肿瘤细胞侵袭实验(Tumour Invasion Assay)
肿瘤细胞侵袭实验（Tumour Invasion Assay）肿瘤细胞侵袭实验（Tumour InvasionAssay）可以：
（1）研究各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响；
（2）一些抑制血管生成的新药研究；
（3）研究肿瘤细胞侵袭和转移机制。
实验方法
?Matrigel 基质膜模型
实验方法原理Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。
滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。
铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间，铺有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关，选择25ugMartrigell铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。另外用Transwell小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel，加入细胞72h后观察结果。值得注意的是，细胞在TransWll腔中培养72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。
在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。
实验
材料
Matrigel 基质胶
试剂、试剂盒
DMEM 结晶紫染料溶液醋酸低血清DMEM 培养基FBS-DMEM 培养基IFN-γ 仪器、耗材
24-transwell (Coster)离心管冰箱离心机移液枪枪头枪头盒 实验步骤 一、溶液配制
1. DMEM
（1）NE---A 液（1 μg/μl ，1 mg/ml ）
（2）母液0.1 ml （5 mg ）+ ddH 2O up to 5 ml ；过滤消毒，-20℃保存。
2. NE-DMEM （-6 M ）
NE---A 液（1 μg/μl ，1 mg/ml ） 20.5 μl
DMEM UP TO 100 ml
过滤消毒，4℃保存
3. NE+CGRP-DMEM （-6 M ，100 ng ）
（1）NE---A 液（1 μg/μl ，1 mg/ml ） 20.5 μl
（2）CGRP-储存液 50 μl
（3）DMEM UP TO 100 ml
（4）过滤消毒，4℃保存
4. NE+IFN-DMEM （-6 M ，50 ng ）
（1）NE---A 液（1 μg/μl ，1 mg/ml ） 20.5 μl
（2）IFN-γ（25ng/μl ） 25 μl
（3）DMEM UP TO 100 ml
（4）过滤消毒，4℃保存。
5. 低血清DMEM 培养基（上室）
6. 20%FBS-DMEM 培养基（下室）
7. Matrigel 基质胶
（1）10 mg/ml ，5 ml ，分装成0.5 ml/只10个EP 管中。
（2）用时加入0.5 ml 的DMEM 。
（3）Matrivgel 在冰上维持液态，室温时可迅速凝结成胶。
二 、 准备
1. 溶胶，4℃过夜。
2. 室温下基质胶易成凝胶，所以，步骤2和3种使用试管和枪头要在试验前-20C 预冷。
三、 包被基底膜（冰上操作）
1. 用无血清的冷细胞培养基DMEM 稀释Matrigel 胶。
2. 取100 ul 稀释胶加到24-well transwell 上室中。
3. 37℃孵育transwell 至少4-5 h 。
四、 水化基底膜
1. 用无血清培养基轻洗凝胶 。
五 、 准备细胞悬液和小室
1. 消化法从细胞培养瓶中获取细胞。
2. 用培养基洗3遍。
3. 重悬细胞，5×105 cells/ml，1% FBS 。
4. 上室加200 ul细胞悬液。
5. 下室中加入600 ul细胞培养基，含有5 ug/ml fibronectin作为黏连亚族。
六、孵育
37℃，20 to 24 h 。
七、染色和计数
1. 棉签擦去上室上面的非侵袭细胞。
2. 移去transwells，倒置，风干。
3. 24孔板中加入500 μl含0.1%结晶紫，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 30min后取出，PBS清洗。
4. 直径上取4个视野，照相，计数。
5. 24孔板中加入500 μl 33%醋酸，将小室置于其中，浸膜，振荡10 min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上570nm测OD值，间接反应细胞数。
展开
注意事项1. 照相前一定要晾干，照相时将小室正置于载玻片上，在倒置显微镜下观察、照相。
2. 使用Matrivgel前应从-20℃转移至4℃待其自然溶化（如过夜放置），避免反复冻融。
3. 使用时需接触Matrivgel的试管、移液吸头等均应预冷于4℃。
4. 使用Matrivgel时注意无菌操作。
细胞迁移和侵袭实验
