重组酵母E22植酸酶的分离纯化及酶学性质研究

第30卷第11期 西南大学学报(自然科学版) 2008年11月Vol130　No111Journal of Sout hwest University(Nat ural Science Edition)Nov1　2008文章编号:167329868(2008)1120074207重组酵母E22植酸酶的分离纯化及酶学性质研究李春明1,　彭远义211西南大学资源环境学院,重庆400715;21西南大学动物科技学院重庆市牧草与草食家畜重点实验室,重庆400715摘要:对用黑曲霉植酸酶基因构建的一株重组酵母E22所产植酸酶进行分离纯化并研究各种酶学性质,表明E22植酸酶分别在p H215～310和p H515左右具有2个最适p H峰,有活性p H范围为p H210～715,p H215时的最适温度为45℃左右、对植酸钠的Km值为010002mol/L、比活为49332817u/mg、受Fe2+抑制,p H515时的最适温度为55℃、对植酸钠的Km值为010001mol/L、比活为62437612u/mg、受Ca2+和Zn2+抑制,85℃热处理10min酶活性保留70%,p H215下用胃蛋白酶、p H515下用胰蛋白酶处理6h后酶活均保留90%左右,分子量为6117KD,等电点在415到510之间.关　键　词:毕赤酵母;植酸酶;纯化;性质中图分类号:S51211;S14415文献标识码:A植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇和磷酸及磷酸盐的一类酶,将其添加到单胃动物植物性食品与饲料中,可以使植酸水解成肌醇和磷酸而被单胃动物所利用,而且释放被植酸络合的Ca2+,Mg2+,Zn2+等矿物元素和一些蛋白质,从而解除植酸的抗营养作用、提高食品与饲料的利用率、促进动物生长、减少动物粪便中磷的残留量、降低环境的磷污染.本实验室筛选到一株有较高植酸酶活性的黑曲霉A3214[1]并对其进行诱变获得植酸酶活性提高2213%[2]的诱变株N14,将N14的植酸酶基因导入毕赤酵母获得的一株植酸酶表达量达14395813u/mL 的重组酵母E22[3].本文报道对E22所产植酸酶进行分离纯化并研究各种酶学性质的情况.1　材料与方法111　菌 种本实验室用黑曲霉N14的植酸酶基因构建的植酸酶基因工程酵母菌E22.112　主要药品与试剂植酸钠,离子交换介质D EA E2sep harose fast flow,磷钼酸铵法测定植酸酶活性所需试剂,SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂,蛋白质银染所需试剂,考马斯亮蓝G250,聚乙二醇.113　方　法11311　植酸酶活性测定参照张若寒[4]的钒钼酸铵法略加改动进行测定,以1min从010051mol/L植酸钠溶液中释放1nmol 无机磷的酶活力为1个酶活单位(u).3收稿日期:2008204208基金项目:重庆市科委攻关资助项目(20016755).作者简介:李春明(19702),男,四川西充人,讲师,硕士,主要从事微生物学教学与研究工作.通讯作者:彭远义,教授,硕士生导师.11312　植酸酶的分离纯化粗酶液的获得:取斜面培养基上生长的E22接种于2瓶装有10mLBM GY 培养液的100mL 的摇瓶中,28℃振荡培养至OD600nm 达到3以上,无菌条件下将菌液3000r/min 离心5min ,收集菌体,转接到2瓶装有10mLBMM Y 培养液的100mL 摇瓶中,每天向瓶内添加015mL 过滤除菌的甲醇,28℃振荡培养120h 后过滤离心获得发酵上清液.沉淀:在粗酶液中加入2倍体积预冷至-20℃的丙酮,混匀后在-20℃冰箱中放置2h 以上,然后6000r/min 离心20min ,倒去上清液,将残留丙酮吹干,加少量蒸馏水溶解沉淀.植酸酶离子交换吸附试验及等电点测定:每5mL 管中加入1mLD EA E 2sep haro se fast flow 离子交换剂,分别用0101mol/L 的p H4,415,5,6醋酸缓冲液充分平衡,然后取经丙酮沉淀浓缩的植酸酶适量分别加入各管中充分混合吸附,离心后取上清液(吸附上清)待测,用相应p H 的缓冲液洗涤交换剂6次,用加011mol/L NaCl 的p H210盐酸2甘氨酸缓冲液洗脱,离心后取上清液(洗脱上清).对吸附上清和洗脱上清测活.