谷氨酰胺合成酶(GS)检测试剂盒(氯化铁比色法)

简介：

谷氨酰胺合成酶(GS)是植物体内氨同化的关键酶之一，可以防止过多的铵离子对生物有毒性，在ATP 和Mg 2+存在下，谷氨酰胺合成酶催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，能催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，谷氨酰胺是氨的主要储存和运输形式。

Leagene 谷氨酰胺合成酶(GS)检测试剂盒(氯化铁比色法)检测原理是GS 催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，后者转化为γ-谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成红色的络合物，单位为μmol/(mg protein ·h)；也可间接用540nm 处吸光度的大小来表示，单位为OD/(mg protein ·h)。该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中谷氨酰胺合成酶活性，尤其适用于植物体内谷氨酰胺合成酶的活，100T 检测试剂盒可以测定50次左右样本。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：

自备材料：

1、蒸馏水

2、离心管或试管

3、匀浆器或研钵

4、低温离心机

5、恒温箱或水浴锅

操作步骤(仅供参考)：

1、准备样品：

①植物样品：取植物组织清洗干净，切碎，按植物组织：GS Lysis Buffer=比例，加入预冷的GS Lysis Buffer ，冰浴情况下充分匀浆或研磨，离心20min ，留取上清，即为谷氨酰胺

编号名称

TE1103 100T Storage

试剂(A): GS Lysis Buffer 250ml 4℃ 试剂(B): GS Assay Buffer 250ml 4℃ 试剂(C): GS 启动剂 10ml RT 试剂(D): ATP

2支 4℃

试剂(F): 蛋白标准(BSA) 20mg RT 试剂(G): G250染色液 100ml

使用说明书

1份

合成酶粗提液，4℃保存待用，分别用于测定和对照。

②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，-4℃保存，用于谷氨酰胺合成酶的测定。

③高活性样品：如果样品中含有较高活性的谷氨酰胺合成酶，可以使用GS Lysis buffer进行恰当的稀释。

2、配制GS Assay Buffer工作液：取适量的GS Assay Buffer和GS启动剂，按GS Assay

Buffer：GS启动剂=的比例混合，即为GS Assay Buffer工作液，4℃保存待用。

3、配制ATP工作液：取1支NADH，恢复至室温，完全溶解于GS Assay Buffer，即得

ATP工作液。4℃预冷备用，-20℃保存1周有效。

4、GS加样：按照下表设置空白管、对照管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意

避免产生气泡。如果样品中的酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置2平行管，求平均值。

加入物(ml) 空白管对照管测定管

蒸馏水2－－

GS Assay Buffer －0.8 －

GS Assay Buffer工作液－－0.8

ATP工作液－0.35 0.35

谷氨酰胺合成酶粗提液－0.35 0.35

37℃保温。

GS显色液－0.5 0.5

5、GS测定：混匀，5000g离心，取上清待测，比色杯光径1.0cm，以空白管调零，以分

光光度计测定540nm处对照管、测定管吸光度(分别记为A测定、A对照)。

6、GS中可溶性蛋白测定：

①配制蛋白标准：取1ml GS Lysis Buffer完全加入到含有20mg的蛋白标准(BSA)中，充分溶解，配制成20mg/ml的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，配制的蛋白标准溶液应-20℃保存。取适量的20mg/ml蛋白标准溶液稀释至终浓度为1000μg/ml，如取50μl 20mg/ml蛋白标准溶液，加入950μl GS Lysis Buffer，充分混匀，即配制成1000μg/ml 蛋白标准溶液，-20℃长期保存。

②配制标准曲线：将1000μg/ml蛋白标准溶液按加至离心管中，对于不足35μl的，加入Recalcitrant提取液补足至35μl。

③G250测定：准确吸取待测谷氨酰胺合成酶粗提液35μl，向各标准管、待测管加入1.715ml G250染色液，室温放置3～5min，分光光度计或酶标仪(分别取200μl加入至96孔板)测定595nm波长处的吸光度，以蛋白标准浓度μg/ml为横坐标、以对应的吸光度为纵坐标，根据标准曲线计算出待测样品中的蛋白浓度。

计算：

GS活力[OD/(mg protein·h)]=(A测定-A对照)/(C×t×V)

式中：A测定=540nm处测定管吸光度

A对照=540nm处对照管吸光度

注意事项：

1、谷氨酰胺合成酶容易失活，提取和测定时均应操作迅速，尽量在4℃操作。

2、显色和比色时间应一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。

3、如果没有分光光度计，也可以使用普通的酶标仪测定，但应注意酶标板每孔最大体积。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：6个月有效。

