水稻遗传转化体系Protocol样本
水稻遗传转化研究进展
物遗传转化技术迅 猛发展 ， 稻转基 因植 株始 于 １８ 水 ９８
年， 经过近 ２ ０年的发 展 ， 稻遗传 转 化体 系 已 比较 完 水
１２ 电激 法 （ ｌ ｔ ｐ ｒ ｉ ） ． Ｅｅ ｒ ｏａ ｏ ｃｏ ｔｎ
电激法 也 叫 电穿 孔法 ， ２ 是 ０世纪 ８ ０年代初 发展
起来 的一种遗 传转 化技术 ， 也是 以原生 质体为 受体 的
一
水稻转基 因于 ２ ０世纪 ８ ０年代 后期 获得成 功 ， 最 初转 化均采 用原生质体为 材料 的 Ｐ Ｇ介导法 ， Ｅ 后来相 继发展 了电击法 ， 因枪 法及农 杆 菌介 导法 等。这些 基
应用。
关键词 ： 水稻 ； 传 转 化 ； 响 因素 ； 用 遗 影 应
中 图分 类 号 ： ７４ Ｑ ５ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ８— ６ ２ ２０ ）５—００ ０ １０ ９ ３ （０ ８ ０ ０ ５— ５
水稻（ ｒ ａｓｔ ａ 是世 界上分 布 最广 ， Ｏｙ ｉ ） ｚ ａｖ 作为 最重 要 的的粮食 作物之一 ， 其遗 传转化一直受 到广泛重视 。 但是传统 的水稻育种方法 主要是 利用远缘杂交 和 品种
第２ ５卷第 ５期 ２０ ０ ８年 １ ０月
生 物 学 杂 志
Ｊ ０ＵＲ ＮＡＬ ０ Ｉ Ｌ Ｆ Ｂ Ｏ ＯＧＹ
Ｖｏ ． ５ Ｎｏ ５ １２ ．
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水 稻 遗 传 转 化 研 究 进 展
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水稻转基因实验操作手册整理解析
水稻转基因实验操作一、水稻愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌三角瓶中，倒入70%酒精消毒1分钟；2）倒去酒精，加入100ml 3 %次氯酸钠（NaClO）溶液（次氯酸钠：水（V/V）=9:21），放入摇床振荡60分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿10颗；2）操作完毕用封口膜封好培养皿，在26℃培养箱，（光）暗培养10-15天；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在26℃光（暗）培养箱，继代培养2周（继代两次）。
(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)二、预培养将继代两次的状态较好的愈伤颗粒，接种到预培养基26℃暗培养4天。
预培养基碳源为20克蔗糖+20ml 50% 葡萄糖（115度灭菌30min）。
乙酰丁香酮（AS）浓度为100 μM (每毫升培养液中加入100 mM的AS 1微升)三、农杆菌（工程菌）培养把-70℃保存的菌种首先用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB液体培养基，在26-28℃，150 r/min振荡培养16-18 h，活化转入打靶载体的农杆菌。
在预培养的第2天，用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB固体培养基划线接种农杆菌菌株，28 ℃静止培养2-3 d。
3 d后将单菌落农杆菌刮入农杆菌悬浮液体培养基或者AAM培养基，28 ℃振荡培养3～4 h。
分光光度计测定菌液浓度，并将其浓度调至0.5-1.0 OD600四、感菌与共培养1）将预培养后的愈伤组织接入100 mL三角瓶,中，加入调制好的农杆菌悬浮液侵染30分钟，期间摇动数次；2）倒去菌液，将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上吸干表面菌液（30-40分钟）；3）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。