细胞迁移和侵袭实验 实验准备： 细胞，24孔板，transwell小室（8μm，24孔板专用），ECM Gel，10%FBS+培养基，无血清培养基，10 μ、200 μL、1000 μL移液器及配套枪头，1.5 mL EP 管，冰盒 实验设计： 实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素），实验组（按照实验需要，上层或者下层加入趋化因素），对照组（趋化因素与实验组中的相反）。如果有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素）。 实验操作（请细读注意事项）： 一、细胞侵袭实验 1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。 2.将1.5 mL EP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后，置于冰上预冷。 3.根据自己的使用量，按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5在冰上稀释成使 用液。 4.把枪头剪去一小段（约3 μm）后在冰上吸取40 μL/孔ECM Gel使用液轻轻 加入transwell上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。 5.放在37 ℃孵箱15 min，让胶凝固。 6.消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104 / mL用无血清培养基稀释细胞， 制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。 7.按照每孔200 μL，将细胞悬液加入transwell上室，同时在transwell下室加 入10%FBS+培养基500 μL，放入37 ℃孵箱培养。 8.若干小时后取出，吸去transwell上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒 在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。 9.在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液， 再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。 10.在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照。 11.在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。
Transwell侵袭实验全面总结
Transwell侵袭实验全面总结 第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1．Transwell trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable support s）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（T ranswell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有－μm，根据不同需要
可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。下图是一个Trans well装置的纵切面 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养 液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择μm以下孔径。常用、μm。我们实验室用的是μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。
肿瘤细胞表达的整合素通过促进侵袭和穿越血管壁
肿瘤细胞表达的整合素促进侵袭和穿越血管壁，便于肿瘤转移。αV整合素受体在活化的血管内皮细胞和肿瘤细胞中高度表达，但在安静的血管内皮细胞和多数正常组织中不表达，这为抗血管新生策略提供了潜在的靶点。采用mAbs、环形RGD肽拮抗剂和模拟肽对αV整合素受体活性的抑制可以诱导血管内皮细胞凋亡、抑制血管新生并增加内皮渗透性。多数动物实验表明整合素αvβ3活性的抑制与肿瘤体积的减小密切相关。 无创可视化且定量分析整合素αvβ3表达为确证肿瘤（肿瘤细胞和新生肿瘤血管）整合素水平，更适当地选择适于抗整合素治疗的病人以及监测疗效提供了新的契机。除了易于被非靶向微泡检测的肿瘤微血管血容量和血液流速外，针对血管内皮细胞表达的αv整合素的靶向超声微泡造影还可用于肿瘤整合素显像。Sipkin在动物实验中证实使用MRI和抗体修饰的顺磁性脂质体可方便地对整合素αvβ3表达进行显像。同时近红外荧光染料共轭的环状RGD肽能显示皮下接种的整合素阳性肿瘤。目前，许多研究关注于适宜SPECT或PET显像的放射性核素标记的小RGD肽类拮抗剂。与SPECT相比，PET的灵敏度更高。高计数统计的获得对于使用少量的放射性物质就可以检测单位体积内更少的细胞尤其可贵。整合素表达PET显像探针在持续研发中。 Haubner等最初对RGD肽单体（c(RGDyV)进行了125I标记。该化合物亲脂性强，在肿瘤中快速清除且通过肝肠进行代谢。肝脏和肠的高放射性活度浓聚限制了其的进一步应用。RGD肽的乳糖化降低了亲脂性并相应地减小了肝的摄取。通过辅基18F-氟丙酸可对相同的乳糖化肽进行18F标记。M21黑色素瘤移植瘤模型表明1整合素αvβ3阳性肿瘤对18F-Galacto –RGD特异性摄取。最初在健康志愿者和少量肿瘤患者上进行的临床测试表明该示踪剂安全且能检测出整合素阳性表达的病灶。威尔科克森符号秩检验测试显示RGD/PET标准摄取值（SUV）与肿瘤血管密度（CD31染色）相关。 近年来，我们研发了一系列RGD肽探针用于肿瘤整合素表达多模式显像，包括PET（18F, 64Cu, 86Y, 和124I),SPECT（125I,99mTc, and 111In), 和NIR 荧光(荧光染料和)。我们首先通过辅基氟苯甲酸对RGD肽单体c(RGDyK)进行18F标记。[18F]FB-RGD虽具有良好的肿瘤/血液和肿瘤/肌肉摄取比，但在肿瘤中快速摄取且通过肝肠进行代谢。这使得该示踪剂难以显示腹腔底部的病灶。除了引入一个氨基糖分子增加亲水性外，我们插入了一个两亲性（聚乙二醇）连接剂以改善药代动力学。聚乙二醇化显著延长肿瘤保留值且从肝和肾中快速清除。