B内酰胺酶的检测方法

B-内酰胺酶的检测方法牛乳中非法添加β-内酰胺酶检测方法随着国家对食品安全问题的关注和部分乳制品企业2010年无抗奶目标的提出，抗生素残留问题成为影响乳制品安全的重要因素之一。目前，青霉素作为β- 内酰胺类药物是治疗牛乳腺炎的首选药物，是牛奶中最常见的残留抗生素。由于国内多数乳品企业对抗生素残留超标的牛乳采取降价收购的原则，出于经济利益的驱动，一些不法奶站为了谋求自己的经济利益，人为的使用一些生物制剂去降解牛乳中残留的抗生素，生产人造“无抗奶”。2005年至今，已有数家公司公开宣称出售分解牛乳中残留抗生素的解抗剂。迄今为止，还没有针对这种人造“无抗奶”的相应检测方法、检测标准，无法从源头上监测、把控原奶质量。奶制品中三聚氰胺问题出现后，检科院按照国家局科技司的安排，对奶制品中可能的添加物进行了调查。经过前期的调研工作，初步判断市售解抗剂的主要成分是β-内酰胺酶，它是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的，可选择性分解牛奶中残留的β- 内酰胺类抗生素。β-内酰胺酶为我国不允许使用的食品添加剂,该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。β-内酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性，导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力，给消费者的身体健康带来危害。微生物方法和理化方法均利用β-内酰胺酶能够裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸的原理检测乳制品中是否添加解抗剂。一、理化方法（一）高效液相色谱法 1、间接法方法原理：利用β-内酰胺酶能够酶解青霉素的原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定浓度的β-内酰胺酶，那么青霉素经β-内酰胺酶酶解后浓度会减少，从而判断牛奶中是否存在β-内酰胺酶。实验步骤：称取20 g试样，在4℃、16000rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑料离心管，并将塑料离心管置于37℃水浴锅中振荡孵育30 min。向孵育后的离心管中加入无水乙醇15 mL。振荡提取30 min后离心，将上层清液过滤纸后收集于梨形瓶中。减压浓缩蒸发掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸盐缓冲液（pH=8.5），涡旋1 min后调节pH为8.5。以1 mL/min的速度将提取液通过经过预处理的Oasis HLB固相萃取柱，用2 mL磷酸缓冲液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用2 mL水淋洗。最后用3 mL乙腈洗脱。将洗脱液在40℃下氮气吹干，用0.025 M磷酸盐缓冲液（pH=7.0）定容残渣至1 mL,待上机测定。色谱条件：色谱柱Agilent Zorbax SB C18，4.6mm×150mm×5μm；流动相甲醇/0.004 M磷酸二氢钾（pH=4.5）＝40/60；检测波长 268 nm 讨论：该方法只能给出定性结论即牛奶中是否含有β-内酰胺酶，而无法给出确切定量结果即牛奶中含有β-内酰胺酶的量（U/ml）；前处理方法相对复杂、费时。

谷氨酰胺酶

癌症细胞中谷氨酰胺的代谢及其意义摘要：除了加强的有氧糖酵解外，显著增加的谷氨酰胺酵解现在被认为是癌症细胞代谢特征的另一个主要特点，在这篇综述中，我们将介绍谷氨酰胺在肿瘤细胞中的主要代谢途径并阐述谷氨酰胺如何通过为肿瘤细胞提供生物代谢所需的能量和生物合成所需的前体小分子从而维持肿瘤细胞的快速生长和增殖。最后我们重点讨论肿瘤细胞中谷氨酰胺代谢和细胞信号传导通路之间的相互影响及其在肿瘤发生发展过程中的意义。关键词：Warburg 效应谷氨酰胺谷氨酰胺酶mTORC1(mammalian target of rapamycin) 在过去的十年中，癌症细胞的代谢作为治疗干预的靶点吸引了广泛的关注。很多癌症细胞的代谢都表现出Warburg 效应，Warburg 效应是由德国的生物化学家Otto Warburg 于1924 年首次提出，Otto Warburg 发现癌症细胞即使在正常氧分压条件下，其糖酵解代谢也非常活跃并产生大量的乳酸[1]。Warburg 效应是指在肿瘤细胞中葡萄糖摄取增加，乳酸生成增多，细胞三羧酸循环途径产生能量减少，而利用有氧糖酵解为细胞生命活动提供能量。随后科学家们对Warburg 效应进行了深入的研究，并对癌症细胞内代谢方式的改变进行了大量的报道[2]。其中很有趣的一点是，在很多情况下，癌症细胞在表现出Warburg 效应的同时，也对谷氨酰胺有极高的依赖性，以至于我们认为癌症细胞对谷氨酰胺成瘾[3]。谷氨酰胺代谢在肿瘤细胞中的作用及其机制已经成为当前研究的一个热点[4]。 1、谷氨酰胺代谢和谷氨酰胺酶作为血浆中含量最丰富的氨基酸，谷氨酰胺经细胞膜上的载体转运进入细胞后进行分解代谢，在谷氨酰胺酵解过程中，谷氨酰胺进入线粒体后在谷氨酰氨。在人类基因组中有两个基因可以编码谷氨酰胺酶，谷氨酰胺酶1 基因编码肾型谷氨酰胺酶，而谷氨酰胺酶2 基因编码肝型谷氨酰胺酶[5]。肝型谷氨酰胺酶主要在肝脏中表达，而肾型谷氨酰胺酶在多种器官组织中存在表达[6]。肾型谷氨酰胺酶的在各种组织中的广泛表达使得其可能和不同类型的癌症有关。事实上，在来源于胸、肺、子宫颈、脑和B 淋巴细胞等的肿瘤中，肾型谷氨酰胺酶的表达量升高，抑制谷氨酰胺酶的活性可以抑制这些癌症细胞系的增殖[7-10]。肾型谷氨酰胺酶存在着两个转录剪切突变体，这两个突变体只在其C 端区域存在着区别，其中序列较长的称为肾型谷氨酰胺酶(KGA)，而较短的形式则被称为谷氨酰胺酶C(GAC)[11]。KGA 由谷氨酰胺1 的第1-14 和16-19 个外显子剪切而成，而谷氨酰胺酶 1 的第二个剪切突变体谷氨酰胺酶C（GAC）只利用了第1-15 个外显子[12]。GAC 的羧基端和KGA 不一样，并且其蛋白分子量要比KGA小。KGA 和GAC 这两个变异体都含有完整的谷氨酰胺酶结构域。谷氨酰胺酶C可以在很多体外组织培养的癌症细胞系中被检测到[13]。谷氨酰胺酶的这些亚型表现出不同的结构、动力学特征和组织特异性分布特点[14]。谷氨酰胺酶C 在细胞内定位于线粒体内，而KGA 则主要存在于细胞浆中[15]。在非活化的状态下，肾型谷氨酰胺酶和谷氨酰胺酶C 主要以二聚体的形式存在。在体外的实验中，肾型谷氨酰胺酶和谷氨酰胺酶C 都可以被无机磷酸盐活化，而无机磷酸盐的主要作用被认为是促进活化状态的谷氨酰胺酶四聚体的形成[14, 16]。

谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)试剂盒说明书

货号: QS1807 规格：50管/24样谷胺酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）试剂盒说明书可见分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义： GS（EC6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物体内氨同化的关键酶之一，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。测定原理： GS在ATP和Mg2+存在下，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺进一步转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成红色的络合物；该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。自备实验用品及仪器：可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。试剂的组成和配制：提取液：30mL×1瓶，4℃保存。试剂一：10mL×1瓶，-20℃保存。试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存。试剂三：粉剂×2瓶，-20℃保存。用时每瓶加入5mL蒸馏水充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存。试剂四：10mL×1瓶，4℃避光保存。样本测定的准备： 1、细菌、细胞或组织样品的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）样品：直接检测。测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。第1页，共2页

TG谷氨酰胺转胺酶性质及其在肉制品中的应用说明

谷氨酰胺转胺酶性质及其在肉制品中的应用说明一、谷氨酰胺转胺酶（TGase ）介绍谷氨酰胺转胺酶（Transglutaminase ，简称TG 、TGase 、mTG 等），又称转谷氨酰胺酶，是一种酰基转移酶，能够促进蛋白质分子内交联、蛋白质分子间交联以及蛋白质和氨基酸之间的交联。TGase 能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε-（γ-谷酰胺）-赖氨酸的异型肽键，改善蛋白质的功能性质，可以有效地提高蛋白性食品的弹性、持水能力、原料利用率、质地口感及营养价值等，现已广泛应用于肉制品、乳制品、鱼制品、面制品、豆制品等。谷氨酰胺转胺酶广泛存在于自然界中，早期TGase 是从动物肝脏中提取，成本较高，应用受到限制。本公司采用现代生物工程发酵技术，利用微生物法发酵生产并精制提取而成，具有酶活高、催化效率高等特点。1.1TGase 的结构： 1.2TGase 的催化机理 TGase 利用肽链上的谷氨酰胺残基上的甲酰胺基为乙酰基供体，受体可以是蛋白质上的或游离氨基酸上的胺基、伯胺基、水。TGase 既可以催化蛋白分子间的交联，又可以催化分子内的交联反应。TGase 催化的主要反应如下：注： a 酰基转移反应 b 蛋白质Gln 残基和Lys 残基之间的交联反应 c 脱氨基化反应二、谷氨酰胺转胺酶（TGase ）酶学性质 1.最适pH 2.pH 稳定性活性中心

