荧光定量PCR在乙型肝炎病毒宫内感染监测中的应用
HBV-DNA荧光定量PCR检测的临床意义
HBV-DNA荧光定量PCR检测的临床意义付蕾【摘要】目的实时荧光定量聚合酶反应(FQ-PCR)检测血清中乙型肝炎病毒(HBV)-DNA的临床意义.方法用荧光探针技术相结合所产生的实时荧光定量聚合酶反应.结果 240例疑似乙型肝炎标本中,有91例大三阳(HBsAg阳性、HBeAg 阳性、抗-HBc阳性)患者血清HBV-DNA阳性率100%,平均浓度2.8×106 copy/mL;有19例小二阳(HBsAg阳性、抗-HBc阳性)患者血清HBV-DNA阳性94.7%,平均浓度4.3×105copy/mL;有40例小三阳(HBsAg阳性、抗-HBe阳性、抗-HBc阳性)患者血清HBV-DNA阳性率77.5%,平均浓度1.2×104copy/mL.10例HBsAg、HBeAg阳性患者血清HBV-DNA阳性率100%,平均浓度5.6×107copy/mL;有30例抗-HBs、抗-HBs阳性患者血清中HBV-DNA阳性有1例,检出阳性率3.3%,平均浓度2.6×103copy/mL;乙肝两对半全阴50例有1例检出HBV-DNA,阳性率2.0%,平均浓度5.9×102copy/mL.结论 FQ-PCR是了解HBV-DNA在体内复制和判断疗效的有利手段,并具有快速、特异、灵敏等优点,可真实反应HBV-DNA复制情况及病情变化,对乙肝临床诊断及治疗有较大的指导意义.【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2010(007)010【总页数】2页(P960-961)【关键词】乙型肝炎病毒;实时荧光定量聚合酶反应;乙肝标志物【作者】付蕾【作者单位】陕西省西安市铁路中心医院,710054【正文语种】中文【中图分类】R512.62HBV血清标志物检测是目前诊断乙型肝炎(下称乙肝)最常用的指标，主要反映人体对HBV的免疫反应状态，不同血清标志模式反映不同的临床意义。
乙肝病毒cccDNA检测
1.选择性PCR
选择性PCR：rcDNA不被扩增
选择性PCR：cccDNA能被扩增
“选择性”PCR：并非万无一失
PCR产物自身退火（self annealing）
rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠
Hepatology Research 2003;15: 234-243（PBMC）
解决方案
特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA 采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法 酶切纯化cccDNA 采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safe DNA酶
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 侵入者探针法（Invader assaay）
P2
cccDNA能被扩增 检测到荧光信号
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR的原理
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
结果 ： 标准曲线方程YCtcopy 相关指数： R2=0.995 灵敏度至少可以达到103copy/ml
与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。
01
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
02
rcDNA不能被扩增 无荧光信号
EcoR I
5‘
+
P1
P2
3200(1)
5‘
3‘
1590
3‘
1820
P1
1820
1590
+
3200（1）
EcoR I
World J Gastroenterol 2004;10(1):82-85(血清)
临床医学检验新技术
临床医学检验新技术荧光定量PCR所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
技术原理：将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得CT值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
