SDS-PAGE凝胶电泳操作
一、常规试剂的配制
1. 30%聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺150g ,甲叉双丙烯酰胺 4g,双蒸水500ml
,滤纸过滤后， 棕色瓶避光
4 C
保存；
2. L，pH Tris-HCI 分离胶缓冲液：Tris，用1mol/L HCl定容至100ml，棕色瓶避光4 C
保存；
3. L, pH Tris-HCl 分离胶缓冲液：12g Tris，用1mol/L 调pH至100ml，棕色瓶避光 4 C
保存；
4. 10% SDS溶液：10g SDS加水定容至100ml
，完全溶解室温保存；
5. 10% AP溶液：AP （过硫酸铵）加水定容至 1ml
，用前新鲜配制；
6. 1X SDS-PAGE电泳缓冲液：25mM Tris （ L），192mM甘 氨酸（L ），%SDS（ 1g/L ），pH
;
7. 染色液 ： 考马斯亮蓝 R-250 溶解于 45ml 甲醇， 45ml 水， 10ml
冰醋酸，过滤除去杂质；
8. 脱色液 ： 45ml 甲醇， 45ml 水， 10ml
冰醋酸；
9. 固定液 ： 50ml 甲醇， 40ml 水， 10ml
冰醋酸；
10. 2X SDS-PAGEh样缓冲液：10%SDS， Tris-HCl （ pH ），甘油，1% 溴酚兰 10 卩 L，3 -
疏基
乙醇100卩L，加水定容至1ml，分装后-20 C保存。
二、样品的处理
1.
蛋白含量较低的酶制剂或原料样品
（ 1 ）粉剂（或颗粒）样品
称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解 仆（搅拌时间可根据实际情况进行增减） ，
4000rpm离心10min，取离心上清液等体积加入 20%的三氯乙酸聚沉 30min
，离心，弃去离心
上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀， 4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤
液吹干，加入适量（1-3ml ） PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。
（ 2）液体样品
液体样品经离心后，取离心上清液等体积加入 20%的三氯乙酸聚沉 30min，离心，弃去
离心上清液，用 70%勺丙酮溶液洗涤沉淀， 4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮 洗涤液吹
干，加入适量（1-3ml ） PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。
2.
蛋白含量相对较高勺酶制剂或原料样品
（ 1 ）粉剂（或颗粒）样品
称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解 仆（搅拌时间可根据实际情况进行增减） ，
4000rpm离心10min
，取离心上清液用于电泳实验。
（ 2）液体样品
液体样品经离心后，取离心上清液用于电泳实验。
3.
未知样品
对未知样品进行归类（是否为酶制剂，是哪一类酶） ，根据已知电泳图谱确定该类物质
能跑出清晰电泳条带的蛋白浓度范围， 在对未知样品进行电泳实验前， 测定其蛋白含量，根
据其结果进行适当处理。
三、凝胶的配制
1.
设备检漏
将电泳玻璃板按顺序装好并固定，在电泳玻璃板间注满蒸馏水，静置 15-20min，观察
是否有水浸出，若无则进行下一步操作， 反之，则拆除进行重新安装， 并重复检漏至无液体
浸出。
注：如样品数量不多，一块凝胶板就已足够，则另一边使用凝胶隔板，防止跑胶时短路。
2.
分离胶的制备
根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，不同浓度的 SDS-PAGE分离胶的最佳
分离范围如下表
蛋白质分子量范围（KD） 适宜的凝胶浓度（
%
>100
8
30-100
10
10-30
12
<10 15
将检漏的蒸馏水倒出，按下表进行 SDS-PAGE分离胶的配制（使用凝胶试剂盒）
电泳凝胶浓度
试剂
8% 10% 12% 15%
HzO (ml
)
30%Acr-Bis (29:1 ) ( ml
)
L ( pH ) (ml
)
10%SDS( ml
)
10%AP( ml
)
TEME” l ) 4 4 4 4
总体积（ml）
10
注：如室温高于 30 C，可适量减少 TEMED30-50%防止胶过快凝结;
如室温低于20C，可适量增加 TEMED30-50%防止胶过慢凝结。
常用分离胶的浓度为 10%按上表进行配制，所有试剂加入烧杯中，充分混匀后，迅速 进行注胶，
注胶过程要平稳，避免产生气泡， 注胶完成后用蒸馏水进行水封 （水封的目的是
为了使分离胶上延平直，并排除气泡，且防止氧化） ，凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形
成清晰的界面。
3.