*谷氨酰胺转胺酶在pH 5-8的范围内具有很高的活性，最适pH 为6-7，在一般的食品加工过程中不会发生酶失活问题。*谷氨酰胺转胺酶在pH 值5-8的范围内具有很好的稳定性，当pH 低于5时，酶活迅速降低，当pH 高于8小于9时，酶活下降缓慢。3.最适温度 *谷氨酰胺转胺酶可在5℃-60℃的温度条件下发挥作用，最佳使用温度为50℃，在45℃-55℃范围内均具有较好的活性。 4.温度稳定性 *谷氨酰胺转胺酶在温度低于40℃时保持稳定，50℃以上酶活稍有下降，当温度高于75℃时酶失去活性。 5.反应温度和时间关系 *在温度不高于最适温度50℃情况下，反应时间随反应温度的升高而降低。（不同温度下的反应时间均在pH6.0条件下测定） 6.香肠内部温度和失活时间关系温度（℃) 时间652h 以上7015min 之内755min 之内80 1min 之内 *对直径为3cm 的香肠，酶失活所需要的加热时间，每根香肠达到指定温度用冰水迅速冷却。由上表检测结果可见，酶失活所需要的时间取决于内部中心的温度，内部温度越高，失活也越快。三、谷氨酰胺转胺酶（TGase ）的使用方法掌握正确的TG 使用方法，对于TG 的作用发挥具有重要作用，根据TG 在催化蛋白质反应中的规律及TG 的酶学性质，谷氨酰胺转胺酶的使用方法主要有以下三种：1..溶液法把1份谷氨酰胺转胺酶（TG ）放入3～3.5倍的水中溶解后，将水溶液加到肉中、充分搅拌、装模成型，经过一段时间的酶反应，使肉块粘在一起，本品一旦与水溶解后，必须在20-30分钟内与肉块搅拌并成型。2.和盐水一起加入肉制品能快速吸收盐水，谷氨酰胺转胺酶（TG ）可先放到盐水溶液中，然后一起加入肉制品中，进行浸泡，充分混合，并在20-30分钟内成型。3.涂粉法对于浸泡过的或已加入溶液的肉制品，谷氨酰胺转胺酶（TG ）可以直接以干粉形态加入。加入时，必须搅拌或翻转，使所有肉制品表面涂粉均匀，加入至涂粉成型必须在20-30分钟内完成。四、谷氨酰胺转胺酶（TGase ）的应用举例1.谷氨酰胺转胺酶（TG ）在肉产品中的应用谷氨酰胺转胺酶是一种催化酰醛转移反应的酶，它能够通过形成蛋白质分子间共价键，催化蛋白质分子聚合和交联。TG 以肉制品蛋白质肽链上的谷氨酰胺残基中的甲肽氨基为供体，赖氨酸残基中的氨基为受体，催化转氨基反应，从而使蛋白质分子内或分子间发生交联。 TG 具有pH 稳定性好，热稳定性高，粘合性极强等特性，形成的共价键在非酶催化条件下（如冷冻、切片、烹饪）很难断裂，使用安全。

实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定

实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定一、硝酸还原酶的测定[原理]: 硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(或对-氨基苯磺酰胺)及α-萘胺(或萘基乙烯胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即以-1-1ug.g.h为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 [试剂] 1(亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO0.9857g溶于去离子水后定容至1 2-1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml的标准液; 2(0.1molpH7.5的磷酸缓冲液:NaHPO.12HO30.0905g与NaHPO.2HO 242242 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml; -13(1%(W/V)溶液:1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.LHCL中(25ml浓-1盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.LHCL); (0.02%(W/V)萘基乙烯胺溶液:0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，4 贮于棕色瓶中; -1-15(0.1mol.LKNO溶液:2.5275g KNO溶于250Ml 0.1mol.LPh7.5的磷酸缓冲33 液中; -16(0.025mol.LPh 8.7 的磷酸缓冲液:8.864 0g NaHPO12HO，0.0570g 24.2

植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定

实验27 植物体内GS 谷氨酰胺合成酶活力的测定【原理】谷氨酰胺合成酶（GS ）是植物体内氨同化的关键酶之一，在A TP 和Mg 2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol ·mg ﹣1protein ·h ﹣1。也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1。【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml 、1ml ）。【试剂】提取缓冲液： 0.05mol/L Tris-HCl ，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT ，0.4mol/L 蔗糖。称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.5295g ，0.1245g MgSO 4·7H 2O ，0.1543g DTT （二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml ；反应混合液A （0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2mmol/L EGTA ，称取 3.0590g Tris ，4.9795 gMgSO 4·7H 2O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA ，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml ；反应混合液B （含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A 的成分再加入80mol/L 盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3和0.6mol/L HCl 混合液）： 3.3176g TCA （三氯乙酸），10.1021g FeCl 3·6H 2O ，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml ； 40mmol/L A TP 溶液：0.1210g A TP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。【方法】 1.粗酶液提取称取植物材料1g 于研钵中，加3ml 提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g 离心20min ，上清液即为粗酶液。 2.反应 1.6ml 反应混合液B ，加入0.7ml 粗酶液和0.7ml A TP 溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml ，摇匀并放置片刻后，于5,000g 下离心10min ，取上清液测定540nm 处的吸光值，以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。 3.粗酶液中可溶性蛋白质测定取粗酶液0.5ml ，用水定容至100ml ，取2ml 用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质（见实验28）。 4.原始数据记载 5.结果计算： GS 活力(A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1)＝t V P A ?? 式中 A —540nm 处的吸光值； P —粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml ）； V —反应体系中加入的粗酶液体积（ml ）； T —反应时间（h ）。

转谷氨酰胺酶

人转谷氨酰胺酶2C多肽（TGM2）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供体外研究使用! 预期应用 ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中TGM2含量。实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗TGM2抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗TGM2抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的TGM2呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制 1.酶联板：一块（96孔） 2.标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10ng/ml，做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释）后，分别稀释成10ng/ml，5ng/ml，2.5ng/ml，1.25ng/ml，0.625ng/ml，0.312 ng/ml，0.156ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0ng/ml，临用前15分钟内配制。如配制5ng/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）10ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3.样品稀释液：1×20ml。 4.检测稀释液A：1×10ml。 5.检测稀释液B：1×10ml。 6.检测溶液A：1×120μl（1:100）临用前以检测稀释液A1:100稀释，稀释前根据预先计算