临床应用：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。
检测种类涉及多种病原体，从细菌、病毒、衣原体、支原体、真菌、立克次体、螺旋体到寄生虫。
酶联免疫分析技术酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)技术自20 世纪70年代初问世以来，发展非常迅速，目前被广泛应用于免疫学、医学、生物学等许多领域。
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
技术原理：酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术，其先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，后加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。
根据检测目的和操作步骤不同，有双抗体夹心法、间接法、竞争法三种类型的常用方法。
高敏与普通荧光定量PCR技术在慢乙肝患者抗病毒疗效监测中的对比研究
高敏与普通荧光定量PCR技术在慢乙肝患者抗病毒疗效监测中的对比研究卢建华;杨莉;赵召霞;李芊璘;李敏然;刘玉珍;戴二黑;陈秀丽【摘要】目的比较高灵敏度与普通荧光定量PCR技术在慢性乙型肝炎(CHB)患者抗病毒疗效监测中的区别.方法对49例CHB患者141份采用普通PCR检测结果为阴性(<500 IU/mL)标本,采用高敏PCR试剂进行复查.结果根据高敏PCR血清HBV DNA定量检测结果,141份采用普通PCR检测结果阴性标本存在以下5种状况,即>500、20～500、10～20、<10 IU/mL和阴性,比例分别为13.5％、31.9％、18.4％、30.5％和5.7％.随着血清HBV DNA水平的逐渐增高,各组ALT、AST水平和异常升高率也存在逐渐增加的趋势,但是仅仅各组AST水平差异有显著意义(P<0.05).随着血清HBV DNA水平逐渐降低,各组血清HBeAg阳性率和水平也存在逐渐降低的趋势.其中,HBV DNA阴性组血清HBeAg阳性率显著低于10～20IU/mL组和>500 IU/mL组(P<0.05).结论与普通PCR技术相比,高灵敏度的HBV DNA荧光定量PCR技术在CHB患者抗病毒治疗监测中准确性更高.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2019(011)005【总页数】4页(P361-364)【关键词】慢性乙型肝炎;抗病毒治疗;疗效监测;HBVDNA;高敏荧光定量PCR【作者】卢建华;杨莉;赵召霞;李芊璘;李敏然;刘玉珍;戴二黑;陈秀丽【作者单位】石家庄市第五医院检验科,河北,石家庄050021;石家庄市第五医院检验科,河北,石家庄050021;石家庄市第五医院检验科,河北,石家庄050021;石家庄市第五医院检验科,河北,石家庄050021;石家庄市第五医院检验科,河北,石家庄050021;石家庄市第五医院检验科,河北,石家庄050021;石家庄市第五医院检验科,河北,石家庄050021;石家庄市第五医院检验科,河北,石家庄050021【正文语种】中文近年来，世界卫生组织、美国肝病研究学会（American Association for the study of liver disease，AASLD）、欧洲肝脏研究协会（European Association for the Study of the Liver，EASL）、亚太肝病研究学会（Asia Pacific association for the study of liver，APASL）以及中华医学会肝病学分会等制订的慢性乙型肝炎防治指南均推荐采用灵敏度和精确度高的实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR）法，最低检测下限为10～15 IU/mL［1-4］。
荧光定量检测HBV cccDNA在慢性乙型肝炎患者中的应用
治疗 ，所有患者均治疗 ２ ４周以上 ；应用 实时荧光 定量聚合酶 链反应技 术检 测慢性 乙型肝 炎 患者 ０周、８周、１ ２周 、 ２ ４周、Ｈ Ｖ ｃｃ Ｎ Ｂ ｃＤ Ａ及 Ｈ Ｖ Ｄ Ａ含 量。结果 ：１５例 患者 中ｃｃ Ｎ Ｂ Ｎ ２ ｃＤ Ａ阳性率为 ７ ． ％ ，以肝硬化 患者阳性率最低。肝 １２
Ｃ ｉａ ｈｎ
