乙酰胆碱酯酶酶抑制法快速检测农药残留的研究进展
全血胆碱酯酶活性的测定
全血胆碱酯酶活性的测定 ——羟胺三氯化铁法 实验目的 1. 掌握三氯化铁比色法的实验原理、分析步骤及酶测定的临床意义。 2. 了解常见全血胆碱酯酶活性测定方法的优缺点、注意事项。 3. 学会末梢血的采集。 实验原理 血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红色羌酸铁络合物。颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。试剂和材料 蒸馏水 盐酸溶液(1＋2) 碱性羟胺溶液 磷酸盐缓冲液(PH＝7.20) 三氯化铁溶液 氯化乙酰胆碱标准液分光光度计 10mL比色管 漏斗 恒温水浴箱，控温±0.5℃采血针头 血色素吸管 采样、运输和保存 用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。 实验步骤 A 样品管+0.98mL 磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min +1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴30min B 对照管0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min +1.0mL水37℃水浴30min C 标准管1.0mL 磷酸盐缓冲液37℃水浴5min + 1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴30min D 空白管1.0mL 磷酸盐缓冲液37℃水浴5min +1.0mL水 37℃水浴30min
水浴之后对A 、B 、C 、D 四个试管分别进行以下操作： 1.加入 4.0mL 碱性羟胺溶液，充分振摇 2min ； 2.加入 2.0mL 盐酸溶液，充分振摇 2min ； 3.加入 2.0mL 三氯化铁溶液，充分振摇； 4.滤纸过滤，520nm 比色。 实验结果 表1-1 520nm 波长下样品的吸光度 样品编号 A B C D 吸光度 0.299 0.003 0.538 0.000 结果计算 ①计算酶活性的绝对值 带入得： Xs=7538 .0299.0003.0538.0?-+=3.149μmol Xs ：水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL ·37℃·30min)； A ：以 试剂空白为参比的在波长520nm 处样品管的吸光度值； B ：以试剂空白为参比的在波长520nm 处对照管的吸光度值； C ：以试剂空白为参比的在波长520nm 处标准管的吸光度值。 ②计算酶活性的相对值 Y=10060 .1149.3?=197 Y —酶活性的相对值，%； Xs —被测血样中酶活性的绝对值，μmol(0.02mL ·37℃·30min)； Xc —正常人血中酶活性绝对值，μmol(0.02mL ·37℃·30min)。Xc=1.60μmol(0.02mL ·37℃·30min) 讨论 1.由于未在网上查到北京市居民胆碱酯酶活性的参考标准，遂以课件上浙江地区健康人胆碱酯酶活性绝对值作为参考。即：女：3.19 ± 0.398 μmol ；因3.149μmol 在3.19 ± 0.398 μmol 的区间内，故该样本的胆碱酯酶活性属正常范围。 2.各组所测数值偏差较大，可能与操作差异如采血时间、振摇是否充分、加热时间等导
《药物设计学》-组蛋白去乙酰化酶抑制剂类药物的设计
南开大学现代远程教育学院考试卷 2019年度春季学期期末(2020.2) 《药物设计学》 主讲教师：李月明 一、请同学们在下列（20）题目中任选一题，写成期末论文。 1.利用互联网资源，简述组蛋白去乙酰化酶抑制剂类药物的设计 2.利用互联网资源，查询三到四个通过共价键方式与靶标相作用的药物，指出其 作用靶点、临床用途及副作用。 3.利用互联网资源，查询三到四个拟肾上腺素类药物，论述化合物的构效关系、 临床用途、不良反应及使用注意事项。 4.利用互联网资源，查询三到四个磷酸二酯酶抑制剂类药物，简述化合物的开发 过程，化合物的构效关系、临床用途及使用注意事项。 5.简述钙离子通道拮抗剂类药物的开发特点及相关成果 6.简述硝苯地平的开发过程、构效关系、制备工艺及临床用途。 7.简述肽类化合物的生物活性（举三到四个实例即可），并简述对肽骨架进行修 饰的常用方法。 8.指出卡托普利的作用靶标、与靶标的作用方式，并简述卡托普利的开发过程及 临床用途。 9.用互联网资源，查询三到四个COX-2的选择性抑制剂，指出其与靶标的作用方 式，并指出其临床用途及注意事项。 10.利用互联网资源简述青霉素类药物的作用原理。 11.利用互联网资源，查询三到四个羟甲戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，指出其结构 的共性和不同之处，其作用机制以及临床用途。 12.利用互联网资源，查询三到四个叶酸类抗代谢药物，指出其作用靶标、药物与 靶标的作用关系及其主要的临床用途。 13.利用互联网资源，查询三到四个嘧啶类抗代谢药物，指出其作用靶标、药物与 靶标的作用关系及其主要的临床用途。 14.试论类药性判断及其在新药研发中的关键作用。 15.简述组合化学技术的发展过程及其在新药创制中的作用。 16.利用互联网资源，查询三到四个实际案例，通过这些案例说明如何进行基于片 段的药物设计。 17.利用互联网资源，查询三到四个前药案例，并说明这些前药设计的设计思想、 在体内的活化方式以及与母体药物相比的改进之处。 18.利用互联网资源，查询三到四个神经氨酸酶的抑制剂，说明这些药物与靶标之 间的作用方式、药物的设计理念以及这些药物的临床用途。 19.利用互联网资源，从正反两方面简述类药性判断在新药创制过程中的作用。 20.利用互联网资源，简述组合化学技术在新药创制过程中的作用。