浓缩胶的制备
分离胶制备完成后，静置 60-90min，确保分离胶凝结完全后，倒出水封液体并用滤纸
把剩余的水分吸干，按下表进行 SDS-PAGE浓缩胶的配制。
试剂
浓度（
5%
HO ( ml) 4
2
30%Acr-Bis (29:1 ) ( ml) 1
L (pH ) ( ml) 1
10%SD(卩 l ) 80 40
10%AP(卩l) 60 30
TEME” l ) 8 4
总体积（ml）
6
3
所有试剂加入烧杯中， 充分混匀后，连续平稳加入浓缩胶至离边缘 5mm处，迅速插入样
梳（样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平） ，静置40-60min。
4.
制样
吸取经预处理后样品 25 ^1与25 ^1上样缓冲液混合均匀后，于沸水煮 3-5min去掉亚
稳态聚合，冷却后 4000rpm离心4min。
5.
上样
浓缩胶凝结后，向上槽内倒入适量电泳缓冲液， 拔出样梳（要使锯齿孔内的气泡全部排
出，否则会影响加样效果），向每孔内加样10卩I （加样时移液枪要始终竖直，且加样迅速， 为避免
边缘效应，最好选取中部孔注样） 。
6.
跑胶
加样完成后，在电泳槽内加入适量电泳缓冲液，连接好冷凝水，接通电源，进行电泳，
稳压90V，电泳90min左右，进入分离胶后，电压改为 120V,待溴酚蓝距凝胶边缘约
5mm
时，停止电泳。
7.
凝胶板剥离与固定
电泳结束后，取开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内（剥胶时要小心， 将凝
胶保持完好），用蒸馏水小心清洗 1-3次，加入固定液进行固定 40-60min，倒出固定液，蒸 馏水清洗
3-5
次。
8.
染色
固定清洗结束后，倒入染色液，染色 40-60min。
9.
脱色
染色结束后，蒸馏水清洗 3-5次，倒入脱色液进行脱色， 30-60min后更换1次脱色液
后，脱色至蛋白条带清晰即可。
10.
清洗
电泳结束后， 将电泳玻璃版及烧杯仔细清洗， 并用蒸馏水进行漂洗后， 归
置原位。
将电泳所用物品
SDS-PAGE操作方法要点
SDS-PAGE教程1 SDS-PAGE原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4 g去污剂结合。
当分子量在15 KDa 到200 KDa之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：log MW = K – bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE [Laemmli法]这种方法帖出来，大家是不是感觉非常的陌生呢？其实这种发方法很普遍，现在大部分的实验室都是用Laemmli法跑电泳的。
如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于Laemmli于1970年发表在nature上的一篇文章中的方法，这篇文章很特别,不仅被引用的次数较多，而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳方法上的提出和改进问题，而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳分析方法而已，所以阐述如何操作的文字只有那么一小段（但相当经典），这是SDS-PAGE（不连续系统）的首次成功应用。
现在我们在实验室进行的SDS-PAGE试剂的配方仍然是沿用了它的数据,许多论文在描述其SDS-PAGE时引用Laemmli方法，目前常用的具有浓缩胶和分离胶的不连续SDS-PAGE的基础的确来自Laemmli方法，但也略有差别例如一些缓冲液的具体组成。
你也许会恍然大悟：原来我们用的就是Laemmli！SDS-PAGE各试剂配制方法30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide【组分浓度】【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。
sds-page凝胶电泳原理
sds-page凝胶电泳原理SDS-凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分析和分离技术。
它基于蛋白质在电场中的迁移速率与分子质量之间的关系，通过将蛋白质样品加入SDS变性和还原缓冲液，并进行蛋白质的电泳分离，可以实现蛋白质分子量的估计和蛋白质组分的分离。
以下将详细介绍SDS-凝胶电泳的原理。
一、样品处理：在进行SDS-凝胶电泳之前，需要对样品进行处理，包括蛋白质的变性和还原。
这样做的目的是将蛋白质分子展开成线性构象，使各种蛋白质以相似的形式进入凝胶，并消除了蛋白质修饰对迁移速率的影响。
1.变性：加入SDS变性缓冲液。
SDS是一种带负电荷的表面活性剂，可以与蛋白质相互作用，让蛋白质线性展开，并赋予蛋白质负电荷。
在变性缓冲液中通常还会包含甘油和十二烷基硫酸钠，以提高蛋白质的溶解度。
2. 还原：加入还原剂。
通常使用二巯基乙醇（2-mercaptoethanol）或二巯基丙烷（Dithiothreitol, DTT）等还原剂，以破坏蛋白质的二硫键，消除蛋白质中的多肽链的二级结构。
二、凝胶制备：SDS-的凝胶通常由两种不同浓度的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）单体制备而成，其中较稀的为分离凝胶，较浓的为聚合凝胶。
聚丙烯酰胺是由甲基丙烯酰胺（acrylamide）和交联剂（常用的是二甲基丙烯酰胺）共聚合而成的。
1. 分离凝胶（stacking gel）：通常为4-15%（w/v）的聚丙烯酰胺。
分离凝胶中加入的缓冲液pH稍微较低，以产生较高的电场强度，使蛋白质迅速进入聚合凝胶。
2. 聚合凝胶（resolving gel）：通常为8-20%（w/v）的聚丙烯酰胺。
聚合凝胶中加入的缓冲液pH较高，以产生较低的电场强度，使蛋白质在其中进行分离。
