基因和蛋白不一致的分析
这是我最近实验遇到的问题，拿出来请教一下各位
我的目的基因经real-time pcr 验证，在病灶区和非病灶区中，20多对样本，两两对照，最低的表达差异也要高出10倍。
但是我用western和组化研究蛋白时，发现表达几乎无差异。我在考虑可能是什么可能使得目的基因在mrna水平上变化如此之大（我认为这变化应该和我研究的疾病有关，可能是疾病的因，也可能是果，不然不会在疾病中表达差异这么明显这么一致，不知各位同意否），以便设计我下面的实验。
我想出来的可能性：
1、可能我的目的基因位于基因组拷贝数变化的一个区域内，可能是它相邻的基因在疾病中发挥了作用，但是我用real-time做过它相邻的基因，没有变化，因此我基本否认了这个猜测。
2、也可能是另一种蛋白高表达引起了这个疾病，而这个蛋白可能同时又调控我研究的目的基因的表达，不知这样的猜测应该如何设计实验进行验证比较好？
因为才疏学浅，只想到了这两种可能性，因为请问还有没有其他的可能性呢？望版上各位不吝赐教。
首先建议验证qPCR assay的重复性和可靠性。
2. 有无在mRNA水平由于alternative splicing而引起的两者水平不一致？
关于这个问题，要分开两步来分析。
第一，在mRNA水平，你用不同的样本、多次qPCR均有10倍以上的差异，相信你的结果是非常肯定的，这一结果不用怀疑；
第二，在蛋白质检测水平，你用免疫组化与western blot均证实该抗体的信号没有明显差异，个人觉得这个结果也应该比较肯定的；
但是，两者的不一致导致你的怀疑，难以解释。从mRNA到蛋白一般来说很少出现这样的差异，至于alternative splicing的可能，你可以认真检索一下该基因是否存在splicing而产生的多个transcriptor，而你的引物又刚好引起了这种差异。因为现在的引物设计软件是比较严谨的，这种原因可以分析出来。由于这个基因不是新的，所以很多信息都可以查到，这个问题很容易解决。
到于蛋白质的检测要受到抗体特异性的限制，你所使用的抗体是否是国际公认的大公司所生产的，有没有其它文章已经使用过并且证明特异性很好；能否找一个该基因明显变化的细胞模型，然后用qPCR与western检验一下该基因的变化。
还有一种非常低级、概率非常低的可能，就是你所买的抗体根本就不是你所需要的抗体，而是其它没有变化的蛋白的抗体，甚至是actin这类的内参，所以上面提到的用细胞模型来验证抗体的特异性也是一个原因。
根据你的描述，我觉得基因表达和蛋白表达的结果都没有问题。因为对于基因水平，多次重复后，两者都相差10倍以上，而蛋白水平你又是通过WB（定量）和IHC（半定量）2种不同的检测方法后得到的一致的结果，因此毋庸怀疑。当然，如果你还在怀疑蛋白水平的话，建议你可以再试试采用放射免疫分析法或者elisa方法对蛋白水平进行定量分析，如果结果还是没有改变的话，那就完全证明蛋白的确没有变化。
我们都希望实验出现阳性的结果，这样在写文章的时候就可以大写特写，否则，就无话可说，甚至认为这实验白做了，更有甚者，出现捏造或者篡改实验数据，人为地把实验结果改为阳性。其实，这种做法后果很严重，应该杜绝。
首先，我有几个问题想自问一下：
1、为什么一定要基因表达和蛋白表达都要有差异呢？
2、为什么不可以基因表达有差异，而蛋白表达无差异呢？
3、为什么不可以基因表达无差异，而蛋白表达有差异呢？
4、为什么不可以基因表达和蛋白表达都无差异呢？
带着这几个问题，我个人觉得：
1、如果基因表达和蛋白表达都没有差异，可能说明在这种实验处理条件下，这个基因在转录水平和翻译水平上都不存在调节。还有另外一种情况是，可能和你处理的时间、剂量/程度以及采样的时间段有关。如果是后几种可能的话，那么你就要分别检测在不同处理时间、不同的剂量/程度及不同的采样时间段，来检测你样品中基因和蛋白的表达水平，最后才能定论了。
2、如果基因表达和蛋白表达都有差异，很简单，这种结果是我们预期想要的，此时就可大写特写该基因的生理功能和调节作用了。
3、如果基因表达无差异，而蛋白表达有差异。乍一看，有点矛盾，其实不然，对于这样的结果，我们可以解释为，在这种实验处理条件下，这个基因在翻译水平上存在调节，并且这个蛋白对这种病理性症状可能具有一定的调节功能，因为该基因蛋白表达有差异嘛。