好的每次实验所需的总量配制（100μl/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 7.检测溶液B：1×120μl/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。 8.底物溶液：1×10ml/瓶。 9.浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10.终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 11.覆膜：5张 12.使用说明书：1份自备物品 1.酶标仪（建议参考仪器使用说明提前预热） 2.微量加液器及吸头，EP管 3.蒸馏水或去离子水，全新滤纸标本的采集及保存 1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C1000x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 3.其它生物标本：请1000x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 4.样本处理：血清或血浆标本推荐稀释10倍，如：稀释10倍，取100uL血清或血浆加入900uL 样品稀释液。标本使用0.1M的PBS稀释（PH=7.0-7.2）。注：以上标本置4℃保存应小于1周，-20℃或-80℃均应密封保存，-20℃不应超过1个月，-80℃不应超过2个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

β-内酰胺酶及其活力测定法

β-内酰胺酶及其活力测定法培养基胨15g甘油50g氯化钠4g0.1％硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶液0.5ml枸橼酸钠5.88g20％硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶液1ml磷酸氢二钾4g肉浸液1000ml 混合上述成分，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，分装于500ml锥形瓶内,每瓶80ml,在115℃灭菌30分钟。酶溶液的制备取蜡样芽孢杆菌［Bacillus cereus CMCC(B)63301］的斜面培养物,接种至上述一瓶培养基内,在25℃摇床培养18小时后，取此培养物接种至其余各瓶培养基内，每瓶接种10ml，同时每瓶加入无菌青霉素4500单位，在25℃摇床培养24小时，再加无菌青霉素2万单位，继续培养24小时，再加无菌青霉素2万单位,继续培养24小时,离心沉淀菌体，调pH值至约8.5,用滤柱滤过除菌，滤液用无菌操作调pH值至近中性后，分装于适宜容器内，在10℃以下贮存，备用。酶活力测定法青霉素溶液称取青霉素钠（钾）适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。青霉素酶稀释液取青霉素酶溶液，按估计单位用磷酸盐缓冲液(pH7.0) 稀释成每1ml中约含青霉素酶8000～12 000单位的溶液，在37℃预热。测定法精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中，预热至37℃后，精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml，迅速混匀，在37℃准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.01mol/L)［精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度］25ml中,在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L) 滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。空白试验取已预热的青霉素溶液2ml，在37℃放置1小时，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加青霉素酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。按下式计算： E＝(B－A)×M×F×D×100 式中 E为青霉素酶活力，（单位／ml）／小时； B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml； A为样品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml； M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L； F为在相同条件下，每1ml的上述碘滴定液(0.01mol/L)相当于青霉素的单位数； D为青霉素酶溶液的稀释倍数。［附注］磷酸盐缓冲液(pH7.0) 取磷酸氢二钾7.36g与磷酸二氢钾3.14g,加水使成1000ml。醋酸钠缓冲液(pH4.5) 取冰醋酸13.86ml,加水使成250ml;另取结晶醋酸钠27.30g,加水使成200ml，两液混合均匀

谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS)活性测定试剂盒使用说明

谷氨酰胺酶(glutaminase,GLS)活性测定试剂盒使用说明产品简介： GLS存在于高等动物和某些细菌以及植物根中，催化谷氨酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代谢中具有重要调控作用，尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，利用奈氏试剂检测氨增加的速率，即可计算其酶活性。试验中所需的仪器和试剂：台式离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。产品内容：试剂一×1瓶，60mL，4℃保存；试剂二×1瓶，50mL，4℃保存；试剂三×1瓶，60mL，常温保存；试剂四×1瓶，12mL，常温保存；试剂五×1瓶，6mL，常温保存；试剂六×1瓶，6mL，常温避光保存。操作步骤：一、粗酶液提取：称取约0.1g组织，加入0.9ml试剂一研钵中研磨均匀，于48000rpm℃离心10min，取上清，作为待测液（粗酶液）。

二、测定步骤： 1、空白管：（1）蒸馏水0.05mL，加试剂一0.2mL，加试剂二0.8mL，混匀后37℃水浴1h；（2）加入试剂三1.05mL，混匀后8000rpm离心10min；取上清液1.0mL到新离心管中，加入试剂四0.23mL，混匀；（3）取0.8mL到新离心管中，依次加入试剂五0.1mL和试剂六0.1mL，混匀后等待10min，即可用于调零。 2、样品管：仅需要把蒸馏水0.05mL换成粗酶液0.05mL即可，其余同空白管。 3、实际测定只要做一个空白管，用于调零，于420nm处比色，记录吸光值，记为A。 GLS活性计算： 1、酶活性单位定义：37℃下每mg蛋白质每小时催化谷氨酰胺生成1μmol氨。 2、计算公式： GAA（U/mg prot）＝363.1×(A－0.1301)÷蛋白质浓度（mg/mL）。