三、电泳操作：1.样品加载：将处理后的蛋白质样品加载到凝胶孔上。
SDS-PAGE超详细实验步骤
SDS-PAGE超详细实验步骤1定义SDS-PAGE：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中SDS为十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate），PAGE为聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electropheresis）；该电泳用于分离蛋白质和寡核苷酸。
1.1试验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质的静电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
1.2试验相关设备与试剂配制1.2.1相关设备(1)电泳仪(2)凝胶成像仪(3)干浴器(4)微型离心机(5)电泳槽1.2.2试剂配制(1)染色液：用量筒分别量取250ml甲醇或乙醇、80ml乙酸；用电子天平称取考马斯亮蓝R250 1.25g，再将其一一加到1000ml蓝盖瓶中（加入顺序为考马斯亮蓝R250，甲醇或者乙醇，蒸馏水，乙酸），用纯化水补足至1000ml，充分混合均匀后进行用滤纸过滤，收集滤液备用。
（当过滤速度变慢时及时更换滤纸，快速过完，不可隔夜以免影响染色效果）(2)脱色液：用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸、670ml纯化水加入烧杯中，待溶液混合均匀后加入蓝盖瓶中。
(3)1X电泳缓冲液：分别用量筒量取10X电泳缓冲液100ml、900ml纯化水加入烧杯中，混合均匀既得。
（注：以上甲醇、乙醇、乙酸均用分析级试剂，纯度>95.0%）1.3电泳试验步骤1.3.1电泳胶配制（配方如表1）：表1分离胶浓度(10ml) 6%(ml) 8%(ml) 10%(ml) 12%(ml) 15%(ml) 去离子水 5.4 4.7 4.1 3.4 2.4 30%Acrylamide mix 2.0 2.7 3.3 4.0 5.04X Resolving-gel buffer 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 10%SDS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.110%APS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1TEMED 0.008 0.006 0.004 0.004 0.004 表2堆积胶(ml) (ml)去离子水 6.930%Acrylamide mix 1.78X Stacking-gel buffer 1.2510%SDS 0.110%APS 0.1TEMED 0.01按照表1配方将所需浓度的分离胶配置好（加入顺序由上到下），加入到电泳胶配胶板中（约3/4配胶版高度），加入5mm高的纯化水，等待30-60min使分离胶凝固（可微微倾斜看胶面是否凝固聚合）。
凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
3. 实验器材
• 垂直板电泳装置 • 直流稳压电源 • 移液管
• 滤纸 • 微量注射器 • 大培养皿
各部分凝胶配制
分离胶(10%.5ml)
浓缩胶(5%.3ml)
H2O
2.6ml
Acr
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
30%, 1.7ml
0.7ml 10%, 1.5ml
Buffer 3.0mol/L pH=8.8 Tris-HCl 0.6ml 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.75ml
根据说明书处理标准蛋白 样品：称3mg样品，加2 ml蒸馏水溶解。
2.实验试剂
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。
（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，
二. 实验原理
• SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别
是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影 响它们结合的因素主要有三个：
1) 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于
1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下 时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋 白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充 分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）测定蛋白质分子量
授课教师：周杰
一. 实验目的
• 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量
的原理。
• 掌握垂直板电泳的操作方法。 • 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作规程
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作----(纯度检测)一.目的：检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。
二.依据：《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。