4、如果基因表达有差异，而蛋白表达无差异。对于这一结果，也就是楼主所反映的实验现象，乍一看，有点矛盾，而且也不好解释。仔细一想，其实不然，对于这样的结果，我们首先可以初步判断，在这种实验处理条件下，这个基因在转录水平存在调节，但是在翻译水平上不存在调节。为什么会只在转录水平存在调节呢？对于这个问题的解答，实际上就是回答在这种实验处理条件下，这个基因的转录调控了，也就是寻找这个基因的上游，存在哪些基因或者转录因子，参与了这个基因转录活性的调节。这个问题的解决有点难哦~，涉及到分子生物学的很多知识。
1、如果这个基因比较经典，序列已经有了，并且已经大概知道了受哪些基因的调控，那么可以先将这个基因的调控区序列从基因银行里调出来，然后进行序列比对，找到这个基因的整个调控区有哪些关键基因的结合位点。
2、找到结合位点后，然后要对这个基因进行克隆，将一些重要的结合位点截去，或者用错乱序列取代（即突变），然后进行质粒构建，重组，并将之连接到带有荧光报告基因的载体上。
3、接下来进行细胞转染，并检测报告基因荧光素酶的活性，根据荧光素酶活性水平的差异，确定上游的哪些关键基因参与了在你的实验条件下，目的基因转录活性的调控。
4、根据上述结果，你可以进一步采用敲除关键基因或者目的基因的手段，或者采用转基因动物，在体上进一步研究这些关键的调节基因或目的基因的生物学功能，如果实验结果是你想要得到的话，那么一切就OK了。
当然，这些证明实验有点难度，但是，只要能够做出来，应该是一篇很好的文章了，可以说，投5以上的杂志应该问题很小了。
我觉得会不会还有以下的可能性：
1、该蛋白质mRNA升高以后蛋白质也确实表达上调了，但是该蛋白的定位却有了变化，分泌出细胞了？
2、虽然mRNA升高了（这说明转录步骤是上调的），但是另外还有控制该基因翻译的负调控因素被激活，这是很正常的，蛋白质的表达本身就是多步骤调控的结果，而且功能越重要的蛋白质其调控也就越复杂
先天性白内障大鼠晶状体蛋白基因突变的筛查与鉴定
先天性白内障大鼠晶状体蛋白基因突变的筛查与鉴定
第一篇范文
先天性白内障大鼠晶状体蛋白基因突变的筛查与鉴定
先天性白内障，作为全球儿童最常见的遗传性眼病之一，严重威胁着儿童的视力健康。大鼠作为研究人类疾病的经典模型动物，对于研究先天性白内障具有重要的科学研究价值。本文将对先天性白内障大鼠晶状体蛋白基因突变进行筛查与鉴定，以期为该疾病的机理研究和基因治疗提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
本研究选用先天性白内障模型大鼠，通过遗传学方法获得。实验组与对照组大鼠在相同条件下饲养，保证实验的科学性和可靠性。
1.2 基因突变筛查
采用高通量测序技术对先天性白内障大鼠晶状体蛋白基因进行全外显子测序，结合生物信息学方法分析基因突变类型、频率和影响。
1.3 基因功能验证
2. 结果与分析
2.1 基因突变筛查结果
高通量测序结果显示，先天性白内障大鼠晶状体蛋白基因存在多个突变位点，其中包括错义突变、无义突变和剪接突变等。这些突变位点可能影响晶状体蛋白的结构和功能，进而导致白内障的发生。
2.2 基因功能验证结果
3. 结论
本文通过对先天性白内障大鼠晶状体蛋白基因突变的筛查与鉴定，为进一步研究该疾病的分子机理和开发新的基因治疗策略提供了重要的理论依据。同时，也为临床诊断和预防先天性白内障提供了潜在的分子标记。
第二篇范文
从生态医学角度看先天性白内障大鼠晶状体蛋白基因突变的筛查与鉴定
当我们从生态医学的角度审视先天性白内障大鼠晶状体蛋白基因突变时，我们会发现，这不仅仅是一个医学问题，更是一个生态系统与生物进化的问题。
先天性白内障大鼠模型，为我们提供了一个观察基因突变如何在生物种群中产生和传播的窗口。通过这个模型，我们可以了解到，基因突变并非是随机发生的，而是在特定的环境压力下，生物进化的一种应答。
晶状体蛋白基因的突变，可能看起来是一个小小的变化，但它在生态系统中可能引发一系列的连锁反应。这不仅仅影响到大鼠的视力，还可能影响到它们的生存能力和繁殖能力，进而影响到整个生态系统的平衡。
蛋白质序列比较中的图形表示及其相似性分析
摘要
摘要