胆汁代谢的减少使肠中放射性活度摄取最小化且增加靶与非靶比。但是，聚乙二醇化也会降低RGD肽的亲和力。总体而言，[18F]FB-RGD在肿瘤中的摄取值与未修饰的RGD 肽相近，但药代动力学得到改善。然而，聚乙二醇（M.W.=3400）不是单一分子而是许多平均分子量为3400Da分子的集合，这使得示踪剂的表征较复杂。 由于C（RGDyK）已在弯曲的构象上进行了优化，以适应进入整合素αvβ3的α和β单位之间的深裂，因此不太可能通过微调五肽的构象从而进一步改善RGD肽单体与整合素的亲和性和选择性。基于此，我们，应用多价效果，即利用谷氨酸将环五肽单元进行连接，研发RGD肽二聚体和多聚体。与相应的C（RGDyK）单体相比，RGD肽二聚体E[c(RGDyK)]2和受体的亲和力几乎增加了一个数量级。该二聚体的18F标记产物，[18F]FB-E[c(RGDyK)]2（缩写为[18F]FRGD2）优先通过肾脏排泄。同一个动物模型实验表明，[18F]FB-E[c(RGDyK)]2在肿瘤中的摄取值是C（RGDyK）单体的2倍。RGD肽二聚体示踪剂的优良显像性能可能来源于多价协同作用和改善的药代动力学。另外，我们在多种移植瘤模型上进行了动态扫描。通过示踪剂动态分析得到的亲和力值与经SDS-PAGE/自显影测量所得肿瘤整合素表达水平相关性良好。这是首例报道通过体内非创伤性PET显像定量测定整合素表达水平，这为无需活检且精确确定肿瘤整合素水平提供了基础。由小鼠分布数据估算出的人体辐照剂量表明，[18F]FRGD2的有效辐照剂量低于[18]FDG扫描。 尽管[18F]FRGD2能定量PET显像整合素αvβ3表达。但是受产率低的影响，其在临
肿瘤细胞迁移实验(细胞划痕法)讲义
抗肿瘤药物5氟尿嘧啶对肿瘤细胞 迁移的影响 欧阳学文 （细胞划痕法） 实验导读 瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。 肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官，长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。 图1 肿瘤转移示意图 根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细
胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力，核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即所谓异质性。异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。 肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时，往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。当纤维母细胞生长过程中在培养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。 针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。
肿瘤细胞侵袭实验(Tumour Invasion Assay)
肿瘤细胞侵袭实验（Tumour Invasion Assay ） 肿瘤细胞侵袭实验（TumourInvasionAssay ）可以：（1）研究各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响；（2）一些抑制血管生成的新药研究；（3）研究肿瘤细胞侵袭和转移机制。 实验方法 Matrigel 基质膜模型 实验方法原理 Matrigel 是从小鼠EHS 肉瘤中提取的基质成分，含有LN 、IV 型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM 培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。 滤膜孔径一般为8um ，而且膜孔都被Matrigel 覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。 铺有Martrigel 的滤膜放在以Blind Well 腔或MICS 腔上下室之间，铺有Martrigel 面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN 、FN 或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel 的用量有关，选择 25ugMartrigell 铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE 染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel 的细胞数。另外用Transwell 小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell 小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel ，加入细胞72h 后观察结果。值得注意的是，细胞在TransWll 腔中培养 72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。 在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel 而直接将8um 孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN 或FN 或在滤膜下表面铺上LN 或FN ，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。 实验材料 Matrigel 基质胶试剂、试剂盒 DMEM 结晶紫染料溶液醋酸低血清DMEM 培养基FBS-DMEM 培养基IFN-γ仪器、耗材 24-transwell (Coster)离心管冰箱离心机移液枪枪头枪头盒实验一、溶液配制