谷氨酰胺合成酶活性的测定

谷氨酰胺合成酶活性的测定一．试剂（1）酶提取缓冲液（0.05mol/L Tris- HCl，pH 8.0；内含2mmol/L Mg2+、2mmol/L DTT、0.4mol/L蔗糖）称取 Tris[三（羟甲基）氨基甲烷]1.5295 g，MgSO4·7H2O 0.1245g，DTT（二硫苏糖醇）0.1543 g和蔗糖34.23 g，去离子水溶解后，用0.5~1.0 mol/L HCl调至pH 8.0，最后定容至250 mL。（2）酶反应液 1.对照反应液A（0.1mol/L Tris- HCl缓冲液，pH 7.4；内含80mmol/L Mg2+、20mmol/L谷氨酸钠盐、20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EDTA-Na2）称取1.2236 g Tris、1.9918 g MgSO4·7H2O、0.3451 g谷氨酸钠盐、0.2422 g半胱氨酸、0.0744 g EDTA-Na2，分别用去离子水浴解后，用0.5~1.0mol/L HCl调至pH 7.4，定容至100mL。 2.完全反应液B（含盐酸羟胺、pH 7.4的0.1mol/L Tris- HCl缓冲液）除了反应混合液A的成分外，再添加80mmol/L盐酸羟胺（每100 mL 中含0.5560 g盐酸羟胺）。（3）显色剂（0.2mol/L TCA、0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）称取3.3176 g TCA（三氯乙酸）和10.1021 g FeCl3·6H20，用去离子水溶解后，加5mL浓盐酸，定容至100mL。（4）40mmol/L ATP溶液

称取0.2420 g ATP溶于10 mL去离子水中（临用前配制）。二．实验步骤（1）粗酶液的提取取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加5mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,12000g离心20min,上清液即为粗酶提取液（2）GS活性的测定取1.0mL完全反应液B于10mL离心管中，加入0.5mL粗酶液和0.5mL ATP溶液，混匀，于37℃下保温0.5 h，加入1mL显色剂终止反应，摇匀，室温下放置5min后，于3500r/min下离心10min，取上清液于540nm下测定吸光度，以加入1.0mL对照反应液A的为对照。三．结果处理及计算 GS活性[A540/(g·h）]= A540为540nm处的吸光度； m 为样品质量（g）； Vt为粗酶液总体积（mL）； Vs为反应体系中加入的粗酶液体积（mL）； t 为反应时间（h）。

转谷氨酰胺酶在肉制品中的应用研究

转谷氨酰胺酶在肉制品中的应用研究转谷氨酰胺酶学名谷氨酰胺转胺酶，是一种非常优良的蛋白质改良剂，能够催化蛋白质分子内、分子间连接交联，蛋白质和氨基酸之间的连接以蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解，同时改善蛋白质的功能和性质。我国肉类总产量位居全球第一，但肉制品量只占总量的6%，从发达国家的肉制品量占据肉类总产量的40%～50%来看，说明我国在肉类加工领域肉还有很大潜力，转谷氨酰胺酶作为一种优良的肉制品加工改良剂，在肉制品方面有巨大的应用潜力。谷氨酰胺转转谷氨酰胺酶广泛分布于自然界的生物中，转谷氨酰胺酶在豚鼠肝脏中被卡拉克人等首次发现，经过不断的研究发现微生物、植物和其他动物中也存在转谷氨酰胺酶。动物来源哺乳动物几乎所有的组织和器官中都存在转谷氨酰胺酶。20世纪60年代到90年代，从豚鼠肝脏中提取转谷氨酰胺酶，由于来源较少，并且纯化工艺复杂，这两方面导致价格昂贵。植物来源1987年，艾斯卡森等人发现转谷氨酰胺酶存在于豌豆中。研究者已经发现在马铃薯、菊芋、玉米等多种植物中也有转谷氨酰胺酶的存在。有研究者对大豆中提取的转谷氨酰胺酶进行深入研究，但是发现分离和纯化工艺非常复杂，酶得率也相对较低。所以迄今为止，植物来源的转谷氨酰胺酶还没有用于商业化生产。微生物来源1989年，安腾等人首次从茂原链轮丝细菌中首次分离并且纯化得到了转谷氨酰胺酶。随后，研究人员在其他微生物中发现了转谷氨酰胺酶存在，并进行大量的微生物发酵试验、酶纯化分离试验等，取得了很大的进步。与动物来源转谷氨酰胺酶相比，微生物来源转谷氨酰胺酶属于胞外酶，它能够在培养基中直接分泌，分离和纯化相对比较容易，发酵所用的原料价格较低、生产周期短，最有前途用于大规模的工业化生产。转谷氨酰胺酶的理化性质不同来源的转谷氨酰胺酶其理化性质差异动物肝脏的转谷氨酰胺酶的分子量大约在70～90kDa之间，需要通过钙的离子激活来实现其功能性，酶的活性中心为半胱胺酸铵残基位点。动物来源转谷氨酰胺酶中，豚鼠肝脏的转谷氨酰胺酶研究最为深入，研究发现酶分子量大约为90KDa，使酶反应需要钙离子去激活，底物特异性较强，同时该酶含有多个半胱氨酸残基导致其热稳定性较差，50℃保持10min其酶活性仅为残留的40%。与动物的来源相比，微生物来源的转谷氨酰胺酶具有更加优良的特性：一是具有较低的分子量，分子量在23000～45000，多数为40000左右，高度的交联催化度；二是具有更强的耐热性，来源于S．mobaraensis的转谷氨酰胺酶在40℃条件下，即使保持10min，酶仍然具有相同的活性，即使在50℃的条件下，保持10min该酶仍具有74%的活性；三是耐酸耐碱性强；四是是否存在钙离子对酶的活性影响不大，这一特性非常重要，因为绝大多数的蛋白质容易与钙离子发生化学反应，导致蛋白质沉淀；五是转谷氨酰胺酶耐高温高压，周围