水稻 花粉管通道法
水稻花粉管通道法摘要水稻花粉管通道法是一种高效、实用的遗传转化方法，广泛应用于水稻遗传改良。
本文介绍了水稻花粉管通道法的原理、技术流程、优缺点以及应用前景，以期为相关研究提供参考。
一、引言水稻是全球重要的粮食作物之一，对人类生活和经济发展具有重要意义。
为了提高水稻产量和品质，科学家们不断探索新的遗传改良方法。
其中，花粉管通道法是一种具有广泛应用前景的遗传转化方法。
二、原理花粉管通道法的基本原理是利用植物的花粉管通道，将外源基因导入植物受精卵中，实现基因的转移和表达。
在花粉与卵细胞结合形成受精卵的过程中，花粉管会穿过卵细胞壁，与卵细胞融合。
此时，外源基因可以通过花粉管通道进入受精卵，并随受精卵的发育而表达。
三、技术流程1. 基因构建：首先，将目标基因与合适的载体连接，构建成表达载体。
2. 载体转化：将构建好的表达载体导入植物细胞或原生质体中，获得转基因细胞或原生质体。
3. 细胞培养：将转基因细胞或原生质体进行培养，筛选出转化成功的细胞或原生质体。
4. 植株再生：将转化成功的细胞或原生质体培养成植株，并进行表型鉴定和分子检测。
5. 遗传稳定性检测：对转基因植株进行多代繁殖，检测其遗传稳定性。
四、优缺点1. 优点：花粉管通道法具有操作简便、转化效率高、适用范围广等优点。
此外，该方法不需要组织培养和病毒载体等辅助手段，降低了实验成本和操作难度。
2. 缺点：花粉管通道法也存在一些缺点，如转化过程中可能存在基因沉默现象、转化植株的遗传稳定性有待进一步验证等。
此外，该方法对环境可能产生一定影响，需要加强安全性和可持续性方面的研究。
五、应用前景随着基因编辑技术的发展和应用，花粉管通道法在基因功能验证、新品种培育等方面具有广阔的应用前景。
未来，科学家们可以进一步优化花粉管通道法技术流程，提高转化效率和安全性，为水稻遗传改良提供更加高效、实用的方法。
同时，随着人们对食品安全和环境保护意识的提高，对转基因作物的监管和审批也将更加严格。
一种改进的水稻成熟胚愈伤组织高效基因转化系统
＋Ｏ５ｍｇＬ Ｋ ． ． Ｔ＋Ｏ２ｍｇＬ Ｚ ） ． ．～ Ｔ 。另外 ， 还分析 了影 响Ｔ Ｄ Ａ 移 的多种 因素， ｎ ｌ 体种 类 、愈 伤组织 预培养 基和愈 伤 －Ｎ 转 ￣＃植 － 组 织继代 次数等 。采 用优 化的转化 程序 ， 水稻愈 伤组织转 化率 和植 株转化 率可 达７ ％以上 。 ０
ａ．２ ０ ） 验证 了该 系统 的适 用性 、 １ ０ ７， ， 可靠 性 和高效性 。
收稿 日期 ： ０ ７０ － ０ 接受 日期 ： ０ ７ １ 一 ９ ２ ０ —６２ ； ２ ０ — １Ｏ 基金项 目：国家 自然科 学基金 （ ｏ ３ ６ ０ ５ Ｎ ．０７１ ） ８ ‘通讯作 者 。Ｅ ｍａｌ ｃ ｏ ｇ ＠ｉ ａ ．ｃｃ － ｉ ｈ ｎ ｋ ｂ ｓａ ．ｎ ： ｃ
２ ０ ； ｔ １ ２ ０ Ｚｈ ａ ｇ ｅ １ ２ ０ Ｊ ａ ｇ ｅ ０ ４ Ｘｕ ｅ ． ０ ５； ｕ ｎ ｔａ ． ０ ６； ｉ ｎ ｔ ａ ， ，
成熟胚 的取用 ： 取消毒 后的成 熟种子 ， 用无菌水 浸 泡 ， — 小时 后， １ １ ２ ６ 转移 到无菌 培养皿 中， 用无 菌纸吸干
关键 词 农 杆菌介 导 的遗 传转 化， 成熟 胚诱 导 的愈伤组 织， 稻 水
陈惠 ， 原，种康 （０ ８． 赵 ２ ０ ） 一种 改进 的水稻成 熟胚 愈伤组 织 高效转化 系统 ． 物学 通报 ２ ， ２ — ３ ． 植 ５ ３２ ３１
一种改进的水稻成熟胚愈伤组织高效基因转化系统
植物学通报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ ２００８， ２５ （３）： ３２２−３３１， ｗｗｗ．ｃｈｉｎｂｕｌｌｂｏｔａｎｙ．ｃｏｍ收稿日期： ２００７－０６－２０； 接受日期： ２００７－１１－０９基金项目： 国家自然科学基金（Ｎｏ． ３０６７０１８５）＊ 通讯作者。