三. 职责：质量控制部。
四.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。
五. 器皿与耗品：所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。
tube、tip一次性使用。
六. 仪器设备：电泳仪（电源1--300V）电泳槽灌胶模具染色具凝胶扫描仪七. 环境要求：相对洁净环境，室温。
八. 溶液的配置：1.A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）2.B液: 1MTris·HCl pH6.8称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）3.C液: 30%丙烯酰胺称取29.2g丙烯酰胺(分析纯),0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解,再定容至100 ml,用滤纸过滤,。
贴上标贴，避光4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）4.D液:10%SDS称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）5.E液:10%过硫酸胺称取10g过硫酸胺(分析纯), 用超纯水溶解至100 ml。
贴上标贴，-20℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）6.F液:TEMED(amersco)7.电泳缓冲液(10X)称取60.57g Tris碱(分析纯),288.268g甘氨酸(分析纯),20gSDS(分析纯),加超纯水定容至2000ml，临用前加超纯水稀释10倍，贴上标贴，室温储存。
sdspage实验报告
sdspage实验报告SDS-PAGE实验报告引言：SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
通过SDS（十二烷基硫酸钠）的作用，可以使蛋白质在电泳过程中带有负电荷，从而使其按照分子量大小在凝胶上进行分离。
本实验旨在通过SDS-PAGE技术分离和分析不同来源的蛋白质样品，探究其分子量和纯度。
材料与方法：1. 样品制备：从不同来源（如细菌、植物、动物）获得蛋白质样品，并进行样品的提取和纯化。
2. SDS-PAGE凝胶制备：根据所需分离范围选择合适的凝胶浓度，并制备上胶液和下胶液。
3. 样品处理：将样品与样品缓冲液混合，并加入还原剂和SDS。
4. 电泳条件：将样品加载到凝胶孔中，进行电泳操作。
设置适当的电压和时间。
5. 凝胶染色：将电泳后的凝胶进行染色，以可视化蛋白质带。
结果与讨论：通过SDS-PAGE技术，我们成功地分离和分析了不同来源的蛋白质样品。
在电泳过程中，蛋白质样品在电场作用下向阳极迁移，其迁移速率与其分子量成反比。
因此，我们可以根据蛋白质在凝胶上的迁移距离来推测其分子量。
观察到的凝胶图像显示出多个蛋白质带，每个带代表一个具有特定分子量的蛋白质。
通过与已知分子量标准品进行比较，我们可以推断出样品中蛋白质的分子量范围。
同时，通过比较不同来源的样品，我们可以观察到它们之间的差异。
在某些情况下，我们可能观察到一些额外的带，这可能是由于蛋白质的不同修饰或附加物所致。
例如，糖基化的蛋白质可能会在凝胶上显示出多个带，每个带代表不同程度的糖基化。
此外，我们还可以通过观察蛋白质带的强度来推断其纯度。
如果某个蛋白质带非常明亮且没有其他杂质带的干扰，那么可以认为该蛋白质具有较高的纯度。
相反，如果某个带非常弱或有其他带的干扰，那么可能表示该样品中存在其他蛋白质或杂质。
结论：通过SDS-PAGE技术，我们成功地分离和分析了不同来源的蛋白质样品。
通过观察蛋白质带的位置、分子量范围和强度，我们可以推断蛋白质的分子量和纯度。
实验十聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质
实验⼗聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋⽩质实验⼗聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋⽩质【实验⽬的】1. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；2. 掌握⽤此法分离蛋⽩质组分的操作⽅法。
【实验原理】在⽣物化学、分⼦⽣物学和基因（遗传）⼯程实验中，常常要进⾏蛋⽩质和核酸的分离⼯作。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为⽀持介质进⾏蛋⽩质或核酸分离的⼀种电泳⽅法。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作⽤下聚合交联⽽成的三维⽹状结构的凝胶。
通过改变单体浓度与交联剂的⽐例，可以得到不同孔径的凝胶，⽤于分离分⼦量⼤⼩不同的物质。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采⽤过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N－四甲基⼄⼆胺（简称TEMED）。
通常控制这⼆种溶液的⽤量，使聚合在1⼩时内完成。
（2）光聚合：通常⽤核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制聚合时间，也可加⼊TEMED 加速反应。
聚丙烯酰胺凝电泳常分为⼆⼤类：第⼀类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第⼆类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。
⼀般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）；②凝胶的分⼦筛效应（凝胶的⽹状结构及电泳物的⼤⼩形状不同所致）。