Ａ ｓ ａｔ Ｏｂｅｔ ｅ ｏｓ ｄ Ｂ ｏａ ｎ ｙ ｌ ｅ ｉ ｕ ｒ Ｎ （ｃＤ Ａ）ｉ ｔ ｉｒ ｕｉ ｆ ｅ ｐｅａ ｂｏｄａ ｄ ｂｔ ｃ ｊｃｉ ：Ｔ ｔ ｙＨ Ｖ ｃｖ ｅｆ ｏ ｄｃ ｃｌ Ａ ｃｃ Ｎ ｒ ｖ ｕ ｌ ｌ ｃｓ ｒ ａＤ ｎ ｈ ｄｓｉ ｔ ｎｏ ｒ ｈｒｌ ｌｏ ｎ ｅ ｔｂ ｏ ｐ ｉ
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１ ８・ ０
中西医结合肝病杂 志 ２ １ ０ ０年第 ２ Ｏ卷第 ２期
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临床 检 验 ・
ｄ ｉ ０ ３ ６ ／．ｓ ．０ ５０ ６ ． ０ ０ ０ ． １ ｏ：ｌ． ９ ９ ｊｉ ｎ １ ０ －２ ４ ２ １ ．２ ０ ６ ｓ
荧光 定量检 测 Ｈ Ｖ ｃｃ Ｎ Ｂ ｃＤ Ａ在 慢 性 乙型肝 炎 患者 中的应 用
Ｔｈ ｐ ｉａ ｉ ｎ ｏ ｃ ＤＮＡ ｕ ｒ ｓ ｅ ｃ ａ ｔｔ ｔｖ ｔｃ ｉｎ ｆｈ ｐａ ｉｉ ｅ ａ ｐｌ ｔｏ ｆｃ ｃ ｃ ｌ ｆ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｑｕ ｎ ｉａ ｉ ｅ ｄｅｅ ｔｏ ｏ ｅ ｔｔｓ Ｂ
ｖ ｒ ｎ ｐａ ｉ ｎ ｓ ｗｉ ｈｒ ｎｉ ｐ ｔｔｓＢ ｉｕｓ ｉ ｔｅ ｔ ｎｌｃ ｏ ｃ ｈｅ ａ ｉｉ
血清HBVDNAPCR荧光定量检测指导乙型肝炎治疗的分析
［ 刘 子 君 ， 瑞 宗 ， 昌茂 ， 骨 肿 瘤 及 瘤 样 病 变 １ ２］ 夺 刘 等． ２
灭活、 植骨， 我们体会为防止复发的关键是病灶彻底刮除， 开 槽应足够大， 做到每个角落均能刮到， 特别注意开窗周边及 骨脊间的凹陷处。灭活是预防复发的进一步保障， 清除病灶
刮除后残留的肿瘤样组织。植骨是保证完全愈合的关键， 植
临 床 分 析Ｅ］ 中 国矫 形 外 科 杂 志 ．９ ８ ５ ４ ：２ ． Ｊ． １ ９ ，（ ）３ ９
收 稿 日期 ：０ ８ ０ — ３ ２ ０ — ３０
作者 简 介 ： 全 平 （９ ３ ） 男 。 西 省 怀仁 县 人 ， 士 学位 ， 主 任 医师 ， 要从 事 骨 科 临床 工作 。 马 １６一 。 山 硕 副 主
性 。结 论 ； 清 ＨＢ ＤＮ Ｃ 荧 光 定 量 检 测 可 以作 为 判 断 ＨＢ 感 染 不 同病 程 的有 效 指 标 ， 指 导 乙型 肝 炎 诊 断 、 血 Ｖ ＡＰ Ｒ Ｖ 为 治 疗提供参考 。 关键词 Ｈ ＶＤ Ｐ Ｒ 荧 光 定 量 检 测 ； Ｂ ＮＡ Ｃ 乙型 肝 炎 ； 析 分 文 献 标 识 码 ： Ｂ 中 图 分 类号 ： １ ． Ｒ５ ２ ６ ２
文章 编 号 ： ６ １ ６ １ ２ ０ ） ８ ６ ８ ０ １ ７ —８ ３ （ ０ ８ ０ —０ ８ — ２
血清 ＨＢ ＶＤＮＡＰ Ｒ 荧 光定 量检 测指 导 乙型 肝炎治 疗 的分 析 Ｃ
李 钧 ， 吴 虹
（ 治 市人 民 医 院 ， 西 长 治 长 山 ０６０） ４ ００
摘 要 目的 ： 用 Ｐ Ｒ 体 外 扩增 法 定 量 检 测 乙 型 肝 炎 病 毒 Ｄ 采 Ｃ ＮＡ 的载 量 ， 乙 型 肝 炎 的 治 疗 提 供 参 考 方 法 ： 为 采
两种荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比较与评价
两种荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比较与评价HBV-DNA是指乙型肝炎病毒的DNA，乙型肝炎是一种常见的传染病，严重者可发展为肝硬化和肝癌。
对HBV-DNA进行准确快速的检测对于乙型肝炎的预防和治疗非常重要。
目前，常用的HBV-DNA检测方法之一就是荧光定量PCR法。
本文将对比两种常用的荧光定量PCR试剂对HBV-DNA的检测效果进行评价，以期为临床实验提供参考依据。
一、试剂介绍1. 荧光定量PCR试剂A荧光定量PCR试剂A是一种常用的商业试剂，根据厂家说明书得知，该试剂的检出限为10 IU/ml，检测范围为10-10^8 IU/ml，重现性良好，适用于临床检测。
二、检测原理荧光定量PCR是一种利用PCR技术和荧光探针技术相结合的方法，可以对DNA进行高灵敏度的定量检测。
在HBV-DNA检测中，荧光定量PCR试剂会通过特定的引物和探针对乙型肝炎病毒的DNA进行扩增，并利用荧光信号来定量检测目标DNA的含量。
三、检测结果比较与评价1. 灵敏度比较通过对同一份样本分别使用试剂A和试剂B进行检测，发现试剂A的检出限明显低于试剂B。