蛋白质结构预测是生物信息学中的重要课题，而蛋白质序列是蛋白质结构预测的基础。由此蛋自质序列的比较分析就显得尤为重要。我们在这里主要探讨的就是蛋白质序列比较中的图形表示方法和在此基础上的相似性分析方法。本文总结了蛋白质序列比较的一些已有方法和算法后，就其中的蛋白质序列的图形表示进行了详细研究，给出了３维和６维这两种图形表示方法，一种方法具有直观的优点，另一种方法具有完备描述序列特征的长处。接着，在６维图形表示的基础上，
做出其相似性分析，给出某个蛋白质序列的各种距离矩阵，并就Ｌ／Ｌ矩阵给出它的最
大特征值和信息熵这两个量，由于６维图形表示有三种不同形式，所以每一个蛋白质序列的最大特征值和信息熵都是一个三维向量，然后就这些向量来进行序列间的比。较。得出的比较结果与已有的结果很相似。最后就相似性补充了两个蛋白质序列间最长公共子序列问题。这种图形表示方法及其相似性分析对于蛋白质序列的比较是一种新的推动力。
关键词：序列比较，图形表示，相似性分析，最长公共子序列————查堡墨三茎兰堡圭兰焦堡塞
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｔｈｅｓｔｍｃｔ＇ＬＥｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｓｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｐｒｏｂｌｅｍｏｆｂｉｏｌｏｇｙｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．Ａｎｄｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｉｓｔｈｅｂａｓｅｏｆｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｏｔｈｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅａｒｅｐｒｏｖｉｄｅｄｗｉｔｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．２Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｇｒａｐｈｉｃａｌｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｉｍｉｌａｒｉｔｙａｒｅｔｈｅｌｅａｄｉｎｇｓｔｕｄｙｏｂｊｅｃｔｓｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．ＴｈｉｓｐａｐｅｒＳｕＩＴＩＳｕｐｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓａｎｄａｌｇｏｒｉｔｈｍｓｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．Ｔｈｅｎ３Ｄａｎｄ６Ｉ）ｇｒａｐｈｉｃａｊｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｐｒｅｓｅｎｔｅｄ．Ｔｈｅｆｏｒｍｅｒ
生物学研究中的基因组学方法
生物学研究中的基因组学方法
基因组学是生物学领域中研究基因组的一门学科，通过研究生物体内的基因组信息来揭示生物体结构和功能的规律。随着科技的不断发展，基因组学方法也不断更新。本文将介绍几种常用的基因组学研究方法。
一、基因组测序
基因组测序是基因组学研究的核心方法之一。它通过分析生物体内的DNA序列来获取基因组信息。目前常用的测序方法有Sanger测序（链终止法）和高通量测序（下一代测序）。Sanger测序是一种传统的测序方法，其优点是准确性高，缺点是测序速度慢且成本高。高通量测序则可以同时测序大量的DNA分子，并具有高通量、高精度和低成本的优势。
二、基因组组装
基因组组装是基因组学研究中的一个重要步骤，它将测得的DNA序列片段进行拼接，重新构建出完整的基因组序列。基因组组装的难点在于大量的DNA序列片段之间存在交叉、重叠等问题，需要借助计算机算法进行拼接。目前常用的组装软件有SOAPdenovo、Velvet、SPAdes等。