离子交换分离:将经过丙酮沉淀所得酶液上sep haro se 离子交换柱,用0105mol/L 的缓冲液洗脱或者0～015mol/L 的NaCl 梯度洗脱,分部收集后检测植酸酶活性,保存各管有活性酶液.SDS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳:将离子交换各管有活性酶液进行10%SDS 2聚丙烯凝胶电泳,将单一条带者视为纯酶液保存;若无单一条带者,则将条带最少的连续数管酶液合并,改进条件后进行新一轮的分子筛或离子交换分离.11313　植酸酶的酶学性质研究植酸酶的最适p H 测定:在37℃和45℃下测定E22植酸酶纯酶在p H 为210,215,310,410,510,515,610,710,810时的酶活性.植酸酶的最适温度测定:在最适p H 下测定E22植酸酶纯酶在温度为37,40,45,50,55,60,65℃时的酶活性.植酸酶的热稳定性测定:将E22植酸酶纯酶在60,70,80,85℃下保温10min 后在37℃、最适p H 下测定酶活性,以不进行热处理的植酸酶的酶活性为100%,计算经过热处理的植酸酶的酶活性保留百分比.植酸酶对蛋白酶的敏感性测定:分别在37℃、p H215下用1mg/mL 胃蛋白酶,在37℃、p H515下用1mg/mL 胰蛋白酶处理E22植酸酶纯酶6h ,然后在37℃、最适p H 下测定处理植酸酶的酶活性,以不进行蛋白酶处理的植酸酶的酶活性为100%,计算经过蛋白酶处理的植酸酶的酶活性保留百分比.无机离子对植酸酶酶活性影响的测定:以日常饲料中各种无机离子的干物质百分含量[5]为参考,换算成在含50%水分的饲料中各种无机离子平均的物质的量浓度,K +,Na +,Ca 2+为01001mol/L ,Mg 2+为010001mol/L ,Fe 2+,Zn 2+为0100001mol/L ,Cu 2+,Mn 2+为01000001mol/L ,以这些无机离子各自平均物质的量浓度的10倍、100倍浓度分别添加这些离子后在37℃、最适p H 下测定E22植酸酶纯酶的酶活性,以不添加离子的植酸酶的酶活性为100%,计算添加这些离子后植酸酶的酶活性百分比.植酸酶对植酸钠的Km 值测定:在37℃、最适p H 、植酸钠浓度分别为010005,0100025,0100005,01000001mol/L 下测定E22植酸酶纯酶的酶活,反应时间为20min ,通过作V -V/[S ]图求出相应植酸酶对植酸钠的Km 值.植酸酶的比活测定:取适当体积的E22植酸酶纯酶液,分别测定其酶活与蛋白质浓度后计算比活.植酸酶的分子量测定:将E22植酸酶纯酶与蛋白质marker 加在同一块聚丙烯酰胺凝胶上一起电泳,利用银染法染色,计算各蛋白条带的迁移率R f ,作蛋白质marker 的L gM 2R f 图,得到回归方程后由R f 值计算E22纯化植酸酶的分子量.2　结果与分析211　植酸酶离子交换吸附试验及等电点测定对E22植酸酶做离子交换吸附试验,吸附上清和洗脱上清的酶活性见表1.57第11期 李春明,等:重组酵母E22植酸酶的分离纯化及酶学性质研究表1　不同pH 吸附及洗脱后上清液的酶活/(u ・mL -1)　p H310p H410p H415p H510p H610吸附上清357193571735611018014洗脱上清1813161924123571735717 可以看出,E22植酸酶在p H415以下时基本上未被吸附而在p H510以上时基本上被全部吸附,可见E22植酸酶的等电点在p H415到p H510之间,为稳妥起见,采用p H515作为上柱吸附p H.王金华等[6]报道由黑曲霉植酸酶基因构建的基因工程酵母植酸酶的等电点为415,与E22植酸酶、N14植酸酶[7]的等电点接近.图1　第16～25管E 22植酸酶酶活212　植酸酶的分离纯化将5mL E22植酸酶发酵上清液用66%丙酮沉淀,恢复到2mL ,超滤后全部上离子交换柱,用500mL0101mol/L 、p H510醋酸缓冲液洗杂,再用400mL 1mol/L 氯化钠+400mL 蒸馏水梯度洗脱,收集每管415mL 共32管,适当稀释后37℃、p H515测定酶活,第16～25管活性见图1.将第17～24管电泳如图2,第17～20管条带均较宽,可能还未纯.将17～24管合并透析后重上离子交换柱,用150mL 015mol/L NaCl +150mL 蒸馏水梯度洗脱,收集每管415mL 共30管,适当稀释后37℃、p H215测定酶活,只有第15～28管有活性(图3).图2　第17～24管蛋白质电泳图3　第15～28管E 22植酸酶酶活将第18～25管电泳(图4),可见第20管和第21管已纯.酶活回收率见表2.