在实际应用中，对于低水平的HBV-DNA，试剂A的性能表现更为优越，可以更精准地检测出病毒载量较低的患者。
2. 稳定性比较在长期使用过程中，试剂A和试剂B的稳定性表现出一定的差异。
试剂A在不同存储条件下的试剂稳定性较好，能够保持较长时间的高灵敏度和准确性；而试剂B在长期使用后，可能会出现一定程度的灵敏度下降，需要更频繁地更换试剂批次以保证结果的准确性。
在进行多次重复检测实验后，发现试剂A和试剂B的重现性表现相当，均具有较好的重现性。
这表明无论是试剂A还是试剂B，都可以在不同实验条件下保持较高的结果稳定性，可以满足临床实验的需求。
四、总结与展望通过对试剂A和试剂B的检测结果比较与评价，我们可以得出结论：试剂A相对于试剂B在HBV-DNA定量检测中具有更高的灵敏度和更好的稳定性，能够更准确、更快速地检测出乙型肝炎病毒的DNA含量。
乙型肝炎病毒DNA定量检测的临床应用
乙型肝炎病毒DNA定量检测的临床应用目的：探讨乙型肝炎患者HBV-DNA含量与其乙型肝炎血清学标志物的关系。
方法：采用微板核酸杂交技术对200例乙型肝炎血清学标志物阳性的患者和20例正常健康人群，进行HBV-DNA PCR定量检测。
结果：根据血清学标志物分为五组，HBsAg、HBeAg、抗-HBc均阳性患者HBV-DNA含量高于其他患者，比较差异有统计学意义（P＜0.05），HBsAg、抗-HBe、抗-HBc均阳性患者与HBsAg、抗-HBc均阳性患者DNA拷贝数比较差异无统计学意义。
结论：乙肝血清学标志物作为乙肝病毒有无感染的指标不能完全反映患者体内HBV的复制情况，HBV-DNA定量检测对监测乙肝病毒感染的病情发展及抗HBV复制药物的治疗具有重要意义。
标签：乙型肝炎病毒；微板核酸杂交；血清学标志物【Abstract】Objective：To investigate the relation between the amount of HBV-DNA in serum of patients with HBV infection and the marker of hepatitis B virus.Method：Serum HBV-DNA was quantitatively detected by tiny plank nucleic acid hybridize technique of PCR to 200 policlinic patients infected with HBV and 20 healthy men.Result：The men were divided into 5 groups with the marker of HBV，there were significance differences from student test between HBsAg，HBeAg，HBcAb masculine and others.Conclusion：It is as index that the marker of HBV monitor hepatitis B virus infection，which couldn’t reflect completely replication of HBV.Quantitative detection of HBV-DNA had important significance to moniter the state of HBV infection and drug treatment.【Key words】Hepatitis B virus；Tiny plank nucleic acid hybridize；Marker of serum hepatitis B virus我国是世界上乙型肝炎病毒感染的高发地区，全国约有50%～70%的人感染过乙型肝炎病毒，约10%的人为携带者。
HBV cccDNA荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用
ｃ ｏ ｏ ＤＮＡ Ｏ ｆ ＨＢＶ
ｓ ＨＡＮ Ｙｏ ｕ ｌ ａ ｎ ｅ ｔ ｏ ｌ
（ Ｄｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ， Ｃ ｈ ｏ ｎ ｇ ｑ ｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ）
一
６ ０１ 一
论 著 文 章编号： ０ ２ ５ ３ — ３ ６ ２ ６ （ ２ ０ ０ ７ ） ０ ６ － ０ ６ ０ １ — ０ ５
Ｈ Ｂ Ｖ ｃ ｃ ｃ Ｄ Ｎ Ａ荧光 定量 Ｐ Ｃ Ｒ检测 方法 的建 立及初步应用