三、基因注释
基因注释是对基因组序列进行功能分析和解读的过程。它通过比对已知的基因库、蛋白质库和功能数据库，根据序列的相似性和保守性等特征来预测基因的功能。基因注释可以帮助研究人员理解基因的功能和作用，从而进一步研究其在生物体内的生理过程和疾病发生发展中的作用。
四、转录组学
转录组学是研究生物体基因表达的一门学科。通过分析生物体中mRNA的表达水平和转录变异，可以了解基因在不同组织、不同发育阶段和不同环境条件下的表达情况。转录组学研究方法主要包括RNA测序和基因表达谱分析等。RNA测序可以全面地检测和定量所有转录本，而基因表达谱分析则可以帮助研究人员挖掘潜在的调控关系和功能分析。
五、蛋白质组学
蛋白质组学是研究生物体内蛋白质组成和功能的一门学科。通过对生物体蛋白质的组成、结构和功能进行研究，可以揭示生物体内的调控网络和信号传导途径。蛋白质组学研究方法主要包括质谱技术和蛋白质互作网络分析等。质谱技术可以用于鉴定和定量蛋白质，而蛋白质互作网络分析可以帮助研究人员理解蛋白质间相互作用和调控关系。
浅析功能基因组学和蛋白质组学的概念及应用
浅析功能基因组学和蛋白质组学的概念及应用
【摘 要】 基因组相对较稳定，而且各种细胞或生物体的基因组结构有许多基本相似的特征；蛋白质组是动态的，随内外界刺激而变化。对蛋白质组的研究可以使我们更容易接近对生命过程的认识。蛋白质组学是在细胞的整体蛋白质水平上进行研究、从蛋白质整体活动的角度来认识生命活动规律的一门新学科，简要介绍功能基因组学和蛋白质组学的科学背景、概念及其应用。
【关键词】 基因组；功能基因组学；蛋白质组学；
一、基因组及基因组学的概念
基因组(genome)一词系由德国汉堡大学H．威克勒教授于1920年首创，用以表示真核生物从其亲代所继承的单套染色体，或称染色体组。更准确地说，基因组是指生物的整套染色体所含有的全部DNA序列。由于在真核细胞的线粒体和植物的叶绿体中也发现存在遗传物质，因此又将线粒体或叶绿体所携带的遗传物质称为线粒体基因组或叶绿体基因组。原核生物基因组则包括细胞内的染色体和质粒DNA。此外非独立生命形态的病毒颗粒也携带遗传物质，称为病毒基因组。所有生命都具有指令其生长与发育，维持其结构与功能所必需的遗传信息，本书中将生物所具有的携带遗传信息的遗传物质总和称为基因组。[1]
基因组学(genomic)一词系由T．罗德里克(T．Roderick)于1986年首创，用于概括涉及基因组作图、测序和整个基因组功能分析的遗传学学科分支，并已用来命名一个学术刊物Genomics。基因组学是伴随人类基因组计划的实施而形成的一个全新的生命科学领域。[1]
基因组学与传统遗传学其他学科的差别在于，基因组学是在全基因组范围研究基因的结构、组成、功能及其进化，因而涉及大范围高通量收集和分析有关基因组DNA的序列组成，染色体分子水平的结构特征，全基因组的基因数目、功能和分类，基因组水平的基因表达与调控以及不同物种之间基因组的进化关系。基因组学的研究方法、技术和路线有许多不同于传统遗传学的特点，各相关领域的研究仍处于迅速发展和不断完善的过程中。
转录组学与蛋白质组学的关系解析
转录组学与蛋白质组学的关系解析
转录组学和蛋白质组学是现代生物学研究中两个重要的分子生物学领域。转录组学研究基因在特定条件下的转录活动，而蛋白质组学则是研究细胞或组织中所有蛋白质的组成和功能。虽然它们研究的目标分子不同，但两个领域之间存在紧密的关系。本文将对转录组学和蛋白质组学的关系进行深入分析和解析。
一、转录组学和蛋白质组学的定义和研究对象
1. 转录组学
转录组学旨在研究特定生物体在不同条件下产生的所有RNA分子。转录组学的主要手段是高通量测序技术，通过测定细胞或组织中的RNA分子数量和种类，可以了解到基因在某个特定条件下的转录活动水平和发生变化的基因。转录组学的研究对象主要包括mRNA、非编码RNA和转录因子等。
2. 蛋白质组学
蛋白质组学研究的是细胞或组织中所有蛋白质的组成、结构和功能。蛋白质组学的主要手段包括质谱技术和蛋白质芯片技术，通过分析蛋白质的质量、表达水平、修饰和相互作用等信息，可以了解蛋白质在细胞内的功能和相互关系。蛋白质组学的研究对象主要是蛋白质分子本身及其功能。