Ｅ－ｍａｉｌ： ｃｈｏｎｇｋ＠ｉｂｃａｓ．ａｃ．ｃｎ．技术与方法．一种改进的水稻成熟胚愈伤组织高效基因转化系统陈惠１， ２， 赵原１， 种康１＊１中国科学院植物研究所， 光合作用与环境分子生理学重点实验室， 北京 １０００９３２山西师范大学生命科学学院， 临汾０４１００４摘要 以成熟胚愈伤组织为材料的农杆菌介导水稻转化法虽已建立， 但转化频率仍有待提高。
本文以粳稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）品种（中花１０号和中花１１号）的成熟胚诱导的愈伤组织为受体材料， 对组织培养体系及影响遗传转化的因素进行优化， 建立了一套改进的农杆菌介导的水稻高效遗传转化系统。
农杆菌菌株为ＥＨＡ１０５， 质粒载体是ｐＵＮ１３０１／ ＯｓＲＡＡ１， 其中含有标记基因ＧＵＳ 和筛选基因ＨＰＴ。
愈伤组织诱导培养基为ＮＢＤ２ （ＮＢ＋２ ｍｇ·Ｌ－１２，４－Ｄ）， 继代培养基为ＮＢＤ０．５， 预分化与分化培养基为ＲＥ１ （ＭＳ＋１ ｍｇ·Ｌ－１６－ＢＡ ＋ ０．２５ ｍｇ·Ｌ－１ ＮＡＡ ＋ ０．５ ｍｇ·Ｌ－１ ＫＴ ＋ ０．２ ｍｇ·Ｌ－１ ＺＴ）和ＲＥ２ （ＭＳ＋ １ ｍｇ·Ｌ－１ ６－ＢＡ ＋ ０．５ ｍｇ·Ｌ－１ ＮＡＡ＋ ０．５ ｍｇ·Ｌ－１ ＫＴ ＋ ０．２ ｍｇ·Ｌ－１ ＺＴ）。
另外， 还分析了影响Ｔ－ＤＮＡ转移的多种因素， 如外植体种类、愈伤组织预培养基和愈伤组织继代次数等。
采用优化的转化程序， 水稻愈伤组织转化率和植株转化率可达７０％以上。
水稻遗传转化技术的研究
水稻遗传转化技术的研究水稻是世界各国普遍栽种的粮食作物之一。
然而，由于传统种植方式的限制，其产量难以满足日益增长的全球人口需求。
因此，科学家们在水稻的遗传转化技术方面进行了深入研究，旨在创造更优良的品种，提高水稻的产量和免疫能力。
水稻遗传转化技术是指将具有特定功能的基因导入水稻细胞中，从而实现对水稻基因组的改造。
这些外源基因可用于提高水稻的耐旱性、抗病性、对环境和气候变化的适应能力，并且提高了水稻的营养含量和食用品质。
近年来，许多研究表明，水稻的遗传转化技术已经成为改良水稻的首选方法。
例如，通过引入特定的抗病基因，可以提高水稻对某些病原体的抵抗力。
而通过提高水稻对干旱的耐受性，可以使其在干旱地区的产量显著增加。
此外，遗传转化技术还可以提高水稻的抗逆能力，使其能够在不同的环境条件下生存和繁殖。
然而，水稻遗传转化技术也存在一些争议。
在引入外源基因时，需要使用转基因技术，可能引起一些人类的健康问题。
此外，转基因作物由于生长性状和基因改变以及某些遗传特性的损失，可能引起对野生生态系统的影响。
尽管存在争议，但是关注水稻遗传转化技术的研究仍在继续，有许多新的突破和研究成果。
例如，研究人员已经开发出一种新的方法，其中使用了“基因枪”，可以将特定的基因粒子引入水稻细胞中，从而避免对整个基因组的改变。
此外，一些研究也表明，基因编辑技术可以用于修复水稻DNA序列中的突变，从而提高其产量和品质。
综上所述，水稻遗传转化技术在改良水稻和提高产量方面发挥着重要的作用。
随着技术的发展和改进，人们对它的应用范围和潜力也有了更深入的认识。
未来，随着更多的科学研究和技术创新的出现，水稻遗传转化技术将有望成为改良农作物和提高全球粮食安全的重要手段之一。
农杆菌介导的植物遗传转化研究进展
Progress on Agrobacterium tumefaciens-mediated Plant Transformation
YAO Ran1，2 ，SHI Mei-li1 ，PAN Shen-yuan1 ，SHEN Gui-fang2 ，ZHANG Zhi-fang2*
1． School of Life Science，Xuzhou Normal University，Jiangsu Xuzhou 221116，China 2． Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China
粳型水稻遗传转化体系的研究的开题报告