实验2 乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药
K 0 K t 吸光度A 实验二 乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药 目前有机磷、氨基甲酸酯类农药是我国大量使用的杀虫剂，虽然这类农药与过去使用的有机氯农药相比，降解速度较快，但在果蔬中的残留仍然较为严重。由于该类农药能抑制人体内乙酰胆碱酯酶的生理活性，神经传导因此受阻，引起神经麻痹乃至死亡，对人类健康造成极大危害。对于果蔬中的农药通常采用气相色谱等方法进行分析，但分析时间长，操作步骤烦琐，适用于实验室分析。长期以来在大部分果蔬市场中，通常采用乙酰胆碱酯酶抑制法进行快速检测，即以乙酰胆碱酯酶作为检测试剂，采用农药残留检测仪，根据乙酰胆碱酯酶活性变化的程度来测定果蔬样品中的残留农药。 一、 实验目的 1． 了解果蔬中残留农药的分析方法； 2． 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法； 3． 理解农药残留性评价的意义。 二、 实验原理 有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，酶抑制法就是根据这一昆虫毒理学原理，对农药残留进行检测。 以乙酰胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶（ACHE ）的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫双对硝基苯甲酸（DNTB ）产生显色反应，使反应液呈黄色（于410nm 处有最大吸收峰）。 根据酶促反应动力学原理，在没有有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时，底物在酶的催化作用下发生水解，反应速率可以用吸光度值随时间的变化率K 0来表示。当有机磷和氨基甲酸酯类农药加入到酶的显色体系中时，农药抑制了酶的活性，影响显色体系的反应速度，此时体系吸光度随时间的变化率为K t ，则有机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的活性的抑制率Y 的计算公式如下： %1000 0?-= K K K Y t K 0：空白样品的吸光度随时间变化曲线的斜率值 K t ：样品溶液的吸光度随时间变化曲线的斜 率值 其中K 0和K t 都可通过以下过程进行推导和计算。 在样品的测量过程，选取每隔等步长时间测定一次吸光度值，3分钟内共测定7个数据点。设数据点如下 表： t 1 2 3 4 5 6 7 A A 1 A 2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7 则线性回归所得A ～t 曲线的斜率K 为： 2 22272176543212 2 )721(7 1 )721() ()721(71 )765432()(7171 +++-++++++?+++-++++++= -- = ∑∑∑∑∑ A A A A A A A A A A t t A t A t K i i i i i i
乙酰胆碱酶抑制剂
乙酰胆碱酯酶抑制剂，即抗胆碱酯酶药。能抑制乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)的活性，使胆碱能神经末梢释放的ACh不致被AChE水解，导致ACh浓度增高，使ACh的作用延长并增强。因此是间接的拟胆碱药。根据抗胆碱酯酶药与AChE结合后水解速率的快慢，可分为可逆性和不可（难）逆性乙酰胆碱酯酶抑制及两类。 （一）可逆性乙酰胆碱酯酶抑制 生物碱，季铵类，叔胺类。 毒扁豆碱(Physostigmine) 是一种生物碱，为用于临床的可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂。化学结构中甲氨基甲酸酯部分是抑酶作用的必要结构，当与AChE的催化部位结合后，生成无活性的氨基甲酰化的AChE，其水解速率较乙酰化的AChE 慢的很多，但最终还是可以被水解，释放出活性的AChE，因此为可逆性的抑制剂。毒扁豆碱为氨基甲酸芳酯类，性质不稳定。对其结构改造发展了合成的抗胆碱酯酶药，用于临床的有溴新斯的明(Neostigmine Bromide)，溴吡斯的明(Pyridostigmine Bromide)。一些用于临床的季铵类抗胆碱酯酶药有依酚氯铵(Edrophonium Chloride，亦称腾喜龙)和安贝氯铵(Ambenonium Chloride，亦称酶抑宁，酶斯的明)。氢溴酸加兰他敏Galantamine Hydrobromide)为一种生物碱，作用均与新斯的明类似。加兰他敏和一些新开发的吖啶类抗胆碱酯酶药，目前正研究用于治疗老年性痴呆。众多研究发现一些具有乙酰胆碱酯酶抑制的活性成分，主要为生物碱类、萜类和香豆素类等结构类型的化合物，表1、图1分别对其活性和结构进行了归纳。其中生物碱类乙酰胆碱酯酶抑制剂如石杉碱甲、加兰他敏等因活性高、选择性强而受到广泛的关注。 不可（难）逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂 即，有机磷农药
透明质酸预防外科术后粘连的研究进展