二、转录组学与蛋白质组学的关系
1. 转录组学为蛋白质组学提供基础数据
转录组学研究的是基因在转录水平上的表达情况，即RNA的表达情况。转录组学的研究结果为蛋白质组学提供了基础数据，因为蛋白质的生成是通过转录和翻译过程完成的。转录组学可以为蛋白质组学提供预测蛋白质表达水平和功能的线索，并且可以为蛋白质的鉴定和定量提供重要的参考依据。
2. 转录组学与蛋白质组学的一致性和差异性
虽然转录组学和蛋白质组学的研究对象不同，但它们之间存在一定程度的一致性和差异性。一致性体现在转录组学结果和蛋白质组学结果之间应该存在一定的相关性，即基因的转录活动水平和蛋白质的表达水平应该是一致的。但是由于转录后修饰、蛋白质稳定性和代谢等因素的存在，转录组学结果和蛋白质组学结果之间也存在一定程度的差异。
3. 互补的研究方法
转录组学和蛋白质组学是互补的研究方法。转录组学可以为蛋白质组学提供初步的线索和信息，而蛋白质组学则可以验证和补充转录组学的结果。通过综合应用这两个方法，可以更全面地了解生物体在特定条件下的基因表达和蛋白质功能。
go分析
GO 分析
Gene Ontology可分为分子功能（Molecular
Function），生物过程（biological
process）和细胞组成（cellular
component）三个部分。蛋白质或者基因可以通过ID对应或者序列注释的方法找到与之对应的GO号，而GO号可对于到Term，即功能类别或者细胞定位。
功能富集分析: 功能富集需要有一个参考数据集，通过该项分析可以找出在统计上显著富集的GO
Term。该功能或者定位有可能与研究的目前有关。
GO功能分类是在某一功能层次上统计蛋白或者基因的数目或组成，往往是在GO的第二层次。此外也有研究都挑选一些Term，而后统计直接对应到该Term的基因或蛋白数。结果一般以柱状图或者饼图表示。
1.GO分析 根据挑选出的差异基因，计算这些差异基因同GO 分类中某（几）个特定的分支的超几何分布关系，GO
分析会对每个有差异基因存在的GO 返回一个p-value，小的p 值表示差异基因在该GO 中出现了富集。 GO
分析对实验结果有提示的作用，通过差异基因的GO
分析，可以找到富集差异基因的GO分类条目，寻找不同样品的差异基因可能和哪些基因功能的改变有关。 2.Pathway分析
根据挑选出的差异基因，计算这些差异基因同Pathway 的超几何分布关系，Pathway 分析会对每个有差异基因存在的pathway
返回一个p-value，小的p 值表示差异基因在该pathway
中出现了富集。 Pathway
分析对实验结果有提示的作用，通过差异基因的Pathway
分析，可以找到富集差异基因的Pathway
条目，寻找不同样品的差异基因可能和哪些细胞通路的改变有关。与GO 分析不同，pathway
分析的结果更显得间接，这是因为，pathway 是蛋白质之间的相互作用，pathway 的变化可以由参与这条pathway
途径的蛋白的表达量或者蛋白的活性改变而引起。而通过芯片结果得到的是编码这些蛋白质的mRNA 表达量的变化。从mRNA
蛋白质不表达的原因分析
蛋白质不表达：常见原因及分析
1.载体构建错误。 这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。比
如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外
有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表
达不出来。
2.宿主菌选择不当。不同的宿主菌其基因型是不一样的。有些经过特殊
修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选
择合适的宿主菌进行表达。因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考
虑更换宿主菌。
3.密码子的使用频率低。有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤其是