粳型水稻遗传转化体系的研究的开题报告一、选题背景：粳型水稻是我国主要的作物之一，但由于其遗传特性的复杂性和传统育种的限制，往往无法满足人们对于高产、抗性等方面的需求。
因此，利用现代生物技术手段，通过遗传转化技术对粳型水稻进行改良成为一个研究热点。
本项目旨在建立一个较为完善的粳型水稻遗传转化体系，并对其进行相关的基础研究。
二、研究目的：1. 建立粳型水稻遗传转化技术体系；2. 掌握利用外源DNA转化粳型水稻的方法，为今后水稻基因克隆和遗传改良打下基础；3. 研究粳型水稻转化后的遗传稳定性，为下一步培育水稻组织培养系统和纯化转化体系奠定基础。
三、研究内容：1. 粳型水稻愈伤组织的培养优化；2. 利用农杆菌介导的植物遗传转化技术，将外源DNA导入粳型水稻愈伤组织；3. 采用PCR技术对转化后的粳型水稻进行基因检测；4. 对转化后的水稻植株进行观察和分析，验证转化体系的可靠性和稳定性。
四、研究意义：1. 建立一个适用于粳型水稻的遗传转化体系，为我国水稻遗传改良和生产提供技术支撑；2. 提高人们对于粳型水稻遗传特性的认识，推动水稻基因组学领域的发展；3. 探索粳型水稻的遗传规律和基因功能，为粳型水稻的后续研究提供基础数据。
五、研究方法：1. 利用精细的组织培养技术，筛选适合遗传转化的愈伤组织；2. 利用农杆菌的介导技术将目标基因导入粳型水稻愈伤组织；3. PCR扩增和基因测序技术对转化后的水稻进行体系建立和基因识别；4. 在对转化体系稳定性的验证中，采取随机抽样的方式进行评估和分析。
六、预计研究难点：1. 细胞外源DNA导入后的整合几率和效率低；2. 在遗传转化体系构建和质谱分析中的技术难点；3. 转化体系的可靠性和稳定性难以确保。
七、研究计划：1. 建立粳型水稻愈伤组织的培养体系，整合不同的培养基和生长条件；2. 构建转化体系并进行转化实验，利用PCR技术鉴定基因型；3. 通过基因测序和Blackwell分析等方法，对基因搜索和定位；4. 加强对体系可靠性和稳定性的验证，对分析结果进行分析和总结。
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资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 水稻遗传转化体系Protocol
Introduction 1．水稻的遗传转化研究历史与现状 20 世纪80 年代末, 水稻的遗传转化首获成功。1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用”电击法”或”PEG 介导法”等方法将外源基因导入到水稻中并获得再生植株[1~3]。1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中获得成功[4], 随后成为水稻遗传转化的常见方法之一。1993 年, Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常见的方法。 此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。虽然Hiei 等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 可是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据她们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼稻的转化能够在两个半月内完成, 且转化效率非常高(一个幼胚能够得到5~13 个独立的转化植株)。 2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11] 资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 a. 