透明质酸预防外科术后粘连的研究进展 杨晓红凌沛学王凤山 透明质酸（hyaluronic acid，HA），又称玻璃酸，是1934年由Meyer和Palmer 首次从牛眼玻璃体中分离出的一种酸性黏多糖。70年代开始将1％HA溶液应用于眼科手术和治疗某些骨关节疾病，并由此形成了两门新兴的学科：眼科黏性手术学（viscosurgery）和黏弹性补充疗法（viscosupp-lement）。近年来，国内外对HA的分布、化学结构、生理功能和临床应用[1,2]等方面进行了广泛、深入的研究，其已成为具有较高临床价值的治疗药物，主要应用于：眼黏性手术、关节病、软组织修复和作为药物载体等，特别是在预防和减少外科术后组织粘连中取得了较大的进展。本文重点结合HA的生理功能，概述其自防止外科术后粘连方面的研究进展。 1 HA的生理功能 HA是由（1→3）-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡糖-(1→4)-O-D-葡糖醛酸的双糖重复单位所组成的一种线形聚阴离子电解质。作为人体生理所必需的物质，它广泛存在于动物的各种组织中，包括结缔组织、皮肤、软骨、眼玻璃体和滑液等。HA分子位于细胞间的胶原与弹性纤维等的空间内，由多种细胞的细胞膜所产生，合成后直接进入细胞间质。作为细胞间质的主要成分之一，HA具有填充细胞空间、稳定细胞结构、覆盖和保护细胞的作用。它的重要的生物学作用之一就是稳定纤维蛋白和膜蛋白的细胞间结构。HA和细胞间纤维蛋白结合构成具有黏弹性、保护性、润滑性和稳定性的基质，细胞镶嵌在其中。HA的水溶液具有极强的黏弹性和假可塑性，即使在低浓度时也呈较高的流变学特性。HA的这种高黏弹性和低浓度特性使代谢产物可以从镶嵌有HA分子网筛中的细胞间自由扩散。 HA特定的流变学特性取决于它的线性聚阴离子结构，分子量可高达4×106~5×106。在水溶液中，HA以无规则螺旋形式存在，有很大的分子容积，使其在低浓度下（<0.01％）能够交织缠绕并且互相透入，因而增强了HA的流变学特性[3]。 HA能润滑和保护由胶原网络构成的组织表面（软骨和肌腱）和镶嵌于胶原网络中的结缔组织细胞（滑液组织、肌鞘和筋膜）。大分子HA作用于淋巴脊髓
胆碱酯酶抑制剂
胆碱酯酶抑制剂治疗阿尔茨海默病的系统评价 自1997年首次使用胆碱酯酶抑制剂(ChEI)治疗阿尔茨海默病以来,多数临床医师和绝大多数患者均把胆碱能药物,如多奈哌齐、加兰他敏和利凡斯的明作为轻至重度阿尔茨海默病的一线药物治疗用药。这些药的药代动力学特征有轻度差异,但都是通过阻断乙酰胆碱酯酶,抑制乙酰胆碱这种与记忆相关的重要神经递质的失活。这类药物可以改善阿尔茨海默病的临床表现。为评估上述药物治疗因阿尔茨海默病引发的轻、中或重度痴呆的疗效,英国牛津大学的Birks检索了Cochrane痴呆与认知改善组登记库,从中提取相关数据进行分析,并于今年1月25日在线发表了分析结果。 多奈哌齐、加兰他敏和利凡斯的明这3种ChEI对轻至重度阿尔茨海默病都是有效的。在治疗开始前,无法确定药物治疗对哪些患者更有效。无证据表明ChEI治疗是没有价值效益的。尽管上述3种药的作用模式略有不同,但没有证据表明其疗效存在差异。与利凡斯的明相比,多奈哌齐导致的不良反应更少。如果在给患者用药前逐步细致地进行超过3个月的常规剂量滴定,患者对加兰他敏和利凡斯的明的耐受性与多奈哌齐相当。多奈哌齐的滴定较简单,因考虑使用较低剂量。 阿尔茨海默预后和治疗 认知功能的衰退是不可避免的,但病情进展的速度是不可预料的.存活期自2年至20年不等,平均为7年. 对阿尔茨海默病的一般性治疗原则与所有痴呆的治疗相同(见上文痴呆的治疗). 某些能增强胆碱能神经传递的药物,例如Donepezil[即安理申(aricept)],至少在疾病的早期阶段能暂时改善记忆功能.不过,这些药物并不能改变基本病理变化的稳步恶化.他克林(tacrine)引起的不良反应较多.安理申开始试用的剂量是每天晚上1次5mg,过4~6周以后,可增加至10mg；须连续用药数月才能评估其疗效.有关抗氧化剂(如维生素E),雌激素和非类固醇抗炎药的治疗尚在研究之中. 许多药物都能引起中枢神经系统不良反应,包括精神错乱和倦怠.镇静剂如苯二氮类药物,应尽可能避免使用.抗胆碱能药物,例如某些三环类抗抑郁剂,抗组胺制剂,抗精神病药物以及苯甲托品,均应避免使用. 银杏叶浸出物能使阿尔茨海默病或血管性痴呆病例的记忆丧失与其他症状进展有所减慢或有中度的逆转.银杏叶制剂可能起着自由基清除剂的作用.不良反应很轻微；治疗应用尚需进一步研究. 老年痴呆症前兆是什么 导读：一般老年痴呆症前兆有什么呢?由于前期老年痴呆症患者的生活基本可以自理，所以很多时候人们往往忽视了老年痴呆症前兆，被发现时基本都是中晚期了。因此了解老年痴呆症前兆可以帮助患者及时发现病情，以及更好的治疗老年痴呆症。 老年痴呆症,指的是一种持续性高级神经功能活动障碍,简单点说就是在没有意识障碍的状态下,记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面发生了障碍。一般老年痴呆症常常发生在50岁以后,起病隐匿,发展缓慢,最早期往往是以逐渐加重的健忘开始,如果不注意,通常不容易发现,常听有些老年人说:“老了,记性不行了,不中用了。”这其实可能就是老年痴呆症的先兆。 一般老年痴呆症前兆有什么呢?下面请百济药师来为大家介绍老年痴呆症前兆。 老年痴呆症前兆 1、记忆力减退：尤其是近记忆力减退是老年痴呆症早期最常见的前兆。经常忘记近期得到的一些信息，如约会、人名或电话，忘记熟人的名字，不记得刚刚发生(甚至自己做过)的事，还有拿什么东西转手就忘。 2、不能完成熟悉的工作：难以胜任日常家务，而这些家务通常不需要思考。例如，经常做饭的人现在却不知如何做，以前是个精于计算的人，现在连买菜的小账和简单的加减法都算不清。