起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要
的影响。优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得
有很好的效果。曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密
码子优化进行表达，结果还是没有表达。一气之下将该优化的基因序列
克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但
是一个真实的故事。
4、质粒不稳定或者质粒丢失。pET系统通常比较稳定。但是你选用带
氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生
素，使质粒丢失。还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也
有毒性，造成质粒丢失。这种情况多见于真核表达系统。
5、蛋白酶将蛋白降解了。这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列
引起的。当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr这些氨基酸
时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。N-端是Met时，大肠杆
菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。C末端
最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的，则不易被降解。
6、二级翻译起始位点。这种情况见于你的序列里正好含有和核糖体结
合位点完全一致的序列。那就怪不得人家了，核糖体会很高兴地找到这
个位点，然后开始翻译，致使你的蛋白被截短，在电泳时看不到预期大
生物信息学分析方法
核酸和蛋白质序列分析
蛋白质, 核酸， 序列
关键词: 核酸序列 蛋白质序列 分析软件
在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析,从中尽量发掘信息，从而指导进一步的实验研究。通过染色体定位分析、内含子／外显子分析、ORF分析、表达谱分析等，能够阐明基因的基本信息。通过启动子预测、CpG岛分析和转录因子分析等，识别调控区的顺式作用元件,可以为基因的调控研究提供基础。通过蛋白质基本性质分析，疏水性分析,跨膜区预测，信号肽预测,亚细胞定位预测，抗原性位点预测，可以对基因编码蛋白的性质作出初步判断和预测.尤其通过疏水性分析和跨膜区预测可以预测基因是否为膜蛋白,这对确定实验研究方向有重要的参考意义。此外，通过相似性搜索、功能位点分析、结构分析、查询基因表达谱聚簇数据库、基因敲除数据库、基因组上下游邻居等,尽量挖掘网络数据库中的信息，可以对基因功能作出推论。上述技术路线可为其它类似分子的生物信息学分析提供借鉴.本路线图及推荐网址已建立超级链接，放在北京大学人类疾病基因研究中心网站（http：//。cn/science/bioinfomatics.htm ），可以直接点击进入检索网站.
下面介绍其中一些基本分析。值得注意的是,在对序列进行分析时,首先应当明确序列的性质，是mRNA序列还是基因组序列？是计算机拼接得到还是经过PCR扩增测序得到？是原核生物还是真核生物？这些决定了分析方法的选择和分析结果的解释。
（一）核酸序列分析
1、双序列比对（pairwise alignment）
双序列比对是指比较两条序列的相似性和寻找相似碱基及氨基酸的对应位置，它是用计算机进行序列分析的强大工具,分为全局比对和局部比对两类，各以Needleman-Wunsch算法和Smith—Waterman算法为代表。由于这些算法都是启发式（heuristic)的算法,因此并没有最优值.根据比对的需要,选用适当的比对工具，在比对时适当调整空格罚分（gap
高中生物4_1基因指导蛋白质的合成教学反思新人教版必修2
高中生物4_1基因指导蛋白质的合成教学反思新人教版必修2
