植物叶绿素类胡萝卜素测定方法
叶绿素、类胡萝卜素含量的测定
一、原理
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。
（二）仪器设备：1）分光光度计；2）电子顶载天平（感量0.01g）；3）研钵；4）棕色容量瓶； 5）小漏斗；6）定量滤纸；7）吸水纸； 8）擦境纸；9）滴管。
（三）试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮）（v丙酮：v乙醇=2：1的95%水溶液）；2）石英砂；3）碳酸钙粉。 暗中2h，0.5g，25ml
三、实验步骤
1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
2)将取好的样品放入25ml容量瓶中，加混合浸提液（无水乙醇:丙酮=5:5）20ml，放在黑暗条件下，浸泡至叶片发白，用浸提试剂定容至25ml，摇匀备用。
3）把叶绿体色素提取液倒入1cm光径的比色皿内，以浸提试剂为空白测定吸光度。选择波长663 646 和470nm。
四、实验结果计算
叶绿素a的浓度 = 12.21 OD633 – 2.81 OD646 叶绿素b的浓度 = 20.13 OD646– 5.03 OD663
类胡萝卜素浓度=（1000A470-3.27Ca-104Cb）÷229 单位 mg/L
C(mg/L)*提取液总量（ml）
叶绿体色素含量（mg/g）= ____________________________
烟叶重量（g）*1000
注意事项：操作避光研磨时间短些
叶绿素含量的测定实验报告
一、实验目的
1. 学习叶绿素提取和分离的方法。
2. 掌握利用分光光度法测定叶绿素含量的原理和操作步骤。
3. 了解不同植物叶绿素含量的差异。
二、实验原理
叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，其含量直接影响植物的生长和发育。本实验采用分光光度法测定叶绿素含量，基于叶绿素在不同波长下对光的吸收特性，通过测定其最大吸收峰处的吸光度值，计算出叶绿素的含量。
三、实验材料与仪器
实验材料：
1. 新鲜菠菜、小麦、水稻等植物叶片。
2. 95%乙醇、无水乙醇、碳酸钙、石英砂等试剂。
实验仪器：
1. 分光光度计
2. 研钵
3. 移液管
4. 量筒
5. 滤纸
6. 比色皿
7. 电子天平
四、实验步骤
1. 样品制备：
- 称取新鲜植物叶片0.1g（准确至0.0001g），放入研钵中。
- 加入少量石英砂和碳酸钙，用研杵研磨成匀浆。 - 加入5ml 95%乙醇，继续研磨至叶片组织变白。
2. 叶绿素提取：
- 将提取液转移至10ml试管中，用少量95%乙醇冲洗研钵、研杵及残渣，合并于试管中。
- 用滤纸过滤提取液，收集滤液。
3. 叶绿素分离：
- 将滤液转移至比色皿中，以无水乙醇为空白，在波长663nm、645nm和652nm处测定吸光度值。
4. 叶绿素含量计算：
- 根据吸光度值和标准曲线，计算出叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量。
- 叶绿素总含量 = 叶绿素a含量 + 叶绿素b含量。
五、实验结果与分析
以菠菜叶片为例，实验结果如下：
| 植物种类 | 叶绿素a含量（mg/g） | 叶绿素b含量（mg/g） | 类胡萝卜素含量（mg/g） | 叶绿素总含量（mg/g） |
| -------- | ------------------- | ------------------- | --------------------- | ------------------- |
叶绿素含量测定方案
叶绿素的测定
步骤：
1． 采集处理的新鲜叶片，擦净组织表面的污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
2． 准确称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份。分别置于25ml的容量瓶中，用乙醇浸泡24小时。注意要避光保存。
3． 摇匀，取提取液倒入比色杯中，在665，649，470nm波长下测定其消光度（OD）值，以95%乙醇为空白对照，按公式计算色素浓度（mg/L）
Ca是叶绿素a的浓度， Cb是叶绿素b的浓度，Ca+Cb 是叶绿素总浓度， Cx.c为类胡萝卜素的浓度。
A665 A649 A470分别为叶绿体色素提取液在波长665，649，470nm下的消光度。
叶绿素含量（mg/g）=（色素的浓度×提取液的体积×稀释倍数）/样品鲜重 叶绿素含量：采用分光光度计法测定，所得值为单位质量叶片的含量。
叶绿素总量：为单位质量叶片叶绿素含量乘以叶片鲜重
叶片含水率=（鲜重-干重）/鲜重×100%
GS酶活性及可溶性蛋白的测定
一、步骤：
GS酶活性：
1. 取冷冻小麦样品0.5g样品置于预冷的研钵中。
2. 加入少许石英砂研磨，加入1.5ml的Tris-Hcl缓冲液（分两次加入）继续研磨匀浆后倒入2ml离心管中。
3. 于4℃，13,000 r/min离心20min，上清液即为粗酶液。
4. 按照以下顺序向5ml离心管中分别加入：0.6ml咪唑-盐酸缓冲液+0.4ml谷氨酸钠+0.4mlATP-Na+0.2ml MgSO4+0.3ml粗酶液+0.3mlTris-HCL缓冲液。
5. 于25℃水浴5分钟，加入0.2ml羟胺反应15分钟后，加入0.8ml
FeCl3终止反应。
6. 混合液于8000r/min离心8min后取上清液于540nm比色测定吸光值（对照用Tris-HCL代替酶液）。