组蛋白去乙酰化酶及其抑制剂与子宫内膜异位症的研究进展
·综述·组蛋白去乙酰化酶及其抑制剂与子宫内膜异位症的研究进展 王水英1综述，黄荷凤2审校 （1．杭州师范大学临床医学院，杭州310036；2．浙江大学医学院附属妇产科医院，杭州310016） 【摘要】子宫内膜异位症是一个妇科常见病，其发病机制目前尚不明确，目前认为它与表观遗传 改变有密切关系。组蛋白乙酰化修饰是表观遗传调控的重要机制之一。现结合国内外文献报道，对组 蛋白去乙酰化酶及其抑制剂与子宫内膜异位症的发病及治疗前景做一综述。 【关键词】子宫内膜异位症；组蛋白去乙酰化酶；组蛋白去乙酰化酶抑制剂 中图分类号：R711．71文献标志码：A文章编号：1004－7379（2012）05－0401－03 子宫内膜异位症（简称内异症，endometriosis）主要表现为盆腔疼痛和不孕，约10% 15%的育龄期妇女深受其影响。目前其发病机制尚不明确，但大量研究表明，内异症是一个表观遗传性疾病［1，2］。组蛋白修饰和DNA甲基化是表观遗传调控的主要机制。组蛋白修饰主要包括组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化等，其中研究最多的是组蛋白乙酰化修饰。组蛋白乙酰化修饰是可遗传的，也是可逆的，可通过相应抑制剂抑制其变化，恢复相关基因的转录而达到治疗疾病的目的。本文就组蛋白去乙酰化酶及其抑制剂与内异症的关系做一综述。 1组蛋白去乙酰化酶与子宫内膜异位症 组蛋白乙酰化、去乙酰化修饰影响染色质重塑，在基因表达调控中扮演着重要的角色。组蛋白乙酰化修饰由功能相互拮抗的两种蛋白酶催化完成：组蛋白乙酰基转移酶（his-tone acetyltransferases，HATs）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetyltases，HDACs）。HATs将乙酰基转移到组蛋白赖氨酸残基上，中和组蛋白电荷，使转录因子、调节因子复合物和RNA合成酶更接近DNA，使基因更容易表达。相反，HDACs 的去乙酰化作用恢复了组蛋白的正电荷，增加了DNA与组蛋白之间的引力，使核小体变得十分紧密，不利于特定基因的表达，包括一些肿瘤抑制基因。在正常生理状态下，HATs 与HDACs对组蛋白乙酰化作用的调控处于平衡状态。而细胞在发生转化的状态下，HDACs的表达明显增加，使原有的平衡状态被打破，导致一些基因的表达失衡，进而引起疾病的发生。目前在人体已发现18种HDACs，根据与酵母的同源性划分为4类：Ⅰ型与酵母去乙酰化酶RPD3有相似的催化位点，包括HDACl、HDAC2、HDAC3和HDAC8；Ⅱ型类似酵母去乙酰化酶Had1，包括HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9和HDAC10；Ⅲ型HDACs是NAD依赖的去乙酰化酶Sir2家族，是一类高度保守的基因，不能被Ⅰ、Ⅱ型HDACs抑制剂所抑制，包括sirt1 sirt7；Ⅳ型包含有Ⅰ和Ⅱ型HDACs的催化位点，但又不完全同源，只有HDAC11。目前研究较多的主要是Ⅰ型和Ⅱ型HDACs。 HDACs广泛存在于人体各组织中。不同类型的HDACs 在不同组织中的表达存在差异。Ⅰ型HDACs（HDAC1、HDAC2及HDAC3）在正常子宫内膜组织中有不同程度的表达［3］。在子宫内膜癌组织中，HDAC2高水平表达，且表达高低与预后密切相关［4］。目前为止，HDACs与内异症的相关报道国内外均少见。我们［5，6］前期进行了有关HDAC1与内异症的相关研究，发现HDAC1蛋白在内异症在位内膜和异位内膜组织的表达明显高于正常子宫内膜，内异症内膜组织中HDAC1的高表达说明这些细胞的组蛋白以去乙酰化占优势，也就是这些细胞的组蛋白处于低乙酰化状态，抑制了某些基因的表达。内异症在位内膜与异位内膜之间HDAC1的表达无明显差异，说明两者来源的遗传一致性。最近，Kawa-no等［7］报道子宫内膜异位囊肿间质细胞组蛋白H3、H4的乙酰化水平明显低于正常子宫内膜间质细胞，与我们的推测一致，也进一步证实了内异症中确实存在组蛋白乙酰化修饰的异常。在肿瘤细胞的研究中发现，当HDAC1基因缺失时，细胞阻滞在G1期或不能完成G2/M的转化，导致细胞生长抑制及细胞凋亡增加［8］。HDAC1可能通过抑制与细胞周期相关基因的转录而影响细胞的增生和凋亡。内异症在位内膜与异位内膜组织中HDAC1的高表达，说明这些细胞的特性发生了变化-增生能力增加而凋亡能力下降，促使内膜细胞更易在宫腔以外的地方继续生长而形成异位病灶。HDAC1在内异症的异常表达可能在内异症的发生、发展中起着重要作用，另一方面从组蛋白修饰角度说明内异症是一种表观遗传学疾病，至于HDAC1通过什么机制参与内异症发病，目前尚不清楚。除HDAC1外的其它HDACs是否也与内异症的发病有关，有待进一步研究证实。 2组蛋白去乙酰化酶抑制剂与子宫内膜异位症 内异症是一个妇科常见病，治疗方法目前以手术和药物为主。非根治性手术存在复发的可能，而药物治疗的副作用及停药后的复发，患者也难以接受。因此，内异症的治疗已 现代妇产科进展2012年5月第21卷第5期Prog Obstet Gynecol，May2012，Vol.21，No.5
透明质酸
