小鼠腹腔巨噬细胞的获取

小鼠腹腔巨噬细胞的获取

1材料准备

好血清56℃灭活1h，完全冷却后1000rpm/5min，然后0.22μm滤膜过滤，配含10%不含双抗的灭活FBS血清的1640培养基，另外再配含有双抗的完全培养基。

泡沫板，小注射器6个，10mL注射器几个，无菌剪刀、镊子。提前预冷的未加双抗的1640培养基。加了双抗的完全培养基37℃预热。50mL管几个。无菌PBS，台盼兰，75%酒精。

C57BL/6小鼠8-12周。

Corning极低吸附培养板，细胞不能黏附，或者用0.25%胰酶

+0.02%EDTA。用Hanks液终止胰酶和EDTA消化。

2实验步骤

1）拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2min，移入超净台，把小鼠放到泡沫板上，用枕头固定四肢，用镊子和剪刀剪开皮肤，露出

腹膜，但勿伤及腹膜壁。注意：在处死老鼠时，如果腹腔内有

血，则这只老鼠不能用，容易有血细胞污染。

2）用10mL注射器吸取提前预冷的无双抗的164010mL，换小针头注射到腹腔中，同时从两侧用手指按压腹膜壁2-5min，使液体在腹

腔内充分流动。然后放置20-25min。提前预冷离心机到4℃。

3）轻轻拔出针头，然后从侧壁吸出培养基，注意不要吸到体内器官。然后再注射5mL的培养基，按压1min，停滞5min，吸出到

提前预冷的50mL的离心管中。

4）500g/8min，然后用无双抗的培养基洗一次，500g/8min，弃去上清液，然后用预热的完全培养基重悬。

5）台盼兰计数，很难消化下来，所以接种的时候，必须直接接种到目的培养器皿中。如果是96孔板，一般是2X10^5个/mL，如果

温箱孵育2-4h，用提前预热的是6孔板，200w个/mL，5%CO

2

1640洗1-2次，然后换液，洗去未贴壁细胞，贴壁细胞则为单层

的巨噬细胞。

3实验结果

巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪

足，铺开呈三角形或多角形。

4注意事项

1)巨噬细胞使终末分化细胞，不会增殖。在条件适宜下可存活2-3

周，多用原代培养。每只小鼠可产生200-300w个细胞，其中90%

为巨噬细胞。培养细胞对低温的耐受力比高温强。

2)很难消化下来。

3)避免交叉感染，每只小鼠换一个注射器。

4)严格无菌操作。

5)吸取细胞悬液时，尽量不要吸到大小肠，容易造成成纤维细胞感

染。

6)巨噬细胞的marker：CD14,CD11b（MAC1），CD68(需要破膜，胞内

细胞因子染色，不仅表达在巨噬细胞上，也表达在淋巴细胞，成

纤维细胞和内皮细胞)，F4/80,CD86.