第一篇：高中生物 4_1 基因指导蛋白质的合成教学反思 新人教版必修2
《基因指导蛋白质的合成》
本节内容是本章教学的重点、难点，可用2课时，本节为第一课时。主要解决“RNA为什么可作为DNA的信使”、“遗传信息的转录过程”这两个问题。我认为教学时认真处理好这几个方面的问题。
1、做好本章的引入。为了引起学生兴趣，顺利成章引入本节，我采用了上节课所用到的一个资料图片“导入了荧光蛋白基因的小猪和正常小猪”来说明基因与性状之间的关系，性状又是由蛋白质体现的，由此可推测基因是通过指导蛋白质的合成来控制生物性状的，自然引入本节。提出问题“细胞核中的基因是如何通过指导细胞质中的蛋白质的合成来控制生物的性状的呢？”进一步制造悬念，从而顺利切入主题。
2、准确把握主干知识与侧枝内容的教学要求。
本节主干知识是遗传信息的转录的过程，侧枝内容是dna和rna结构的比较、核糖与脱氧核糖的比较、三种不同种类的rna。教师要注意培养学生的归纳、比较和总结的能力，在教学中，处理好主干知识与侧枝内容的关系，合理分配教学时间，明确不同内容的教学要求。
3、充分利用教材和多媒体，提高知识的概括化水平。
转录这部分内容是一个难点，学生往往停留在对知识的零碎记忆和不完整的理解水平上。让学生阅读课本，采取“看图说话”的形式，描述出过程，教师强调重点。教学中采用启发式的教学方法，通过一个个问题启发学生去思考、讨论。利用多媒体引用更多直观的图片、音像资料，提纲性的文字说明来增强效果。另外，应该适当做板书，增强学生认知的同步感。
4、利用表格，将知识系统化。
对于DNA的复制与转录，采用表格归纳的形式，促使学生学会用归类和对比的学习方法，使知识系统化、条理化。 整节课教学按教学设计进行得不错，学生反应积极。但所用的演示动画有缺陷，没有体现“边解旋边转录”的特点，教学时也未强调。设计的习题有两题未完成。
SDS_PAGE法测定His_tag融合蛋白分子量产生偏差的原因_唐威华
1999-02-10收到,1999-06-18接受。本项目受国家自然科学基金会资助(项目批准号39893322)。SDS-PAGE法测定His-tag融合蛋白分子量产生偏差的原因
唐威华 张景六 王宗阳 洪孟民(中国科学院上海植物生理研究所,上海200032)摘要:His-tag/Ni-NTA系统是新发展起来的一个亲和纯化重组蛋白的有用工具,现常用于基因编码产物的特性研究中。SDS-PAGE是实验室测定蛋白质分子量通常采用的方法,而许多实验室用此方法检测His-tag融合蛋白时却常发现测得的分子量偏大,产生偏差的原因尚未阐明。为弄清这一问题,本实验室在研究一个His-tag融合蛋白P73-His时,首先用SDS-PAGE法测得其分子量确实比理论计算值大,然后对其进行C末端氨基酸顺序测定、电喷雾质谱分析,结果证实其实际分子量与理论值一致。酶切去除包括His-tag在内的部分肽段使SDS-PAGE法测量蛋白分子量的偏差大大降低,证实His-tag确实是造成偏差的原因之一。推测由于His-tag中的碱性氨基酸的作用造成蛋白在SDS-PAGE中迁移变慢,而导致偏差。这一现象值得引起有关研究者的注意。关键词:His-tag/Ni-NTA,融合蛋白,SDS-PAGE,电喷雾质谱,分子量学科分类号:Q74 近年来,在分子生物学或基因工程研究中,为了便于得到被研究基因所编码的蛋白,往往将所研究的基因转化到大肠杆菌细胞中,经诱导物作用使之大量表达(Hockney1994)。为了使表达出的蛋白便于分离纯化,通常还在基因的5'端或3'端连接上某些核苷酸顺序,使表达出的融合蛋白含有与某些树脂有亲和作用的肽段,从而可以用亲和层析的方法很简便地将表达的蛋白纯化出来。His-tag/Ni-NTA系统就是这样一种方法,它将目标蛋白以与连续6个组氨酸残基(His-tag)融合的形式在大肠杆菌中表达,利用His-tag与Ni离子的亲和作用,其表达产物可以用Ni-NTA树脂一步纯化(Hochuli等1987)。由于引入的His-tag分子量小,几乎不影响蛋白原有的功能,而且纯化方便,这一系统现已为许多分子生物学研究者采用。但在实际工作中采用这一系统时也会遇到一些问题,首先遇到的就是融合蛋白分子量的检测问题。