低分子量及寡聚玻璃酸 郭学平，凌沛学，张天民目前临床上应用的玻璃酸（又称透明质酸，HA）制剂，如眼科手术用黏弹剂、治疗关节炎的关节腔注射液、术后防粘连制剂、滴眼液等，所用HA 的平均分子量一般为50万～500万。低分子量HA（LMW-HA）的分子量范围尚无统一标准，一般为1万～50万。而HA寡聚糖（oligosaccharides of HA，简称oligo-HA）为分子量在1万以下，单糖残基数量为2～40（一般为4～16）的HA分子片段。LMW-HA还属于大分子多糖范畴，在物理性质和生物活性方面与普通HA接近，而oligo-HA属于小分子多糖，其性质与普通HA有很大不同，甚至具有完全相反的作用。人体内源性HA的分子量分布较宽，从高分子到寡聚糖均存在，HA在体内总是经历高分子→低分子→寡聚糖→单糖的代谢过程。注射到体内的外源性HA也要经历这种代谢过程。因此HA在不同的代谢阶段，因分子量的不同而产生不同的生理或药理作用。本文对LMH-HA和oligo-HA的制备方法和生物活性的研究做一介绍。 1 制备方法 LMW-HA可在普通HA的制备过程中，先对HA进行一定程度的降解，再进行纯化精制，直接制得LMW-HA。由于HA降解后，黏度下降，使得过滤等操作容易进行，因此适用LMW-HA的大量生产。实验室中少量的制备可将HA直接降解制得。降解的方法有多种，主要为化学降解、酶解和物理降解，见表1。不同的降解方法各有特点，需要注意的是，除了要得到所需的平均分子量，还要考虑分子量分布范围。用凝胶色谱法可测定LMW-HA的平均分子量及分布。平均分子量分为重均分子量M w和数均分子量M n，其比值称
乙酰胆碱酯酶(AchE)活性测定试剂盒说明书
货号：MS2000 规格：100管/96样乙酰胆碱酯酶（AchE）活性测定试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： AchE属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE催化乙酰胆碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。 测定原理： AchE催化Ach水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412 nm吸光度增加速率，计算AchE活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入1.3 mL试剂二，充分震荡溶解。 试剂四：粉剂×1支，4℃保存。临用前加入1.3 mL试剂二，充分震荡溶解。 粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清液待测。 2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3.血清等液体：直接测定。 测定操作： 1.分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min。 3. 取微量石英比色皿/96孔板，依次加入20μL上清液、160 μL试剂二、10μL试剂三和10μL 试剂四，迅速混匀，于412nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A1，第190s吸光值记为A2。△A测定管=A2-A1。 注意：空白管只需测定一次。 AchE活性计算： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1.组织AchE活性 （1）按照蛋白浓度计算 活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。 AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（Cpr ×V样）÷T 第1页，共2页
乙酰胆碱酯酶活性抑制剂筛选比色法检测试剂盒产品说明书
乙酰胆碱酯酶活性抑制剂筛选比色法检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 乙酰胆碱酯酶活性抑制剂筛选比色法检测试剂是一种旨在通过乙酰胆碱酯酶反应系统中，在抑制剂存在与否的情况下，所释放出巯基胆碱，与Ellman试剂反应后，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物，出现吸光峰值的变化，即采用比色法来评价样品酶活抑制能力的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种抑制剂筛选检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase；AchE；EC3.1.1.7），又称为红细胞胆碱酯酶（RBC cholinesterase），广泛存在于真核生物，包括某些植物，尤其在脑组织、神经肌肉连接处（neuromuscular junction）、中枢神经系统的胆碱能突触（cholinergic synapses）和红细胞膜上高度表达，催化主要的神经传导介质乙酰胆碱的水解反应，产生乙酸和胆碱，终止突触传导。其功能在于调节乙酰胆碱作用。神经毒气，例如有机磷沙林（Sarin），抑制乙酰胆碱酯酶活性，导致神经肌肉瘫痪，最终发生窒息（asphyxiation）。血清乙酰胆碱酯酶浓度显著降低与有机磷杀虫剂中毒有关，因此血液检测是环境污染的重要指标。基于人工合成底物碘化硫代乙酰胆碱（acetylthiocholine iodide），在抑制剂存在与否的情况下，通过乙酰胆碱酯酶的作用，水解产生乙酸和硫代胆碱（thiocholine），与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析乙酰胆碱酯酶抑制剂的效应。乙酰胆碱酯酶反应系统为： Acetylcholinesterase acetylthiocholine iodide →acetate + thiocholine inhibitor DTNB + thiocholine →TNB + choline-S-S-TNB 产品内容 缓冲液（Reagent A）20毫升 反应液（Reagent B）2毫升 底物液（Reagent C）2毫升 阴性液（Reagent D）1毫升 产品说明书1份 保存方式 保存在－20℃冰箱里；反应液（Reagent B）和底物液（Reagent C）避免光照；有效保证6月 用户自备