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验（cell migration assay） 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 2.1基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2.2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2.3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2.4结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。 0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 实验材料
肿瘤细胞侵袭和迁移研究的实验技术改进
肿瘤细胞侵袭和迁移研究的实验技术改进 【摘要】肿瘤的基础研究一直是医学类研究的热点，研究者发现恶性肿瘤细胞具有高度侵袭和迁移的特性，对于侵袭和迁移特性的研究具有现实指导意义，而实验技术是基础研究中重要的一个环节，本文针对研究肿瘤细胞侵袭和迁移的几种常用实验技术，提出相应的改进建议。 【关键词】肿瘤；侵袭；迁移；实验技术 肿瘤的治疗一直是生物医学类研究很重要的一部分，恶性肿瘤成为威胁人类健康和生命的主要疾病之一，近些年来，我国及全世界的恶性肿瘤发病率和死亡率都呈上升趋势。近年来肿瘤相关研究取得了很大的进展，但恶性肿瘤具有的高度侵袭和迁移特性成为肿瘤治疗失败的主要原因之一，因此肿瘤细胞的侵袭和迁移是抗肿瘤研究中的热点。 1.检测肿瘤细胞的侵袭性和迁移性的常用实验技术 基础研究对临床工作有着推动作用，注重基础研究不仅利于提高医务工作者的素质，并且利于开展交流合作，推动行业发展，肿瘤疾病治疗的研究工作最终还是要从基础研究做起。实验技术对于基础研究的发展有着至关重要的作用，实验技术的发展推动基础研究的进步。研究肿瘤细胞侵袭和迁移特性时，常用的实验技术有Western blot、免疫组化、Transwell小室测定法、划痕实
验等，对这几种实验技术进行优缺点分析能够为科研工作者提出建议，让科研工作者在研究过程中少走弯路，具有一定的现实意义。 1.1检测肿瘤细胞侵袭和迁移相关蛋白 肿瘤细胞侵袭和迁移相关蛋白有CD147、MMP-2、MMP-9、VEGF 等。CD147是免疫球蛋白家族中一个高度糖基化的跨膜蛋白，能够调控MMPs的表达，刺激MMP-2、MMP-9的产生，MMP-2、MMP-9能降解细胞外基质的蛋白成分，并且诱导VEGF的产生，促进血管的生成，在恶性肿瘤的侵袭和转移中起关键性作用。研究证实，这些蛋白的表达水平都与肿瘤细胞的恶性程度、肿瘤的侵袭和迁移有着密切的联系，通过实验来检测蛋白的表达水平，一定程度上可了解肿瘤细胞的侵袭和迁移特性。 在基础研究中，通常可以通过Western blot来检测侵袭和转移相关蛋白的表达水平，从而确定肿瘤细胞的侵袭性和迁移性是否存在差异，这种方法一定程度上是可以让研究者间接了解肿瘤细胞的侵袭性和迁移性的变化，并且Western blot的方法可以量化蛋白的表达水平，但缺点是检测蛋白表达水平对于判断侵袭性和迁移性不够直观，实验步骤较为复杂，抗体和蛋白的亲和力存在差异，并且抗体价格相对比较昂贵，因此此方法存在一定的局限性。 1.2Transwell小室测定法 Transwell小室测定法可用于测定肿瘤细胞的侵袭性和迁移性，
肿瘤学研究常用实验技术及方法
肿瘤学研究常用实验技术及方法复习题 1.表观遗传的科学内涵 三个特点？ a)基因功能完全、稳定地丧失，有遗传性； b)细胞外环境长期作用的结果，有可逆性； c)分析方法灵敏，可检出少数细胞的变化 2.变性高效液相色谱(DHPLC)技术在肿瘤研究中的应用 DHPLC 的主要应用？ Separation of DNA, MSI, LOH, STRs, Q-PCR, detection of mutation , SNPs, oligos, RNA. 3. 蛋白质分离纯化及鉴定 i.分离纯化蛋白质的方法有哪些？ 盐析，透析，离心，凝胶过滤（分子筛）层析，离子交换层析，亲和层析，高效液相层析。 ii.等电聚焦电泳（IEF）与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）有何不同？ 等电聚焦电泳：利用蛋白质分子等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。 SDS-PAGE:蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子，所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷的差异。在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以 说是取决于蛋白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷量无关 iii.两种等电点相近的，分子量相差较大的蛋白质应该首选那种分离方法？SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 iv.蛋白质印迹（Western Blotting）过程中应注意的事项有哪些？ 1.丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时一定要注意 防护。 2.制备聚丙烯酰胺凝胶时，小心防止凝胶渗漏。 3.蛋白加样量要合适，加样量太小，条带不清晰，加样量太大，则泳道超 载，条带过宽而重叠，甚至覆盖至相邻泳道。