转基因抗虫水稻 对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、 三化螟、 稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 当前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 可是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。 b. 转基因抗病水稻 见抗水稻病毒研究 c. 转基因抗旱水稻 d. 转基因营养高效利用水稻 e. 转基因优质水稻 f. 转基因高产水稻 g. 转基因抗除草剂水稻 3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用 随着RNA干扰技术( 包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰) 在抗病毒基因工程上的广泛研究和应用[13~18 ], 结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术来研究水稻, 获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视, 成为国内外水稻病毒研究的热点。当前, 国内在这方面属于起步阶段, 仅仅做了一些构建干扰载体和获得RNA干扰植株[19~27], 但并没有获得高抗植株, 国外, 特别是日本在这方面有着较大优势, Omura T实验室分别在 和 已获得了对资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 RDV、 RSV高抗植株[28, 29], 另外Himani在 也获得了对RTBV高抗的植株[30]。( 重要是看以上文献, 一定要认真体会)
Materials and methods 一、 接种 步骤: 1、保存在-20度的种子使用前取出( 用多少取多少, 用纸包好) , 置于37度恒温箱烘烤10-20小时左右( 最好过夜) 。 2、拨去种皮( 1) , 尽量不要损害到种胚, 拨皮后检查, 将胚乳表面发黑或胚死亡的种子剔掉( 2) , 用纸包好带入组培操作间。 3、( 以下操作均在超净工作台内进行) 将种子倒入干净的100ml三角瓶中, 加入75%乙醇消毒2分钟, 期间要不断的摇动, 倒出酒精, 再加入20ml 2%的NaClO(3),覆盖种子即可, 室温在摇床上160rpm摇25min, 将NaClO倒掉, 将种子用无菌镊子转移至高压灭菌过的滤纸上, 在超净工作台上吹干为止, 然后将种子接入诱导培养基( NB培养基) ( 5) 上, 每皿20粒( 4) , 注明日期, 封口膜封口, 置于27℃恒温箱中暗培养( 15) ; 二、 掐芽 种子在培养箱中培养7天后, 长出可见的芽和遁片, 根据种子的生长状态, 将芽掐掉( 16) , 继续在27°C恒温箱中暗培养。 三、 继代 掐芽后7天左右, 进行第一次继代, 用镊子将新长出的愈伤资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 夹成小块( 17) , 转入新的NB培养基中, 每皿20粒, 在27度恒温箱中暗培养15天后进行第二次继代, 培养15天后, 就能够长出颜色鲜黄, 表面光滑, 直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒。大小合适的愈伤能够进行预培养, 小的就进行第三次继代。 四、 农杆菌介导的水稻遗传转化 共培养( 整个操作过程需8天) 第一天: 选取自然分散, 颜色鲜黄, 直径约为2-3mm的颗粒愈伤, 置于27度暗培养4天。 第三天: 农杆菌划线28°培养, 两天后农杆菌长满即可洗脱( 18) , 用于转化。 第五天: 悬浮农杆菌, 悬浮于添加有100uM乙酰丁香酮( AS) (19)20ML的AMM液体培养基(20)中, 剧烈震荡1min后, 静置1h, 让农杆菌形成悬浮液, 取菌液于三角瓶中加入经预培养的愈伤, 略微摇动静置30min, 于无菌纸上晾干愈伤后置于添加有100uM的乙酰丁香酮的NB培养基( AS培养基( 21) 上27度暗培养3天。 