可溶性蛋白：
1. 向2ml离心管中加入95uL Tris-HCL缓冲液，再加入5uL测酶活时的上清液（即粗酶提取液），混匀，加入1mL Bradford试剂，颠倒混匀反应3-5min。 2. 测定反应液在595nm下的吸光值。（对照100uL Tris-HCL+1mL
叶绿素含量测定方法
叶绿素含量测定方法
实验14 叶绿素a和b含量的测定(分光光度法)
一、目的
学会Chla、b含量的测定方法，了解叶片中Chla、b的含量。
二、材料用具及仪器药品
菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶(25ml)、漏斗、滤纸、乙醇(95%)
三、原理
叶绿素a、b在波长方面的最大吸收峰位于665nm和649nm，同时在该波长时叶绿素a、b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert Beer定律，列出浓度C与光密度D之间的关系式:
D=83.31Ca+18.60C…………………………….(1) 665b
D=24.54Ca+44.24 C…………………………….(2) 649b
(1)(2)式中的D66、D649为叶绿素溶液在波长665nm和649nm时的光密度。 5
为叶绿素a、b的浓度、单位为每升克数。
82.04、9.27为叶绿素a、b在、在波长665nm时的比吸收系数。
16.75、45.6为叶绿素a、b在、在波长649nm时的比吸收系数。
1)(2)，则得 : 解方程式(
C=13.7 D—5.76 D………………………(3) A665649
C=25.8 D—7.6 D……………………… (4) B649665
G=C+C=6.10 D+20.04 D………(5) AB665649
此时，G为总叶绿素浓度，C、CB为叶绿素a、b浓度，单位为每升毫克，利用上面(3)A (4)(5)式，即可以计算叶绿素a、b及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤
1(称取0.1克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇10ml共研磨成匀浆，再加5ml乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml。
2(取一光径为1cm的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm和649nm波长测出该色素液的光密度。
叶绿素含量测定方法 2
实验14 叶绿素a和b含量的测定（分光光度法）
一、目的
学会Chla、b含量的测定方法，了解叶片中Chla、b的含量。
二、材料用具及仪器药品
菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）
三、原理
叶绿素a、b在波长方面的最大吸收峰位于665nm和649nm，同时在该波长时叶绿素a、b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert Beer定律，列出浓度C与光密度D之间的关系式：
D665=83.31Ca+18.60Cb…………………………….(1)
D649=24.54Ca+44.24 Cb…………………………….(2)
(1)(2)式中的D665、D649为叶绿素溶液在波长665nm和649nm时的光密度。
为叶绿素a、b的浓度、单位为每升克数。
82.04、9.27为叶绿素a、b在、在波长665nm时的比吸收系数。
16.75、45.6为叶绿素a、b在、在波长649nm时的比吸收系数。
解方程式(1)(2)，则得 ：
CA=13.7 D665—5.76 D649………………………(3)
CB=25.8 D649—7.6 D665……………………… (4)
G=CA+CB=6.10 D665+20.04 D649………(5)
此时，G为总叶绿素浓度，CA、CB为叶绿素a、b浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算叶绿素a、b及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤
1．称取0.1克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇10ml共研磨成匀浆，再加5ml乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml。
2．取一光径为1cm的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm和649nm波长测出该色素液的光密度。
计算结果：
叶绿素a含量（mg/g. FW）=2.01100025AC
叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定
一、原理
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比,即A＝αCL
式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位,液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数.各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得.