表2　E 22植酸酶酶活回收率原液第1次离子交换第2次离子交换纯酶酶活/u 4566091574985156163115627212回收率/%10016141315114213　植酸酶的酶学性质21311　最适p HE22植酸酶在37℃和45℃时都具有2个最适p H 峰,分别在p H215～310和p H515左右,有活性p H 范围为p H210～715(图5),比黑曲霉N14植酸酶[7]的p H 适性大大提高,能够同时适应单胃动物的胃和肠道环境.67西南大学学报(自然科学版) 投稿网址http ://xbgjxt 1swu 1cn 第30卷图4　第18～25管蛋白质电泳21312　最适温度E22植酸酶在p H215时的最适温度为45℃左右;在p H515时的最适温度为55℃,超过55℃后酶活迅速下降(图6).图5　E22植酸酶在不同pH的活性图6　E 22植酸酶在不同温度下的活性21313　热稳定性经热处理后,E22植酸酶的保留酶活具有随热处理温度升高而增加的趋势,从60℃保温10min 的50%左右增加到85℃保温10min 的70%左右(图7),热稳定性明显好于N14植酸酶[7].N14植酸酶的耐热性不能满足饲料高温制粒的要求,但E22植酸酶基本上能满足,虽然和Pasamontes 等[8]报道的烟曲霉A 1f umigat us 植酸酶在100℃保温20min 后酶活保留90%相比还有一定差距.21314　对蛋白酶的敏感性从图8可以看出,E22植酸酶对胃蛋白酶不敏感,酶活保留95%以上;但对胰蛋白酶具有弱敏感性,酶活保留85%左右.E22植酸酶对胃蛋白酶和胰蛋白酶均具有较强的抗性,这对于在单胃动物消化道内保持活性具有非常重要的意义.图7　不同热处理的酶活残留百分比图8　不同蛋白酶消化的酶活残留百分比21315　无机离子对植酸酶活性的影响除Fe 2+外,E22植酸酶在p H215时几乎不受各种离子的抑制(图9);在p H515时明显受100倍浓度的Ca 2+和Zn 2+的抑制(图10).77第11期 李春明,等:重组酵母E22植酸酶的分离纯化及酶学性质研究图9　E22植酸酶在pH 2.5时受各种离子的影响图10　E 22植酸酶在pH 5.5时受各种离子的影响21316　对植酸钠的Km 值E22植酸酶对植酸钠的Km 值在p H215时为010002mol/L (图11),在p H515时为010001mol/L (图12),对植酸钠的亲和力均高于N14植酸酶[7](010004mol/L ).图11　E 22植酸酶在37℃和pH 2.5时对植酸钠的Km 图12　E22植酸酶在37℃和pH 5.5时对植酸钠的Km 21317　比 活E22植酸酶的比活在p H215时为49332817u/mg ,在p H515时为62437612u/mg (表3),约是文献报道的纯化基因工程酵母植酸酶比活(40319u/mg [8]、209955u/mg [9])的3～15倍,约是N14植酸酶[7]比活(14844715u/mg )的3～4倍.表3　E22植酸酶在37℃时的比活p H p H215p H515酶活/(u ・mL -1)2205081127908317蛋白质浓度/(mg ・mL -1)0144701447比活/(u ・mg -1)493328176243761221318　分子量E22植酸酶的SDS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图13所示.各蛋白质条带的迁移率(R f )见表4.表4　E22植酸酶及蛋白质m arker 的Rf 值蛋白质Marker 200KD 130KD 9714KD 6612KD 43KD E22R f 010*********014201700151 作蛋白质marker 的L gM 2R f 图,根据趋势线方程计算得E22植酸酶的分子量为10(-110107×0151+213096)=6117KD 被报道的异源表达黑曲霉植酸酶的分子量在大豆[10]和烟草[11]中约为69KD ～71KD ,在酵母中为6915KD [6],7012KD [8],90KD [13],120KD [12]等,均比出发菌株有所提高.E22植酸酶的分子量和报道的基87西南大学学报(自然科学版) 投稿网址http ://xbgjxt 1swu 1cn 第30卷图13　E22植酸酶及蛋白质m arker 电泳图因工程酵母植酸酶分子量比较接近,高于黑曲霉N14植酸酶[7]的分子量(4714KD ).3　讨 论整体看来,E22植酸酶比N14植酸酶的分子量大大增加、适宜p H 范围大大拓宽、最适温度有所提高、热稳定性有了极大改善、对胃蛋白酶不敏感、受无机离子的抑制大大减小、对植酸钠的亲和力更强.E22植酸酶比N14植酸酶的分子量大大增加、多种酶学性质改善可能是因为E22植酸酶的糖基化程度增加.糖基化对于酶的分子量和热稳定性有显著的影响[12,14,15].