单幼兰， 王 箭， 尹一兵
４ ０ ０ ０ １ ６ ）
（ 重庆 医科 大 学 检 验 系 ， 重庆
ｔ ｏ ｄｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｔ ， ｕｓ ｉ ｎ ｇ ｈｅ ｔ ＡＴＰ ｄ ｅ ｐ ｅ ｎｄ ｅ ｎ ｔ Ｄｎ ａ ｓ ｅ ｔ ｏ ｉ ｎ ｃ ｒ ｅ ａ ｓ ｅ ｔ ｈｅ ｓ ｐｅ ｃ ｉ ｉｃ ｆ ｉ ｔ ｙ ｇ ｒ ｅ ａ ｄｙ Ｒｅ ｓ ｕ／ ｔ ｓ： Ｗｅ ｈ ａ ｖ ｅ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｅ ｄ ａ ｎ ｅ ｗ ｌ ｆ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｔ
【 关键词 】 乙型肝炎病毒 ； 荧光定量 ； Ｐ Ｃ Ｒ ； 检测方法 【 中国图书分类法分类号 】 Ｒ ３ ７ ３ ． ２ ＂ １ 【 文献标 识码 】 Ａ 【 收稿 日期 】 ２ ０ ０ ６ — １ ０ — １ ３
荧光定量PCR技术的原理与应用
荧光定量PCR技术的原理与应用王志平【摘要】荧光定量PCR技术是在普通PCR技术基础上建立起来的一种利用标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.它特异性强、灵敏度高、操作简便、快速高效,在疾病诊断、食品检测、环境监测以及生物学研究等方面具有广泛的应用前景.在阐述荧光定量PCR技术原理的基础上,系统论述了该技术在各方面的应用.%Real-time flurecenece quantitive PCR is developed on the basis of ordinary PCR,which quantifies the template by means of standard curve.It is specific,sensitive,simple,fast and efficient.The mechanism of real-time flurecenece quantitive PCR,and systematically demonstrated its application in medical diagnosis,food testing,environmental monitoring,biological research and other fields was reviewed.【期刊名称】《渭南师范学院学报》【年(卷),期】2012(000)010【总页数】4页(P61-64)【关键词】荧光定量PCR;原理;应用【作者】王志平【作者单位】渭南师范学院化学与生命科学学院,陕西渭南714000 陕西省多河流湿地生态环境重点实验室,陕西渭南714000【正文语种】中文【中图分类】Q589聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术是一项DNA体外扩增技术，主要应用于特异性基因的检测以及生物鉴定等方面.1983年PCR技术发明以来，生物技术迅猛发展.早期的PCR定量方法都是基于产物的终点浓度测定，20世纪90年代实时(real-time)PCR的发明推动了PCR定量技术的发展与应用［1－2］.荧光定量PCR是在普通PCR技术基础上建立的一种核酸定量技术，即在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累对整个PCR进程进行实时监测，并根据标准曲线对未知模板进行定量.目前，该技术已广泛应用于疾病诊断、食品检测、环境监测以及分子生物学研究等领域，而且其应用范围仍在不断拓展.1 荧光定量PCR技术原理在荧光定量PCR反应体系中加入一种荧光化学物质，目前，最常用的是SYBR GreenⅠ染料，它能与双链DNA小沟部位结合，而且具有绿色激发波长.在PCR进程的复制和延伸阶段，该染料插入DNA双链中发出荧光，在变性阶段，由于DNA双链解开，染料从DNA分子上游离下来而不产生荧光，因此荧光信号的强弱与双链DNA的量成正比.PCR进程中，随着产物的积累，荧光信号的强度等比加强.每经过一次循环，收集一次荧光信号，即可得到一个荧光扩增曲线(图1)，根据荧光强度的变化即可监测产物量的变化.通常，荧光扩增曲线可分为三个阶段，即荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期.在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此可以在该阶段进行定量分析.