《肿瘤学概论》考试题及答案(一)
《肿瘤学概论》考试题目参考答案 名词解释 1．癌前病变：从正常组织到发生癌变的中间阶段称为癌前病变2．直接致癌物：本身直接具有致癌作用，在体内不需要经过代谢活化即可致癌。 3．间接致癌物：大多数的致癌物不是其原型致癌(直接致癌物)，而是需要在哺乳动物体内经过代谢激活后才有致癌作用，这些致癌物又称间接致癌物。 4．肿瘤的放射治疗：广义的放射治疗既包括放射治疗科的肿瘤放射治疗，也包括核医学科的内用同位素治疗；狭义的放射治疗一般仅指前者，即人们一般所称的肿瘤放射治疗。 5．肿瘤的姑息治疗：通过对患者疼痛等症状以及其他生理、心理和精神方面问题的早期诊断和正确评估，来缓解和处理患者痛苦的治疗措施。姑息治疗目的是提高癌症患者生活质量，帮助患者及家属面对与威胁生命疾病相关的各种问题 6．肿瘤的分子靶向治疗：针对可能导致细胞癌变的环节，如细胞信号传导通路、原癌基因和抑癌基因、细胞因子及受体、抗肿瘤血管形成、自杀基因等，从分子水平来逆转这种恶性生物学行为，从而抑制肿瘤细胞生长，甚至使其完全消退的一种全新的生物治疗模式。 7．肿瘤的免疫耐受：指免疫活性细胞接触抗原性物质时所表现的一种异性的无应答状态。当肿瘤长期存在时，与未成熟或幼稚免疫活性细胞接触，就可能诱发机体对肿瘤抗原产生免疫耐受性。
8．无瘤原则：指应用各种措施防止手术操作过程中离散的癌细胞直接种植或播散。 9．三阶梯止痛法：是一种根据患者疼痛等级为治疗原则的止痛方法，一阶是指轻度疼痛给予非甾类抗炎药加减辅助止痛药，二阶中度疼痛给予弱阿片类加减非甾类抗炎药和辅助止痛药，三阶重度疼痛给予阿片类加减非甾类抗炎药和辅助止痛药。 10．根治术放射治疗：利用手术拨开正常组织和器官，对肿瘤进行单次大剂量冲击性放射杀伤。 问答题 1.细胞癌基因的分类 ?1、细胞外的生长因子 ?2、跨膜的生长因子受体 ?3、胞内信号传递体 ?4、核内转录因子 2.肿瘤转移的基本过程 细胞脱离原发瘤群体、通过浸润在周围间质中生长、与局部毛细血管或淋巴管密切接触并穿透其管壁、被转运到达靶组织或靶器官、再逸出毛细血管或淋巴管壁并在间质中不断增生形成新的继发瘤。 3.肿瘤化疗的适应症 （1）造血系统恶性肿瘤，对化疗敏感，通过化疗可完全控制甚至根治，如白血病，多发行骨髓瘤，恶性淋巴癌等。 （2）化疗效果较好的某些实体瘤，绒毛膜上皮癌，恶性葡萄胎，生
肿瘤侵袭及转移
肿瘤侵袭及转移 北京大学医学部病理学系方伟岗良性肿瘤仅在原发部位生长扩大，而具有浸润性生长的恶性肿瘤，不仅可以在原发部位继续生长、蔓延(直接蔓延)，而且还可以通过各种途径扩散到身体其他部位(转移)。肿瘤转移是恶性肿瘤最显著的生物学特性之一, 是临床肿瘤病人的主要死因. 一. 转移的基本概念: 肿瘤转移 (tumor metastasis) 是指肿瘤细胞脱离原发生长部位, 通过各种途径的转运, 在机体内远离原发部位的器官 / 组织继续增殖生长, 形成同样性质肿瘤 (转移瘤) 的过程. 在原发部位生长的肿瘤称为原发瘤（primary tumor）,在远隔部位生长的肿瘤称为转移瘤(metastatic tumor).恶性肿瘤中，只有少数肿瘤不发生或很少发生转移，如皮肤的基底细胞癌、脑的恶性胶质细胞瘤。 肿瘤演进 (progression) 是经常遇到的一个概念, 它是指从良性肿瘤转变成恶性肿瘤所必须发生的一系列事件的综合, 至少包括: 失控性生长, 血管化, 抗药性, 浸润, 转移等. 浸润和转移是肿瘤演进的最后阶段. 二. 转移的基本过程: 肿瘤转移是一个复杂的多步骤连续过程, 其中至少包含以下步骤: 原发部位肿瘤细胞脱离原发瘤, 侵袭穿越基底膜并向周围间质浸润性生长, 穿越局部毛细血管 / 淋巴管壁进入管腔, 与血小板聚集或形成小瘤栓, 随血液 / 淋巴液运输到达靶器官毛细血管床, 与该部位的血管 / 淋巴管内皮细胞发生粘附, 穿越管壁和基底膜进入周围间质, 不断增殖形成转移瘤（图1）. 肿瘤细胞的浸润 (invasion)是指肿瘤细胞脱离原发瘤, 侵袭穿越基底膜并向周围间质浸润性生长，但尚未进入局部毛细血管 / 淋巴管的阶段，和转移是相互联系的病理过程. 浸润是转移的前提, 但不一定发生转移; 而转移必定包括浸润过程. 三. 肿瘤转移的主要途径: 1.淋巴道转移： 淋巴道转移是癌转移的重要途径，少数肉瘤如滑膜肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤也可发生淋
肿瘤迁移和侵袭试验
肿瘤迁移和侵袭试验——Millicell小室测定法 【实验材料】 1、肿瘤细胞及其所需培养液； 2、Transwell小室（Millipore公司，直径12mm，孔径8μm）； 3、人工基质胶（ECM，Sigma公司）； 4、24孔细胞培养板； 5、无水乙醇、苏木精、伊红染液，棉签； 6、载玻片、手术刀片。 【实验步骤】 1、接种细胞前一天，将ECM胶与预冷的无血清和抗生素（双无）1640按1：7的比例以总量32μl铺在 transwell小室的上室面，注意不能有气泡产生；再将小室置于24孔细胞培养板内，超净台内紫外线照射过夜。（做肿瘤迁移实验则不需要此步） 2、接种细胞：用不含血清的培养液制备单细胞悬液，将细胞密度调整为2.5×105个/ml，取400μl加入 上室中；在下室即24孔板内加入600μl含20%FBS的1640培养液。 3、细胞培养：将24孔板置于37℃、5%CO2细胞培养箱内，培养24小时。 4、固定细胞：待培养时间结束后，吸尽上室内液体，小心取出上室，用湿棉签檫去膜上面未穿过膜的细 胞，自然风干后以无水乙醇置于细胞培养箱内固定20min。 5、细胞染色：固定后的细胞先以苏木精染色20min，清水清洗一遍；再用伊红染色20min后清水清洗一 遍。 6、细胞计数：染色完毕后将小室自然风干，用手术刀片沿压痕将小室膜轻轻切下，置于载玻片上在显微 镜下观察、计数。 【注意事项】 1、由于ECM在室温或温度更高的情况下极易凝固成胶状，且此过程为不可逆的，因此建议在配制人工 基底胶时可在冰上操作；