第八天: 等农杆菌生长至可见的愈伤下的菌斑, 但未长满愈伤时, 挑取愈伤于无菌培养瓶中, 用无菌水冲洗, 直至无可见菌丝为止, 最后用含300mg/l的羧苄无菌水静置1h, 置于无均滤纸上晾干后, 转移至筛选培养基上。 五、 抗性愈伤的继代筛选 当抗性愈伤在朝霉素30培养基( 22) 上生长15天后( 23) , 将愈伤换到新的朝霉素30培养基上, 15天后可观察到一些褐化愈资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 伤开始长出的新的愈伤, 继续培养, 等新愈伤长出很多时转移至朝霉素50培养基( 24) 上, 筛选3-7天。 六、 分化 从朝霉素50培养基中将继续增生分裂的抗性愈伤转入分化培养基( 25) 上再生, 成团而不是分散放置( 26) , 一周后愈伤开始转绿, 三周后开始长出幼芽, 随后根也长出, 当芽长至2-3cm时, 就可移至1/2MS培养基( 生根培养基) 上( 27) 。 分化间进行, 25°( 28) , 光14小时, 暗10小时。 七、 生根 超净工作台内进行, 每个培养瓶中只放一个抗性愈伤诱导出来的苗( 29) , 在生根培养基上生长10天。( 30) 分化间进行, 25°, 光14小时, 暗10小时。 八、 炼苗 生根十天后开盖, 加已晾两天或晒过的水, 泡过培养基即可( 28) , 2天后( 28) 用水洗掉生根培养基, 加晾两天或晒过的水浸过根, 3-7天后待生长状态好了后移栽大田。( 期间每天要加水, 确保根都泡在水中) 。分化间进行, 25°, 光14小时, 暗10小时。 九、 移栽大田 土、 水提前晒上两天, 移栽盆装4/5体积的土, 用水浸透即可, 不能太多水, 刚好浸过土面最好。 移栽: 在盆上标记好, 盆宽移栽两株, 长四株; 移栽时不能插深, 植株能站住即可。 资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 10天后能够施一点肥, 不能太多。20天后能够每10天施肥一次, 同样不能太多, 太多会烧苗( 如烧苗, 施肥3天后能够观察到, 应马上将水换掉) 。 要保证白天29°( 30) , 晚上23°; 光14小时, 暗10小时。( 31)
Notes (1) 不用一粒一粒用手拨皮, 在桌上垫一些白纸, 用书压。力道要掌握好, 太用力把种子压碎了, 用力不够只能去个别的种皮, 效率低。 注意: 接触种子的纸必须是全白色的, 不能有印刷有子的, 否则用力压时, 墨就着黑色上种子。 (2) 不正常的种子, 一律丢弃。因为后期若是一粒种子长菌的话就污染了整盘。 (3) a. 20ml 2%的NaClO的配制: 实验室买的是有效浓9%的NaClO, 因此取4.5ml 9%的NaClO加16ml蒸馏水即配成2%的NaClO b. 2%的NaClO现用现配, 因为NaClO见光分解, 因此配了就要赶紧用。 (4) 20粒共三圈, 外圈12粒, 中圈7粒, 里一粒。 (5) NB培养基的配置( 800ml) : 实验准备: 所有玻璃仪器必须洗净再用双蒸水润洗 资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 步骤: 取一升三角瓶 → 加24g蔗糖 ↓ 依次加入80ml N6max( 10×) (6) 16 ml 铁盐 ( 50×) (7) 8 ml 肌醇 ( 100×) (8) 4 ml B5miin( 200×) (9) ↓ 加多点( 勿超500) 三蒸水摇使其溶解, 倒入1升量筒中, 再加三蒸水定容至780ml ↓此时PH应为4.2-4.3 PH调至5.8( 用pH计, KOH调) ↓ 加2.1g植物凝胶 ( 10) ↓ 高压灭菌( 121°20min) ↓ 灭完前30min, 拿出16ml有机, 化为液态 加1.6ml2.4-D( 1mg／ml) (11)至16ml有机(12)中 ↓ 待培养基稍烫手抽滤( 13) , 倒培养基(14) (6) N6max( 10×) 的配制( 配1L) :