不同酶源乙酰胆碱酯酶的抑制剂筛选
· 27 · 刘佳莉1，2 ?苑玉和1?陈乃宏1 1. 天然药物活性物质与功能国家重点实验室，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京，100050，中国 2. 天津中医药大学，天津，300193，中国 【摘要】 目的：建立一种可靠、快速、便捷、经济的乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase ，AChE ）抑制剂的筛选方法，为新药发现阶段AChE 抑制剂的筛选提供经济可靠的微量筛选方法，然后对植物提取物样品进行筛选。方法：分别采用电鳗AChE 、人源红细胞AChE 、大鼠海马区、纹状体匀浆液中的AChE 为酶源。以96孔板为载体，利用优化的Ellman 方法，在生理pH 值和温度的条件下，以他克林和石杉碱甲作为阳性对照，检测对不同酶源AChE 的抑制作用，确定最佳酶反应条件（最佳底物浓度、反应时间、显色剂浓度），并对植物提取物样品的AChE 抑制作用进行检测。结果：采用上述四种酶源的AChE 进行AChE 抑制剂微量筛选方法操作简便快速、可靠经济。其中应用电鳗AChE 进行筛选显示灵敏度较高，他克林和石杉碱甲对电鳗AChE 的抑制作用相当，而对人源红细胞AChE 、大鼠海马区、纹状体匀浆酶源的抑制作用，石杉碱甲明显优于他克林，所筛选植物提取物对AChE 均没有抑制作用。结论：本实验中所建立的筛选方法操作简便、快速、可靠经济，可用于纯化合物的筛选。【关键词】 乙酰胆碱酯酶；石杉碱甲；他克林；阿尔茨海默病 【中图分类号】 R965.1 【文献标识码】 A 文章编号：2095-1396（2011）03-0027-004 Comparative Study on Screening Acetylcholinesterase Inhibitors from Different Enzyme Sources LIU Jia -li 1，2 ，YUAN Yu -he 1，CHEN Nai -hong 1 1. S tate Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines ，Institute of Materia Medica ，Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College ，Beijing ，100050，China 2. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine ，Tianjin ，300193，China 【ABSTRACT 】 Objective ：To establish a reliable ，fast ，convenient and economical method of screening acetylcholinesterase inhibitors ，and use it to screen acetylcholinesterase inhibitors from extracts of plants. Methods ：Using the optimized Ellman method ，we examined the inhibition effects of tacrine and huperzine on acetylcholinesterase enzyme from electric eel ，human erythro-cyte ，rat hippocampus ，striatum homogenate in 96-well plates under physiological pH value and temperature. The concentration of AChE ，substrate and DTNB ，and reaction time were optimized. We also detected the inhibition effect of plant extracts on AChE. Results ：Practical microassays for screening AChE inhibitors were successfully established by using AChEs mentioned above. 不同酶源乙酰胆碱酯酶的抑制剂筛选方法比较 基金项目： 国家自然科学基金项目（No.U832008，30973887，81073078，81102831，90713045，81072541），科技部项目（No.2010DFB32900）， 国家科技重大专项（No.2012ZX09301002-004） 作者简介：刘佳莉，女，硕士生；研究方向：神经药理学和神经生物学；Tel/Fax：+86-10-63165182，E -mail：liujialiyx@https://www.360docs.net/doc/e217455048.html, 通讯作者：?陈乃宏，男，研究员，博士生导师；研究方向：神经系统疾患创新药物开发及作用机制；Tel/Fax：+86-10-63165177，E -mail： chennh@https://www.360docs.net/doc/e217455048.html,
