 /样品混合物被 CELLTRACKS 呈现装置的暗盒中。所述 MAGNEST ? 装置具有强磁场，能吸引磁微粒标记的上皮细胞在暗 盒的表面上。 CELLTRACKS ANALYZERII ? 分 析仪，或者 CellSpotter ? 分析仪自动扫描暗盒 的整个表面， 获取图像并向用户显示所有事件， 图像进行最终分类， 并以画廊格式呈现给用户。 胞一致并表现出 EpCAM+ ， CK+， DAPI+ 和 试剂盒提供的材料 试剂说明 1. 3ml 包被抗 EpCAM 抗体的磁流体： 含有浓度为 0.022% 的磁微粒，这些磁微粒表面偶 联有抗表 皮细胞表面标志物 EpCAM 的鼠源单克隆抗体。缓冲溶液中含有 0.03% 的 BSA 和 0.05% ProClin 300 作为保护剂。（棕色瓶盖） EpCAM 抗原的抗体， EpCAM 是 CTC 特异性抗原。 CTC 和 CTC CK-藻红蛋白（PE ）的特异于细胞内蛋白质的细胞角蛋 用于细胞核染色；和抗 CD45-别藻蓝蛋白（APC ）白细 ?AUTOPREP ?系统分配到一个插入在 MAGNEST ?细胞 其中 CK-PE 和 DAPI 荧光染料进行共定位。 所检测分析的事件当其形态学特征与肿瘤细 CD45- 表型时，才被分类为肿瘤细胞。