通过二级结构预测分析发现,黑曲霉N14植酸酶基因编码的氨基酸序列上有10个潜在的糖基化位点[2],与已报道的A 1nigerNRRL3135、A 1nigerN25和A 1niger963的p hyA 基因所编码的氨基酸序列上的糖基化位点个数(分别为10个、10个和9个)基本相等.奇怪的是在试验温度范围内随着热处理温度升高,E22植酸酶的保留活性反而有所增加.巍威等利用黑曲霉植酸酶基因构建的大肠杆菌工程菌产生的植酸酶具有热激活作用[16],我们这里出现的是否是相同情况,还有待进一步确定.本研究关于无机离子对植酸酶活性影响的考察,在离子浓度的选择上以日常饲料食品中的各种离子的浓度[5]为参考,以添加50%水分的物质的量浓度为标准,选其10倍和100倍浓度进行试验,这样避免了将微量元素与大量元素采用同一浓度进行试验,更能真实地反映各种无机离子对植酸酶活性的影响.本试验采用的Ca 2+浓度为0101mol/L (10倍)和011mol/L (100倍),研究表明Ca 2+对E22植酸酶具有抑制作用,而其它研究报告认为Ca 2+对植酸酶具有促进作用,但他们采用的离子浓度较低,为01000001mol/L [8,17]和01001mol/L 左右[19-20].可能Ca 2+在低浓度对植酸酶的酶活性具有促进作用而在高浓度却具有抑制作用.参考文献:[1]彭远义,马丽苹,李春明,等.植酸酶高产菌株的筛选及其基因分析[J ].农业生物技术学报,2005,13(1):108-113.[2]　彭远义,马丽苹,李春明,等.植酸酶产生菌黑曲霉N14的诱变选育及其基因分析[J ].激光生物学报,2005,14(3):177-183.[3]　彭远义,刘生峰,李春明,等.黑曲霉N14植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达[J ].生物工程学报,2004,20(6):967-971.[4]　张若寒.植酸酶活性的检测方法[J ].中国饲料,1997,5:30-32.[5]　倪可德.农畜矿物质营养[M ].上海科学技术出版社,1994:55-62.[6]　王金华,穆跃林.基因工程菌产植酸酶(phytA )的纯化及性质初步研究[J ].云南师范大学学报(自然科学版),2003,23(1):43-47.[7]　李春明,彭远义.2株黑曲霉植酸酶的分离纯化及其酶学性质研究[J ].西南农业大学学报,2006,28(4):643-647.[8]　陈　惠,王红宁,赵海霞.基因工程酵母产植酸酶的酶学性质研究[J ].微生物学通报,2003,30(3):38-41.[9]　陈　惠,王红宁,杨婉身,等.F43Y 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astoris E22,which was const ructed wit h t he p hytase gene f rom A s per gill us ni ger N14,was p urified and characterized.The p hytase had two optimum peaks at p H215and515.It s optimum temperat ure,Km for sodium p hytate and specific activity was 45℃,010002mol/L and49332817u/mg at p H215and55℃,010001mol/L and62437612u/mg at p H515.The activity of t he p hytase was reduced by Fe2+at p H215and was reduced by Zn2+and Cu2+at p H515.The remaining p hytase activity after10minutesπincubation at85℃,after6hours incubation wit h pep sin at p H215and wit h t ryp sin at p H515was about70%,95%and85%,respectively.The mole2 cule weight of t he p hytase was6117KD and t he isoelectric point was between p H415and p H510.K ey w ords:Pichi a p astoris;p hytase;p urification;p roperty责任编辑　陈绍兰 。