乙酰胆碱酯酶活性测定
乙酰胆碱酯酶酶活的测试 作者：陈志坚 1 准备工作 0.1mol/L pH=8.0的磷酸缓冲液：NaH2PO4 1.68g，Na2HPO4 12.21g溶于1L水。 2 酶液制备 SD大鼠，断头处理后，冰台快速取大脑，放入玻璃皿中，玻璃皿加入少量冰冻的磷酸盐缓冲液( 磷酸盐缓冲液漂洗，用干净的滤纸吸去大脑组织表面的水分和血液，称质量) ，用眼科剪尽快剪碎组织块。将剪碎的组织倒入玻璃匀浆器中，再用少许冰冻磷酸盐缓冲液冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆器中进行冰浴匀浆。然后再加入冰冻的磷酸盐缓冲液，按脑组织质量与匀浆总体积1:10的比例，稀释混匀。将制备好的10%脑匀浆以3000r/min离心15min，取上清液待测。 3 酶活性抑制测试 3.1 配药液 参照脲酶实验 3.2DTNB 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、ATCh碘化硫代乙酰胆碱 0.0314mol/L DNTB，0.0314mol/L ATCH 3.3 酶活测试 在3.00ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液,混匀后37℃保温20min后, 依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。酶活力定义为每克脑蛋白每分钟水解底物的umol数。这是未加药酶活力为E1。 在2.98ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液，并加入不同浓度的药物（一个浓度测定一次），依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。计算出此时酶活，为E2。 抑制率计算公式为I（%）=(E1-E2)/E1*100% 得到一系列不同浓度的抑制率以后，利用SPSS计算出药物的IC50。
第五章 胆碱受体激动剂,乙酰胆碱酯酶抑制剂和胆碱受体拮抗剂
第五章胆碱受体激动剂，乙酰胆碱酯酶抑制剂和胆碱受体拮抗剂 第一节胆碱受体激动剂和乙酰胆碱酯酶抑制剂 乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh）是胆碱能神经递质,能选择性地与乙酰胆碱受体结合。按其对天然生物碱毒蕈碱(Muscarine)或烟碱(Nicotine)的敏感性不同，胆碱受体分为两类：即毒蕈碱样胆碱受体，简称M胆碱受体和烟碱样胆碱受体，简称N胆碱受体。M胆碱受体至少还可分为M1和M2两种亚型，N胆碱受体又可分为N1和N2两种亚型。 胆碱受体激动剂和乙酰胆碱酯酶抑制剂（又称为抗胆碱酯酶药）通常也称为拟胆碱药。临床应用的与ACh作用相似的药物，多数为研究ACh的构效关系，设计开发的合成药物。 一、胆碱受体激动剂 (一) 乙酰胆碱的化学结构修饰及合成的胆碱酯类 对乙酰胆碱分子结构中的季铵基部分、乙酰基部分及连接季铵基和酯基的亚乙基链部分，进行结构修饰，发展了用于临床的M胆碱受体激动剂，并总结出构效关系。对ACh分子结构中季铵基的修饰结果表明：正离子基团对分子的内在活性和对受体的亲和力是必要的，三甲季铵结构具有最佳活性，当三个甲基被较大基团例如乙基取代时，具有拮抗活性。对ACh分子结构中亚乙基链的修饰，Ing提出了5原子规律，即季铵氮原子与末端乙酰基氢原子间不多于5个原子时（H－C－C－O－C－C－N）具有最大的毒蕈碱样活性。亚乙基桥链上的氢原子若被大于甲基的基团取代时活性下降，若甲基取代在季氨氮原子的位时，烟碱(N)样作用强于毒蕈碱(M)样作用，但二者作用均小于乙酰胆碱，无临床应用价值；若甲基取代在氮原子的位，称为氯醋甲胆碱(Methacholine),由于甲基的空间位阻作用，体内被胆碱酯酶水解速率慢，作用时间延长，其S-(+)对映体M样作用与乙酰胆碱相当，N样作用大大减弱，临床上主要用于房性心动过速。对ACh结构中乙酰氧基的修饰，当乙酰基被丙酰基等高级同系物取代时，活性下降，如被芳环等取代时则转变为抗胆碱作用。将ACh分子结构中的乙酰基修饰为氨基甲酸酯得到氯化氨甲酰基胆碱称为卡巴胆碱(Carbachol)作用强且较持久，对乙酰胆碱酯酶较ACh稳定，可以口服，具有M样和N样作用，选择性差，毒副反应较 大，临床仅用于治疗青光眼。如果在卡巴胆碱结构中引入-甲基得氯化氨甲酰--甲基胆碱， 称为氯贝胆碱(Bethanechol Chloride)为M胆碱受体激动剂,几无N样作用，S-(+)-异构体活性显著大于R-(-)-异构体，临床用于治疗术后尿潴留和腹气胀。
透明质酸制备工艺进展(1)(2) (1)
透明质酸制备工艺进展 摘要 透明质酸，又名玻璃酸，是一种独特的。它是由线性大分子酸性粘多糖葡萄糖醛酸和N—乙酞氨基葡萄糖的双糖单位重复连接形成的。透明质酸广泛分布于高等动物的细胞外基质、结缔组织和器官中。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示多重要的生理功能，如润滑关节，促进创伤愈合等，在临床上得到广泛的应用。HA及其衍生物具有优良的生物相容性和可降解性，能作为药物载体和组织工程材料，因而广泛应用于生物医药学领域。透明质酸还具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被誉为最为理想的天然保湿因子，已作为化妆品及使用保健品中的保湿添加剂使用。文章讨论了透明质酸的制备方法，并对其在医药、化妆品、保健食品等领域中的应用进行综述。 关键词：线性大分子酸性多糖;天然保湿因子;保湿添加剂;相溶性;可降解性