如果溶液中有数种吸光物质,则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和.这就是吸光度的加和性.今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度.在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰.
已知叶绿素a、叶绿素b的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm处。已知在波长663nm下叶绿素a、叶绿素b在该溶液中的吸光系数的分别为82。04和9.27;在波长645nm处的吸光系数分别为16。75和45。60。根据加和性原则列出以下关系式：
A663=82。04Ca+9.27Cb （1）
A645=16.76Ca+45。60Cb （2）
式（1) （2）A663nm和A645nm为叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，Ca Cb分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度,以mg/L为单位.
解方程（1） （2）组得
Ca=12.72 A663-2.59 A645 (3）
实验二十叶绿素含量的测定
50 实验二十 叶绿素含量的测定
叶绿素的含量与植物光合作用及氮素营养有密切的关系，在科学施肥、育种及植物病理研究上常有测定的需要。
方 法 Ⅰ
一、 目的
掌握叶绿素含量测定的基本原理和方法。
二、原理
叶绿素与其他显色物质一样，在溶液中如液层厚度不变则其吸光度与它的浓度成一定的比例关系。已知叶绿素a 、b在652 nm波长处有相同的比吸收系数（均为34.5）。因此，在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，即可计算出叶绿素a 、b的总量。
三、材料、仪器设备及试剂
1. 材料：菠菜叶；芥菜叶或其他植物叶片。
2. 仪器设备：电子分析天平；分光光度计；漏斗；25ml容量瓶；剪刀；滤纸；玻棒等。
3. 试剂：95﹪乙醇、石英砂、碳酸钙粉。
四、实验步骤
1. 叶绿素的提取
称取植物鲜叶0.20g（可视叶片叶绿素含量增减用量），剪碎放入研钵中，加少量碳酸钙粉和石英砂及3～5ml95﹪乙醇研成匀浆，再加约10ml 95﹪乙醇稀释研磨后，用滤纸过滤入25ml容量瓶中，然后用95﹪乙醇滴洗研磨及滤纸至无绿色为止，最后定容至刻度，摇匀，即得叶绿素提取液。
2. 测定
取光径为1cm的比色杯，倒入叶绿素提取液距杯口1cm处，以95﹪乙醇为空白对照，在652 nm波长下读取吸光度（A）值。
五、计算
将测得的吸光度A652 值代入公式(1), 即可求得提取液中叶绿素浓度。所得结果再代入公式(2)，即可得出样品中叶绿素含量（mg ·g－1Fw）。
A652
C ( mg ·ml－1 ) = ———— ……………………………………………………（1）
34.5
公式中： C — 叶绿素 （a 和b ）的总浓度( mg ·ml－1 ) 51 A652 — 表示在652nm 波长下测得叶绿素提取液的吸光度
叶绿素含量的测定 2
叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定ﻫ
一、原理
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律,某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C与液层厚度Ｌ成正比,即A＝αCL
式中:α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位,液层厚度为1ｃｍ时,α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质,则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总与。这就就是吸光度的加与性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b与类胡萝卜素的含量,只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A,并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰,所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、叶绿素b的8０%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于6６３、６45nm处。已知在波长66３nm下叶绿素a、叶绿素ｂ在该溶液中的吸光系数的分别为８2.04与９、27;在波长645nｍ处的吸光系数分别为1６、75与45.60。根据加与性原则列出以下关系式:
A663=82、04Ca+9、2７Ｃb (1)
A645＝16、76Ca+4５、6０Cb (２)
式(1) (2)A6６３nm与Ａ６45nm为叶绿素溶液在66３nm与６45nｍ处的吸光度,Cａ Cb分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度,以mｇ/L为单位。
解方程(1) (2)组得
Ｃa=12.72 A663—2、59 A64５ (3)
叶绿素含量测定方法 3
实验14 叶绿素a和b含量的测定（分光光度法）
一、目的
学会Chla、b含量的测定方法，了解叶片中Chla、b的含量。