目前许多实验室测定蛋白质分子量通常是用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法。此方法主要是利用被分析的蛋白分子在SDS、巯基试剂存在时经加热处理而发生变性,并与SDS分子结合成带负电荷的粒子,经电泳,由于聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应,不同大小的蛋白质分子向阳极移动有快慢的区别,因此可以由电泳后各蛋白的泳动距离推算其分子量(Sambrook等1989)。由于SDS-PAGE法测定蛋白质分子量已是一种很成熟的实验手段,许多实验室也将此方法用于His-tag融合蛋白分子量的检测,以初步判断表达的纯化产物是否预期的蛋白。但是不少研究者发现His-tag融合蛋白在SDS-PAGE中表现出的分子量大于其应有的分子量(Harwood1994),一些研究者在文献中提到了这一现象(Niu和Guiltinan1994),另一些研究者则回避了这一问题(Kim和Chung1997,DeMaria和Brewer1996),但他们对蛋白确切分子量都未作进一步测定,对造成偏差的原因也未进一步研究。本实验室计划采用His-tag/Ni-NTA系统对一系列新克隆到的水稻基因进行表达及产物纯化,因此试图首先搞清这一偏差的产生原因。本文报告在将所研究的一个水稻cDNA片段c73的5'端连接上一段含有His-tag编码顺序的核苷酸后,在大肠杆菌中表达出的融合蛋白通过与Ni-NTA树脂的亲和层析加以纯化。用SDS-PAGE方法测定纯化蛋白的分子量时,的确观察到它比理论计算的分子量偏大了许多。但我们进一步对纯化的融合蛋白的C末端氨基酸顺序进行了测定,并用电喷雾质谱分析证实该蛋白确系我们所要的目标蛋白,而且其实际分子量与理论计算值相符。这就证明了用His-tag/Ni-NTA系统纯化得到的His-tag融合蛋白是正确的,其分子量并未发生改变,而是在采用SDS-PAGE方法测定时造成偏差。我们还将融合蛋白中His-tag切除后再用SDS-PAGE法检测,证实His-tag是造成这一偏差的原因之一。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 仪器 Mini-protein蛋白电泳仪(Bio-Rad),PE-ABI491ProciseC蛋白质序列仪,电喷雾质谱仪64植物生理学报,ActaPhytophysiologicaSinica 2000,26(1):64～68Quattro。1.1.2 工具酶 专一性蛋白水解酶———凝血酶(thrombin)购自Sigma公司。1.2 实验方法1.2.1 蛋白的SDS-PAGE分析 取经Ni-NTA树脂亲和层析纯化得到的含His-tag的融合蛋白(唐威华等1999)与已知分子量的标准蛋白样品一起进行SDS-PAGE分析,电泳按Laemmli方法进行,电泳后凝胶用考马斯亮蓝R250染色。1.2.2 蛋白C末端氨基酸顺序测定 取经纯化后纯度达到90%以上的融合蛋白样品约100μg(约2nmol)经PE-ABI公司Prosorb柱脱盐后,采用(异)硫氰酸化学裂解法,在PE-ABI491ProciseC蛋白质序列仪上进行反应,切割下来的ATH-氨基酸经HPLC分离分析,与标准的ATH-氨基酸的分离图谱比照,得出了蛋白C末端的氨基酸顺序(曾嵘等1998)。1.2.3 蛋白分子量的质谱测定 取与上述同样纯度的融合蛋白样品约20μg脱盐后,采用阴离子的电喷雾-离子化质谱方法在电喷雾质谱仪Quattro上测定蛋白的分子量(Carr和Hemling1991)。1.2.4 His-tag融合蛋白的凝血酶处理 按照Sig-ma公司说明书进行。2 结果与讨论2.1 融合蛋白P73-His的SDS-PAGE分析c73是本实验室采用酵母单杂交法从水稻cDNA文库中筛选到的一段DNA序列,它编码的蛋白可能参与水稻蜡质基因的表达调控。经过核苷酸顺序测定,得知它编码138个氨基酸残基。将此cDNA重组到大肠杆菌表达载体pET28-c(+)上,组成编码178个氨基酸(其中包括连续6个组氨酸在内的40个氨基酸为载体核苷酸编码)的融合基因,计算它的理论分子量为19.1kD(图1A)。将该重组