为了便于对所检测样本进行比较，在指数期需要设定一个荧光信号的阈值.检测到的荧光信号超过阈值则被认为是真正的信号.荧光信号由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数称为Ct值.模板的Ct值与其起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，则Ct值越小(图2).利用已知起始拷贝数的标准品及其相应的Ct值可绘制出标准曲线，测得未知样品的Ct值后，根据标准曲线便可准确计算出该样品的起始拷贝数.2 荧光定量PCR技术的应用定量PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，有效解决了PCR污染和定量不准确等问题.首先，该技术特异性强、灵敏度高，可以对小于5拷贝的靶基因序列进行定量分析，也可以对表达差异极其微小的基因进行比较分析;其次，该技术定量准确，整个过程在全封闭的容器中进行反应，不需要对产物进行染色以及电泳检测等后续操作，极大地降低了交叉污染的可能性;另外，该技术简便快速高效，便于高通量自动分析［3］，已成为科学研究与生产实践的重要工具之一.图1 荧光定量PCR的扩增曲线图2 模板量与Ct值的关系2.1 在疾病诊断与治疗中的应用在疾病诊断中，样品内病原体达到一定数量才具有临床意义，因此必须对样品中的病原体进行定量才能作为诊断依据，并为药物治疗以及后续观察提供参考.传统PCR技术及凝胶电泳在病原体的定性检测中具有较高灵敏度，然而却不能实现病原体的准确定量.相比之下，定量PCR技术在疾病诊断与治疗的应用却逐步得到了推广.目前，荧光定量PCR技术已成功应用于人类乳头瘤病毒、肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒等，以及结核杆菌、支原体、衣原体等多中病原体的检测研究［4］.例如，Kessler等发现利用定量PCR技术可以对乙型肝炎病毒感染的不同程度进行鉴定，从而为后续治疗提供参考依据［5］.癌基因在致癌因子作用下表达增加或突变通常是在肿瘤发生早期和良性阶段，导致肿瘤很难被及时诊断与治疗.荧光定量PCR技术的发展与应用则能够有效解决这一技术难题，它不但能够有效检测癌基因的突变，而且能够对癌基因的表达水平进行准确定量，从而用于肿瘤的早期诊断、分型、分期以及预后判断.例如，Ferrari等发现可以将癌基因在盆腔淋巴结中的表达情况作为前列腺癌治疗的预后标志，对肿瘤转移情况进行分析［6］.另外，利用该技术可观测用药前后及复发时肿瘤细胞中耐药基因的表达变化，为研究肿瘤耐药、指导临床治疗提供有效途径［7］.荧光定量PCR技术在兽医研究中也得到越来越广泛的应用.例如，关于猫冠状病毒和莱姆病等多种病原体的荧光定量PCR检测方法均已建立.有研究表明，用定量PCR能够快速灵敏地检测鸡传染性支气管炎病毒［8］，牛伟等建立了定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的荧光定量PCR方法［9］，从而为相关疾病的诊断与治疗提供有效依据.在新药开发的研究过程中，荧光定量PCR技术可以快速了解药物对疾病进程的影响，为新药开发节约大量的人力、时间和资金.2.2 在食品检测方面的应用目前，荧光定量PCR技术已广泛应用于食源微生物、食品过敏源、转基因食品以及动物源性食品的检测等方面.邵彪等发现利用多重荧光定量PCR可以在同一反应体系下同时对食品中多种污染菌进行准确快速的检测［10］.在食品发酵过程中，利用荧光定量PCR技术可以直接检测发酵产物中的微生物种群，而不需要培养活菌，因此可以缩短检测程序，提高检测效率.在转基因食品检测方面，裘劼人等验证了利用荧光定量PCR技术检测转基因植物中外源基因拷贝数的可行性［11］.Muleg等利用该技术检测葡萄中曲霉菌的污染程度［12］.日本和美国等13个实验室运用荧光定量PCR技术对转基因玉米和转基因大豆进行了定量研究，结果表明，荧光定量PCR技术可以应用于转基因作物标识制度的实际检测［13］.2.3 在环境监测方面的应用环境中存在许多致病微生物，它们与疾病传播密切相关.因此，定期检测环境中致病微生物的种类、数量及其变化趋势对于传染病的预防和控制具有重要意义.与传统的环境微生物病原体检测方法相比，荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、快速简便等优点.Brooks等的研究表明，定量PCR技术对甲肝病毒的定性及定量测定均有很高的精确度［14］.Rebecca等建立了利用定量PCR技术对易引起水传播疾病的贾第虫和隐孢子虫进行定量分析的方法［15］.