2、ECM与双无1640的比例可根据试验情况在1：5到1：10之间调节； 3、接种细胞之前一定要细胞计数，细胞密度最好不要超过5×105个/ml； 4、下室内的培养液亦可换成小鼠成纤维细胞系NIH3T3条件培养基，制备方法：用含10%FBS的1640 培养液在37℃、5%CO2条件下培养，在细胞长势良好的情况下换成双无培养液继续培养24小时，然后收集培养上清液，冰冻保存备用。 5、细胞培养的时间依肿瘤细胞类别有所不同。 6、细胞固定及染色时应注意每次都要将小室风干，必要时可将小室倒置。 7、Harris苏木精染液配制方法： 苏木精1.0g 硫酸铝钾15g 无水乙醇10ml 蒸馏水200ml 先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精，再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min 后稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖住瓶口。使用之前用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。 8、伊红染液配制方法： 伊红Y 0.5~1.0g 蒸馏水100ml 先将伊红Y加入蒸馏水中，用玻璃棒将伊红搅起泡沫后过滤，每100ml加冰醋酸1滴。 附： 正常胃癌SGC7901细胞株
肿瘤细胞迁移实验(细胞划痕法)讲义
抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响 （细胞划痕法） 实验导读 瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。 肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官， 长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。 图1肿瘤转移示意图 根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力， 核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即 所谓异质性。异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。 肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时， 往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。当纤维母细胞生长过程中在培
养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。 针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。 细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力。 下图即为划痕实验的示意图，图中可见，在细胞层上出现一道空痕（A），当加入药物后， 由于药物的作用使细胞迁移受到抑制(B)，而未加入药物的细胞保持了原有的迁移能力，在 一段时间后通过迁移将划痕掩盖(C)。 A B C 图2实验结果（A表示在单层细胞上划出的一道痕；B表示加入抑制剂，为阳性对照组； C 表示未加入抑制剂，为阴性对照组） 一、实验目的 1．了解肿瘤细胞转移的基本原理
肿瘤细胞侵袭试验(Tumour Invasion Assay)原理和实验步骤
肿瘤细胞侵袭试验（Tumour Invasion Assay）原理和实验步骤一、原理 Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。 滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。 铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间，铺有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关，选择25ugMartrigell铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。另外用Trans well小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel，加入细胞72h后观察结果。值得注意的是，细胞在TransWll腔中培养72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。 在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验(ｃell ｍｉgratiｏn ａssay) 实验介绍?细胞迁移与侵袭实验将Traｎswell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究得细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞,应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。 1材料准备:?