二、材料用具及仪器药品
菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）
三、原理
叶绿素a、b在波长方面的最大吸收峰位于665nm和649nm，同时在该波长时叶绿素a、b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert Beer定律，列出浓度C与光密度D之间的关系式：
D665=83.31Ca+18.60Cb…………………………….(1)
D649=24.54Ca+44.24 Cb…………………………….(2)
(1)(2)式中的D665、D649为叶绿素溶液在波长665nm和649nm时的光密度。
为叶绿素a、b的浓度、单位为每升克数。
82.04、9.27为叶绿素a、b在、在波长665nm时的比吸收系数。
16.75、45.6为叶绿素a、b在、在波长649nm时的比吸收系数。
解方程式(1)(2)，则得 ：
CA=13.7 D665—5.76 D649………………………(3)
CB=25.8 D649—7.6 D665……………………… (4)
G=CA+CB=6.10 D665+20.04 D649………(5)
此时，G为总叶绿素浓度，CA、CB为叶绿素a、b浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算叶绿素a、b及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤
1．称取0.1克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇10ml共研磨成匀浆，再加5ml乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml。
2．取一光径为1cm的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm和649nm波长测出该色素液的光密度。
计算结果：
叶绿素a含量（mg/g. FW）=
叶绿素含量的测定 3
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一、原理
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL
式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、叶绿素b的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm处。已知在波长663nm下叶绿素a、叶绿素b在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据加和性原则列出以下关系式：
A663=82.04Ca+9.27Cb （1）
A645=16.76Ca+45.60Cb （2）
式（1） （2）A663nm和A645nm为叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，Ca Cb分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度，以mg/L为单位。
植物叶绿素类胡萝卜素测定方法
叶绿素、类胡萝卜素含量的测定
一、原理
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量;根据朗伯—比尔定律,某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比,即A＝αCL式中：α比例常数;当溶液浓度以百分浓度为单位,液层厚度为1cm时,α为该物质的吸光系数;各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得;如果溶液中有数种吸光物质,则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和;这就是吸光度的加和性;今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量,只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A,并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度;在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰,所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰;
二、材料、仪器设备及试剂
一材料：新鲜或烘干的植物叶片;
二仪器设备：1分光光度计；2电子顶载天平感量；3研钵；4棕色容量瓶； 5小漏斗；6定量滤纸；7吸水纸； 8擦境纸；9滴管;
三试剂：195%乙醇或80%丙酮v丙酮：v乙醇=2：1的95%水溶液；2石英砂；3碳酸钙粉; 暗中2h,,25ml
三、实验步骤
1取新鲜植物叶片或其它绿色组织或干材料,擦净组织表面污物,剪碎去掉中脉,混匀;
2将取好的样品放入25ml容量瓶中,加混合浸提液无水乙醇:丙酮=5:520ml,放在黑暗条件下,浸泡至叶片发白,用浸提试剂定容至25ml,摇匀备用;
3把叶绿体色素提取液倒入1cm光径的比色皿内,以浸提试剂为空白测定吸光度;选择波长663 646
和470nm;
四、实验结果计算 叶绿素a的浓度 = OD633 – OD646