乳糖诱导大肠杆菌中重组谷氨酰胺合成酶的表达

乳糖诱导大肠杆菌中重组谷氨酰胺合成酶的表达刘俊红1,2,刘顺谊2,殷志敏2 (1.安徽师范大学生命科学学院,安徽芜湖241000) (2.南京师范大学生命科学学院,江苏南京210097) [摘要]　以重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶(L 2谷氨酸:氨连接酶,Glutam ine Synthetase,GS EC 6131112)蛋白表达宿主菌株BL21(DE3)(pET3C /谷氨酰胺合成酶)作为研究对象,借助S DS 2P AGE 分析方法,对于用乳糖诱导由T7lac 启动子控制的重组目的产物蛋白的表达规律进行了优化研究,分别比较了最佳诱导起始生长量、所需乳糖的浓度、诱导持续时间、补加乳糖和氨苄青霉素及不同培养基等参数对重组产物表达的影响.实验结果表明,对于T7lac 启动子控制的重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到很好的诱导表达效果,诱导产物的表达量、可溶性及酶活与I PTG 诱导产物基本接近.本研究结果为乳糖作为诱导剂应用于重组大肠杆菌谷氨酰胺合成酶工业化生产提供了一定的参考依据. [关键词]　谷氨酰胺合成酶,原核表达,乳糖,I PTG [中图分类号]Q 78　[文献标识码]A [文章编号]100124616(2006)0320066205 Expressi on of Reco m b i n an t Glut am i n e Syn thet a se i n Escherich ia coli I nduced by Lactose L i u J unho ng 1,2,L i u S hunyi 2,Yi n Zh i m in 2 (1.College of L ife Science,Anhui Nor mal University,W uhu 241000,China ) (2.School of L ife Science,Nanjing Nor mal University,Nanjing 210097,China ) Abstract:L 2Glutam ine is mainly p r oduced by fer mentati on,rarely by enzy me reacti on .Gluta m ine Syn 2 thetase gene is a mp lified fr om Bacillus Subtilis gnd cl oned int o p r okaryotic exp ressi on vect or pET3C .Af 2 ter the transf or mati on of this recombinant p las m id int o BL -21(DE3),Lact ose and I PTG (is op r opyl 2 β2D 2thi ogalact o 2pyranoside is op r opylthi o 2β2D 2galact oside )are used t o induce gene exp ressi on at 37℃re 2 s pectively .Both of the m can induce the exp ressi on of the Gluta m ine Synthetase gene efficiently .The in 2 fluences of culture conditi on such as the lact ose concentrati on,gr owth mediu m compositi on,the durati on of the inducti on and the re -additi on of lact ose on the exp ressi on of the recombinant p r otein are analyzed in detail .The inducti on efficiency of lact ose is basically the sa me as that of I PTG,which p r ovides the evi 2 dence that lact ose could be a p r om ising inducer in the future large scale p r oducti on of recombined Gluta 2 m ine Synthetase . Key words:Gluta m ine Synthetase,p r okaryotic exp ressi on,lact ose,I PTG 　收稿日期:2005211228. 基金项目:国家教委留学回国人员基金(2002S WXS BJBC22)、南京师范大学人才基金(2001S WXXG QB914)资助项目. 作者简介:刘俊红,女,1970—,博士研究生,讲师,主要从事细胞生物学的学习与研究.E 2mail:liujunhong700911@yahoo https://www.360docs.net/doc/cf5876127.html, 通讯联系人:殷志敏,1963—,教授,博士生导师,主要从事生物化学及细胞生物学的教学与研究.E 2mail:yinzhi m in@njnu .edu .cn 0　引言 L 2谷氨酰胺是一种对人体十分有益的氨基酸衍生物,它在氨基酸代谢中具有极其重要的地位,已广泛应用于营养补给、抗疲劳、胃肠道功能修复和提高人体免疫等方面,其市场需求量日渐增长. 目前国内外主要以发酵法生产L 2谷氨酰胺.近年来,酶法合成L 2谷氨酰胺已开始有少量研究[1,2],在第29卷第3期2006年9月南京师大学报(自然科学版)JOURNAL OF NANJ I N G NOR MAL UN I V ERSI TY (Natural Science ) Vol .29No .3Sep,2006

谷氨酸合成酶(Glutamate synthase,GOGAT)试剂盒说明书

货号：MS1801 规格：100管/96样谷氨酸合成酶（Glutamate synthase，GOGAT）试剂盒说明书微量法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义： GOGAT广泛分布于植物中，和谷氨酰胺合成酶共同构成GS/GOGAT循环，参与氨同化的调控。测定原理： GOGAT催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸；同时NADH氧化生成NAD+，340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。自备实验用品及仪器：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。试剂组成和配制：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存；粗酶液提取：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。测定步骤： 1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（1）在试剂二中加入9mL试剂一充分溶解混匀，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；现配现用（配好后3h内用完）；（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL样本和180μL试剂二，混匀，立即记录340nm 处20s时的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。 GOGAT活性计算： a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下（1）按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 GOGAT（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算：单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。第1页，共2页