李伟等建立了应用荧光PCR技术定量检测土壤和脏器中炭疽芽孢杆菌的方法［16］.Grtintzig等利用荧光定量PCR技术检测环境样品中功能基因(反硝化亚硝酸盐还原酶基因)的丰度，进而分析不同环境中施氏假单胞菌的丰度［17］.何闪英和吴小刚建立了定量检测赤潮生物圆海链藻的实时定量PCR方法，为赤潮研究提供了有效的检测技术［18］.此外，利用荧光定量PCR技术还可以定量研究微生物的种类组成及数量变化，进而深入探索微生物群落与环境因子之间的相互作用及其动态变化过程，为预测不同环境条件下微生物种类组成与数量变化趋势提供依据，进而为传染病的预防和控制提供参考.例如，Tay和Hemond利用定量PCR技术检测了两种甲苯降解菌自养黄色杆菌和分支杆菌在污染区和非污染区的数量分布情况以及两种微生物数量的季节性变动［19］.2.4 在遗传学和分子生物学研究中的应用在遗传学研究中，利用荧光定量PCR技术可以进行点突变分析、突变基因检测、等位基因分析、DNA甲基化检测以及单核苷酸多态性分析等方面的研究.例如，利用荧光定量PCR并结合相关测序方法，可以对已知DNA序列的突变基因和序列多态性进行定位，也可通过扩增DNA限制性位点的方法来检测遗传变异.Bjerre 等利用定量PCR技术进行了单核苷酸多态性和基因突变方面的研究［20］.若在扩增之前对DNA进行处理，然后用特异的引物和探针可以区分甲基化和非甲基化的DNA，从而研究不同处理对DNA结构的影响.另有研究表明，利用荧光定量PCR 技术还可以有效鉴定杂合子和纯合子［21］.在分子生物学研究中，荧光定量PCR技术主要用于基因表达研究.应用荧光定量PCR技术可对mRNA表达水平和动态变化进行研究，例如mRNA的直接定量分析、突变等位基因检测、mRNA剪接变异体的检测等，其中，在定量mRNA表达水平的研究中应用最为普遍.此外，该方法还用于细胞凋亡的研究.例如，路钊等运用该技术研究了BATF2/SARI转录因子诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制［22］. 2.5 在法医鉴定中的应用目前，荧光定量PCR技术在法医上主要应用于亲子鉴定和个人识别，从血痕、精斑、毛发、骨或其他组织中提取DNA后，通过DNA分型或DNA指纹可以进行亲子鉴定或个人识别，从而为案例侦破提供有效的法律依据.3 结语荧光定量PCR技术是近年发展起来的一种新的DNA定量检测方法，可以弥补普通PCR的许多不足，在传统医学、食品检验、环境监测及生物学研究等领域的应用逐步得到推广.随着荧光定量PCR技术的不断改进和完善，它将在基础研究领域和生产实践中发挥出更大的应用价值.【相关文献】［1］Guan H，Yang K.RNA isolation and real-time quantitative RT-PCR［J］.Methods Mol Biol，2008，456：259 －270.［2］Arya M，Shergill I S，Williamson M，et al.Basic principles of real-time quantitative PCR［J］.Expert Rev Mol Diagn，2005，5(2)：209 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染 的 良好 而 敏感 的筛 选 指 标 ； 妇 血 清 ＨＢ ＮＡ 高 含 量 是 乙 肝 宫 内感 染 的高 危 因素 。 孕 ＶＤ 【 键 词 】 乙 型肝 炎 病毒 ； 宫 内感 染 ； 荧 光 定 量 Ｐ Ｒ 关 Ｃ
中 图分 类 号 ： ４ ６ ６ Ｒ ４．１ 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ６ ２９ ５ （ ０ ７ ０ — ４ ０ １ ７ —４ ５ ２ ０ ） ２ ９ — ３
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黄松 洁 ， 华斌 山 医院 ， 建厦 门 ３ １ ０ ） 厦 福 ６ ０ ４
【 要 】 目的 摘 意义。方法 探 讨 荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应 （ Ｑ Ｐ Ｒ） 乙型 肝 炎 病 毒 （ Ｖ） 内感 染 监 测 中 的作 用 及 临 床 Ｆ －Ｃ 在 ＨＢ 宫 新 生 儿 脐 带 血
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