Hyaluronic acid preparation process Abstract Hyaluronic acid, also known as hyaluronic acid, is a unique. It is composed of linear macromolecular acid mucopolysaccharide glucuronic acid and N - acetyl glucosamine disaccharide repeating units are connected to form a. Hyaluronic acid is widely distributed in higher animal cells, extracellular matrix of connective tissues and organs. Hyaluronic acid with its unique molecular structure and physicochemical properties in vivo shows many important physiological functions, such as lubrication of joints, promote wound healing, has been widely applied in clinical medicine. HA and its derivatives have biocompatibility and biodegradability has excellent biocompatibility, can be used as drug delivery and tissue engineering material, which is widely used in biomedical field. Hyaluronic acid also has a special role in water retention, is the moisture of nature found in the best material, known as the most natural moisturizing factor ideal, as cosmetics and health care products in the use of moisturizing additives. This paper discusses the method of the preparation of hyaluronic acid, and reviews its application in medicine, cosmetics, health food and other fields. Keywords:Linear macromolecules of acidic polysaccharides; natural moisturizing factor; hydrating additives; miscibility; biodegradability
实验三杀虫剂对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用
实验三杀虫剂对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用 一、试验原理和目的 在昆虫中枢神经系统的兴奋性突触中，乙酷胆碱是主要神经递质，它通过生物合成、释放以及与受体的结合，使得神经传导能正常进行。当神经接受到某一刺激时，冲动传导到突触处，就由突触前膜释出含有乙胆碱的小囊胞，一次冲动可释出小囊胞100-150个，每个小囊胞含有乙酰胆碱(ACh)分300-2000个。在突触后膜上约有乙酰胆碱分子900个就可产生局部膜电位的去极化，致神经传导正常进行。多余的乙酰胆碱分子及完成刺激受体后而解离的乙酰胆碱分子应立即被突触间隙的乙酰胆碱酯酶(AChE)所水解，使神经又处于静止状态而有利于迎接下一个刺激。因此，比较乙酰胆碱酯酶的活力和性质，可以作为测定神经递质的一个指标。 有机磷酸酯和氨基甲酸酯类杀虫剂在昆虫体内主要作用于神经系统，抑制胆碱酯酶的活性，导致神经传导的阻抑而引起昆虫中毒死亡。研究其毒理机制，胆碱酯酶活力是重要指标之一。其活力测定方法较多，发展较快，有测压和测pH法、比色法、电化学法、荧光法、放射法等。其中比色法中由于应用的底物和显色剂不同，又有不同的测定方法。本实验主要介绍一种常用的比色测定方法乙酰硫代胆碱一二硫双对硝基苯甲酸法(ASCh一DTNB法)。 该法是Ellmanl961年创制的方法，其原理是应用乙酰硫代胆碱(ASCh)为底物，在胆碱酯酶作用下水解为硫代胆碱及乙酸，然后以二硫双对硝基苯甲酸(DTNB)为显色剂，形成黄色产物，在412nm处有最大吸收峰。生成物浓度和光密度在一定范围内密切相关，故用分光光度计可以进行定量测定，以此代表AChE的活性。 本实验通过测定有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂对昆虫乙酰胆碱酯酶活力的影响，以理解该两类杀虫剂的作用机理，并熟练掌握该酶活性测定方法。 二、仪器、试剂和材料 1. 仪器 721型分光光度计、冰箱、离心机、恒温水浴、匀浆器、具筛刻度试管、吸管等。 2. 供试昆虫 5或6龄的粘虫或家蝇成虫。 3. 试剂 (1) %溶液生理盐水：称取kcl 1.5g，加入蒸馏水，置于100ml的容量瓶中。 (2) ×10-3M谷胱甘肽（还原型）生理盐水溶液：称取谷胱甘肽（还原型）0.030733g，以%的%溶液生理盐水定容于50ml的容量中。