β-内酰胺酶的检测方法

外源性β-内酰胺酶是我国不允许在食品中使用的化学物质。违法使用的目的，是为了掩盖违规使用大环内脂类等抗生素治疗奶牛疾病的行为。但是，内源性β-内酰胺酶的产生机理也是科学研究基本确认的事实。近几十年来，国际国内畜牧业养殖奶牛过程中无限制使用大环内脂类抗生素治疗动物、家禽等食用动物各种炎症、败血症、水肿病等病症，造成革兰氏阳性细菌对抗生素耐药，细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性一般通过4种途径。（1）产生β-内酰胺酶使β-内酰胺类抗生素开环失活，这是产生耐药的主要原因。目前发现的β-内酰胺酶已超过300种，它通过与β-内酰胺环上的羰基共价结合，水解酰胺键从而使β-内酰胺类抗生素开环而失活。（2）改变抗生素与青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）的亲和力。当β-内酰胺类抗生素与PBP结合后，PBP就会失去酶活性，使细菌细胞壁的形成部位破损而引起溶菌，反之，则成为耐药菌。PBP基因的变异，使β-内酰胺类抗生素无法与之结合或结合能力降低，这是形成耐药的根本原因。（3）细胞膜和细胞壁的结构发生改变，使药物难以进入细菌内。如生物膜的形成。（4）细菌体内的能力依赖性主动转运机制，将已进入细菌内的抗生素泵出体外，也可导致耐药性。由于细菌耐药产生的内源性β-内酰胺酶有300多种，同外源性β-内酰胺酶的分别鉴定检测技术尚未见报道。而目前各检测机构正在研究的乳制品中β-内酰胺酶的检测方法无论是化学仪器分析高效液相色谱法还是微生物法，其检测原理都是：测出的β-内酰胺酶无法判定是人为添加的或是耐药细菌产生的。奶制品中检出的β-内酰胺酶有可能是非法添加的，也有可能是细菌产生的。耐药性产生的机理很复杂，细菌耐药基因的转移、共生菌协同以及基因交叉耐受，等影响都要考虑。另外，根据现有的国际食源性抗生素耐药微生物的风险管理原则，建议加强畜牧业奶业生产全过程，而终产品的β-内酰胺酶检测始终是一个辅助手段，凭检测结果很难处理。化学家们要尽快建立内源性和外源性β-内酰胺酶的分离鉴定技术，当然这种技术要求是非常高的 1.常规方法(1).微生物法：[原理] 以一种对青霉素高度敏感的细菌-枯草芽孢杆菌作为指示剂，试验时如果被测细菌株产生青霉素酶，破坏了青霉素，则此高度敏感菌株即可生长，否则，指示剂则被抑制。[方法] 以枯草芽孢杆菌为指示菌，用棉拭子将枯草芽孢杆菌接种于琼脂培养基上，或倾注方法将枯草芽孢杆菌混于琼脂平板内。然后将被测菌与产青霉素酶阳性及阴性对照菌株，按下图接种划线，在琼脂培养基中央放置一含青霉素G（1单位）纸片。放置35℃培养24小时后观察结果。[结果判断] 如被检菌产生青霉素酶，则沿着被测菌处的枯草芽孢杆菌抑菌环出现凹痕(2).碘量法[3] [原理] β-内酰胺酶能裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸，它与淀粉竞争游离碘，破坏了碘和淀粉的兰色复合物，使兰色变为无色。[方法] ①将0.25克青霉素溶于41.7mlPH6.0的磷酸盐缓冲液中，使其浓度成6000ug/ml。取0.1ml

谷氨酰胺合成酶活性测定

谷氨酰胺合成酶活性测定原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和M g 2+ 存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ—谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ—谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg －1 protein·h －1 。也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A·mg －1 protein·h －1 。【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2 ml、1ml）。【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT，0.4 mol/L 蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO 4 ·7 H 2 O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml；反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2 mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO 4 ·7H 2 O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0. 1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A 的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl 混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl 3 ·6H 2 O，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml；40mmol/L ATP 溶液：0.1210g ATP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。【方法】1.粗酶液提取称取植物材料1g 于研钵中，加3ml 提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g 离心20min，上清液即为粗酶液。2.反应 1.6ml 反应混合液B，加入0.7ml 粗酶液和0.7ml ATP 溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后，于5,000g 下离心10min，取上清液测定540nm 处的吸光值，以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。3.粗酶液中可溶性蛋白质测定取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取2ml 用考马斯亮蓝G-250 测定可溶性蛋白质（见实验28）。 4.原始数据记载 5.结果计算：GS 活力(A·mg －1 protein·h －1 )＝式中A—540nm 处的吸光值；P—粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）；V—反应体系中加入的粗酶液体积（ml）；T—反应时间（h）。