可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶得(Ｃoｓter与实验步骤:? Corning公司得也较常用),Ｔrａnswelｌ迁移实验得细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买得Trａnｓwｅｌl小室相配套,BD公司得Matrigel,无血清ＤMＥM,(1%胎牛血清)ＤMEM与1640培养基,ＤMEM完全培养基,１6４0完全培养基(也可加到20%血清),无菌P ＢＳ,棉签,胰酶,４％多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1％(g/ml)PBS结晶紫)?2步骤与流程?2。1基质胶铺板: 用BＤ公司得Mａｔｒigel1:8(根据细胞产生mmp得量来决定)稀释,包被Ｔraｎswell小室底部膜得上室面,置3７℃30min使Ｍaｔrigeｌ聚合成凝胶、使用前进行基底膜水化。?２、2制备细胞悬液?①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12—24h,进一步去除血清得影响。但这一步并不就是必须得、 ②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用ＰBS洗1－2遍),用含ＢSA得无血清培养基重悬、调整细胞密度至5×10５/ml。?２。3接种细胞 ①取细胞悬液１00μl加入Trａnｓwelｌ小室、?②24孔板下室一般加入600μl含20％ＦBS 得培养基,特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。?③培养细胞:常规培养12-４８h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。２４h较常见,时间点得选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目得影响也不可忽视、?2、４结果统计 直接计数法,“贴壁"细胞计数,这里所谓得“贴壁”就是指细胞穿过膜后,可以附着在膜得下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞、 取出Ｔｒanｓｗelｌ小室,弃去孔中培养液,用无钙得PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。?0、1%结晶紫染色２０mｉｎ,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用ＰBS洗3遍。?４00倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。 实验材料 (１)Tｒａnｓwell ｃhamber: 24—ｗell, 8。０-μm porｅ meｍｂranes (C ｏｒning) (2)细胞培养相关试剂:无血清培养基,10%血清培养基,PBS,0.02%ＥＤTA (３)固定液:甲醇 (４)染色液:Giemsa染液 (5)封片剂:中性树胶 (６)其她:小镊子,棉棒,载玻片,盖玻片 操作步骤
肿瘤侵袭和转移的恶性生物行为及分子干预
项目名称：肿瘤侵袭和转移的恶性生物行为及分子 干预 首席科学家：詹启敏中国医学科学院肿瘤医院肿瘤 研究所 起止年限：2009.1至2013.8 依托部门：教育部
一、研究内容1．细胞周期调控异常与肿瘤恶性增殖、侵袭相关分子机理 肿瘤是一种“细胞转导通路异常”性疾病,我们将通过分子生物学、细胞生物学、和动物模型相结合的研究技术，重点研究抑癌基因p53、BRCA1、Gadd45介导的信号通路与细胞周期蛋白Aurora-A、Cyclin B1、Plk1的相互作用，以及在细胞周期调控和肿瘤恶性表型形成中的生物学功能和分子机制。从而揭示细胞增殖失调与肿瘤侵袭转移的内在联系。 2．细胞凋亡和分化异常与肿瘤侵袭性生长的关系 细胞凋亡调控机制的异常与侵袭特性生长密切相关。促进细胞死亡的机制失活和抑制凋亡的分子的大量表达使癌症细胞存活延长，使基因突变的积累和癌变机会的增加，同时凋亡机制的异常导致肿瘤细胞具有抗药性。通过对细胞死亡新机制、肿瘤干细胞凋亡相关研究、细胞信号转导与凋亡调控等研究，深入探讨侵袭性生长的机制。 3．肿瘤干细胞和肿瘤微环境与肿瘤转移的内在关系 以恶性肿瘤干细胞特异性表型为突破口，从白血病干细胞延伸至实体瘤干细胞，研究其自我更新和分化的特性，探讨肿瘤转移的起始因素和关键分子生物学性质，认别恶性肿瘤干细胞与微环境或肿瘤“基质”间的相互作用机制,从而为特异性打击肿瘤干细胞作为彻底消除肿瘤转移潜能的一种新策略提供重要的理论基础。 4. 肿瘤血管和淋巴管新生介导的肿瘤转移机制 已鉴定肿瘤组织中血管表达Tim-3和淋巴管表达Sema4c等是沉默抗肿瘤免疫的重要活性分子，能通过与淋巴细胞的对话，诱导机体对肿瘤的免疫耐受，是新发现的肿瘤免疫逃避机制。在本项目中我们拟进一步研究血管和淋巴管促肿瘤转移的动力学，应用切片流式细胞仪等最新一代高通量组织和细胞分析平台，确定血管和淋巴管中预示早期肿瘤转移的始动免疫分子和对其进行靶向干预策略的有效性。 5. 肿瘤转移标记物与肿瘤转移靶向识别 将在前期工作的基础上，开展肿瘤标志物的应用及相关机制研究，着重围绕针对肿瘤转移病灶的标志物及对肿瘤细胞恶性生物行为影响的分子机制进行研
肿瘤细胞侵袭试验(Tumour Invasion Assay)
一原理 Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。 滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel的滤膜，这与体内情况较为相似。 铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间，铺有Martrig el面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关，选择25ugMartrigell铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。另外用Transwell小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel，加入细胞72h后观察结果。值得注意的是，细胞在Trans Wll腔中培养72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。 在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。 二材料 1. Matrigel 基质胶（威格拉斯生物技术（北京）有限公司），10mg/ml，5ml，分装成0.5ml/只10个EP管中；用时加入0.5ml的DMEM； Matrivgel在冰上维持液态，室温时可迅速凝结成胶。使用前应从-20℃转移至4℃待其自然溶化（如过夜放置），避免反复冻融。使用时需接触Matrivgel的试管、