③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。
因此，样品分离效果好，分辨率⾼。
SDS即⼗⼆烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS）是阴离⼦表⾯活性剂，它能以⼀定⽐例和蛋⽩质结合，形成⼀种SDS-蛋⽩质复合物。
这时，蛋⽩质即带有⼤量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从⽽使天然蛋⽩质分⼦间的电荷差别降低仍⾄消除。
SDS-PAGE电泳注意事项
SDS-PAGE电泳的操作规程一、样品处理取适量体积的样品溶液（样品含约为0.5-5ug），加入5×样品缓冲液，用振荡器混匀，于95℃水浴中煮5分钟，并于离心机中12000r/min离心5分钟待上样用，煮完后室温冷却。
非还原不用煮。
二、配制凝胶溶液和灌胶A、预先计算好所需浓度胶的体积及配胶所需要的各种试剂的体积，按这些数据依次加入试剂并混匀，然后灌入预先装好并且用双蒸水试漏过的板层中（先是分离胶），在胶的上面加一小层水饱和的异丁醇，置于平整的桌面让其自然凝固。
B、待分离胶凝固后（以胶与异丁醇界面有折射为准），到掉上层的异丁醇，用双蒸水冲洗三次并用吸水纸吸干。
然后灌入预定浓度的、按步骤A配制的浓缩胶，插入加样梳（注意赶走气泡），平置于水平桌面，自然凝固。
C、待凝固后，放置1小时使胶充分交联凝固。
三、电泳1、拔掉梳子，用双蒸水冲洗加样孔，去除杂质及未凝固的胶溶液，然后装好电泳装置，加入电泳缓冲液（如阴阳极缓冲液不同，需要分别加入相应的缓冲液，另外，阴阳极电泳缓冲液不要混在一起）2、用20ul的微量加样枪上样。
3、电泳开始时，恒压模式下用80V的电压电泳，待指示剂溴酚蓝进入分离胶时，把电压提高到130-150V左右，直到溴酚蓝快走出分离胶时，终止电泳，切断电源，拆下凝胶分别切下上、下角标记胶的方向及区别是哪一块胶。
4、清洗胶架、玻璃及其他附件。
四、染色、脱色及结果的分析与保存1、把剥下的胶浸入染色液中，放在脱色摇床上摇1小时。
2、取出凝胶块，用蒸馏水冲洗干净，然后置于脱色液中脱色，摇荡脱色直到底色基本脱完。
3、脱完色的胶用凝胶成像系统照相并进行数据分析处理。
一、试剂的使用与管理1、30%的丙烯酰胺贮存液（棕色瓶中保存）、pH8.8的缓冲液、PH6.8的缓冲液、10%的AP、TEMED用完后请放回4℃冰箱。
2、2×上样缓冲液，用完后请存放于-20℃冰箱的指定位置。
3、中分子量marker请按照说明书配制，配制后于95℃水浴中煮5分钟，冷却后离心，分装到eppendorf管中，每管10 U L。
sds page凝胶电泳sop
原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它具有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。
而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。
这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。
1.溶液配制1.1.30%（W/V）丙烯酰胺+0.8%双丙烯酰胺用天平称取15g丙烯酰胺、0.4g双丙烯酰胺，加入50ml 去离子水溶解混匀。
生物化学实验十一 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测
实验十一SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子质量一、目的要求学习和掌握采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子质量的基本原理和方法。
二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合交联形成的三围网状结构。
通过改变单体Acr浓度或单体与交联剂的比例可以控制凝胶孔径的大小，这取决于两个重要的参数T和C，其中T是两个单体（Acr和Bis）的总百分浓度，C是与总浓度有关的交联百分浓度。
T=（a+b）/m×100(%) C=b/(a+b)×100(%)式中，a为Acr质量（g）；b为Bis质量（g）；m为水或缓冲液的终体积（mL）。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续的和不连续系统两种。
在连续系统中，电泳槽中缓冲液的pH与凝胶中一致，而在不连续系统中上述两者的pH不相同，不连续系统的分辨率较高。
从凝胶形式上可分为柱式或板式。
将凝胶装于垂直的玻璃管中进行电泳分离称柱式电泳，此法制备凝胶方便，样品需要量少，凝胶条便于长期保存；板式电泳的优点是可以在同一凝胶板上同时检测盒比较多个样品，在平板电泳的基础上还建立了分辨率更高的双向电泳。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统具备三种效应，因此大大提高了分辨率。
(1)浓缩效应：在电泳开始时，样品在浓缩胶与分离胶界面上形成了高度压缩的薄层，作为在分离胶中进一步分离的起始样层，有时甚至能浓缩几百倍。
(2)电荷效应：蛋白质混合物在界面处被高度浓缩，形成一狭小的高浓度的蛋白质区带。
由于每种蛋白质分子所带的电荷不同，因而泳动率不同，各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的蛋白质区带。
(3)分子筛效应：当蛋白质分子通过浓缩胶进入分离胶时，颗粒小、呈球形的样品分子移动快，柯利达、形状不规则的分子在通过凝胶空洞时的阻力大，移动就缓慢。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同的蛋白质分子的主要极力为上述的电荷效应和分子筛效应，即这些分子所带净电荷的差异和分子质量大小的不同。