Transwell侵袭实验总结
Transwell侵袭实验 1 实验用品： ①Transwell小室： 多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。 这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。BD也有已包被好的，价格不清楚。Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，但据说每个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情。 Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干净，用前用紫外里外都照30min。sword01战友提供的处理方法：用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3×5min，蒸馏水3×5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×2。 因为我买的是铺好胶的，所以没买Matrigel，二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。以前的Chemicon ECM550系列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很多次，但现在的膜已经改用一种很薄很脆的材料，一般只能重复用一次，真黑啊！很多战友说Costar和Corning 也是可以重复用的，大家可以试试。 另外，根据论坛战友提供的信息，osmonic公司有专用的膜出售。Transwell小室用过后，可把原来的膜切下，贴上osmonic公司的膜，这样又可以用了，不过我没用过，有兴趣的可以试试。使用方法：trasnwell小室做一次后，将原来的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用无色较稀的）将osmonic 公司的膜贴上，剪掉多余的边缘。再照紫外。 ②上层培养液： 上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA。 ③细胞： 值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就盲目进行Transwell侵袭实验，可能会造成不必要的浪费，一次Transwell侵袭实验花钱少则数百，多则数千，并不是笔小数目，还是小心为妙。另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿12－24h，再进行实验。 ④基质胶： 常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司等。CaoY战友的帖这么说的：Matrigel 是BD公司生产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。同样的东西在sigma叫ECM。如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就
肿瘤细胞侵袭实验具体步骤及详细说明
肿瘤细胞侵袭实验具体步骤及详细说明 Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM 培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。 滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。 铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间，铺有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关，选择25ugMartrigell铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。另外用Transwell小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel，加入细胞72h后观察结果。值得注意的是，细胞在TransWll腔中培养72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的
能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。 在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。一、准备 1. 溶胶，4℃过夜。 2. 室温下基质胶易成凝胶，所以，步骤2和3种使用试管和枪头要在试验前-20C预冷。 二、包被基底膜（冰上操作） 1. 用无血清的冷细胞培养基DMEM稀释Matrigel胶。 2. 取100 ul稀释胶加到24-well transwell上室中。 3. 37℃孵育transwell至少4-5 h 。