乙酰胆碱酯酶
乙酰胆碱酯酶
乙酰胆碱酯酶 - 简介
乙酰胆碱酯酶 acetylcholine esterase
简称AchE（也称真性胆碱酯酶）：活性高,选择性水解Ach的必需酶，能使乙酰胆碱（ACh）水解成胆碱和乙酸。
乙酰胆碱酯酶 acetylcholine esterase EC3.1.1.7。胆碱酯酶中的I型（即true choli-neesterase）底物特异性高，因为只分解以乙酰胆碱为中心的狭窄范围的底物，故特此这样称呼。
乙酰胆碱酯酶 - 在神经肽代谢中的作用
Chubbe等的研究证明，AchE具有羧肽酶和氨肽酶的活性。在体外，AchE能水解脑啡肽（Enk）和P物质（SP），但不能水解生长抑素（Som）和血管加压素（VSP）等。进一步的研究证明，AchE作为肽酶，其水解肽的活性部位和作为酯酶的活性部位不同。值得注意的是，神经系统许多非胆碱能的，含大量AchE的神经元同时亦含有各种神经肽类物质。如脊髓背根节的SP能细胞即是AchE强阳性。
最近的研究显示，高度纯化的来自电鳗电器官或牛血清的AchE具有蛋白酶样或外切酶的活生。对于血清蛋白质，AchE能发挥C端残基的清除作用。此外，
AchE的蛋白酶样作用还得到分子生物学证据的支持，氨基酸分析显示，AchE蛋白质分子与蛋白酶样内切酶以及血清羧肽酶的氨基酸序列相似。在它们的C端36个残基范围内，有40%氨基酸序列和蛋白酶的活性片段相同。
乙酰胆碱酯酶 - 电生理和行为效应
AchE的树突或胞体释放
树突/胞体释放是神经分泌的一种特殊形式。黑质多巴胺神经元属非胆碱能，似乎很少接受胆碱能传入投射，但黑质细胞内含有大量AchE。研究发现，脑内的AchE可以有膜结合型和非膜结合型（可溶的）两种形式，黑质多巴胺能神经元的树突或胞体能够将AchE（可溶型）分泌到细胞外液中，称为AchE树突释放现象。显然，AchE的树突释放现象和Ach的释放无关。因为应用胆碱能阻断剂或拮抗剂并不能影响AchE的树突释放。同时，AchE在脑室内的分布以及脑脊液中的含量都和Ach不一致，由于电镜观察在黑质内没有发现树树突触的存在，所以黑质内经树突或胞体释放出的物质能相对自由的扩散。因此，在黑质AchE可能发挥一种非突触性的调节作用，以调节黑质一纹状体投射神经元的胞体对其远端树突传入信号的敏感性。
AchE的电生理及行为效应
研究发现细胞外AchE能改变黑质多巴胺神经元的电活性及动物的运动行为。大剂量应用时，AchE抑制黑质多巴胺能细胞的自发放电，但在生理学剂量时它能增加黑质细胞的放电频率。Creenfield通过体外培养细胞内记录方式发现在灌流中加入AchE能引起黑质细胞膜的显著超极化，并伴有膜输入电阻的降低，用不可逆性的胆碱酯酶抑制剂苏曼（soman）预先处理AchE，然后将其加入脑片培养液中，不能改变AchE对膜的电学性质的影响。上述实验表明，AchE 对黑质多巴胺能神经元膜有电学特性的作用与AchE水解Ach作用无关，并还具有高度结构特异性。
应用微电极直接将AchE注射到大鼠的黑质内，结果引起大鼠的运动行为改变，表现为行动迟缓和木僵状态。一次AchE注射后大鼠的行为变化可持续相当长的时间，其机制尚不清楚。推测在生理状态下，AchE从黑质多巴胺能细胞的树突释放后，能对其本身和邻近细胞的生理活动产生一定影响，这可能是一种新
的神经元之间局部联系或自身后馈调节的方式。
乙酰胆碱酯酶 - 在神经元发育和神经再生中的作用
AchE在神经元发育和神经再生中的作用
越来越多的研究提示，AchE可能与细胞的发育和成熟有关，证据是：（1）许多胚胎组织富含AchE；（2）各种原发性肿瘤组织及其些癌症病人的血清中AchE 的活性增加；（3）AchE与神经系统发生过程关系密切。
生化分析和组织化学研究提示，在发育过程中，AchE与神经细胞的增殖和神经元突起的长出有关，由于在发育过程中AchE出现，在不同类型细胞发育的相同时相，而AchE的出现时期正好和细胞的增殖，迁移，突起的长出时间及突触建立的早期阶段一致。总之，到目前为止，尽管缺乏直接的证据，但越来越多的研究结果支持这样的推测，在神经发育过程中，AchE可能作为一种特异的神经分泌蛋白，在细胞内或分泌到细胞外调节神经元的增殖和突起的长出。
AchE在神经再生中的作用
神经损伤和再生是非常复杂的过程，受许多内外因素的调节和影响。已知神经损伤早期AchE在神经元胞体和近端轴突内的活性增强。在研究AchE和神经再生的关系，有人用不可逆的AchE抑制剂DFP慢性处理坐骨神经损伤大鼠，结果明显削弱了神经再生的能力。DFP影响神经再生的确切机制还不清楚，一种可能就是AchE有促进神经再生的作用，而DFP作为有机磷毒剂和AchE的蛋白质分子不可逆的结合，阻了AchE在神经再生中的作用。
众所周知，外周神经较中枢神经有更强的再生能力。近年发现，中枢神经组织也有一定的再生能力，尤其是哪些种系发生上较力古老的纤维，如隔一海马通路，下丘脑一垂体纤维以及中枢的单胺能通路。值得注意的是，这些神经纤维或细胞体内部都含有高水平的AchE。结合AchE与神经元发育，突起长出以及它和神经再生的关系，提出AchE不仅参与胆碱能神经递质的传递，还具有调节和促进神经组织的发育和神经再生的神经营养因子样作用。
昆虫对杀虫剂的抗性机制概述
陕西农业科学 昆虫对杀虫剂的抗性机制概述 王芙蓉。吴薇 （北仑出入境检验栓疫局，浙江宁波３１５８００） 提要：昆虫抗性机制的研究对于抗性监潮、治理等具有重要意义．综述了昆虫对几种杀虫剂的抗性机制。关键词：杀虫剂；抗药性Ｉ苏云金杆菌ｌ阿维菌素 随着杀虫剂长期、大量、广泛地使用，昆虫对杀虫剂产生的抗性也越来越引起人们的关注。尽管在杀虫剂的更新、混合、交替使用方面做了大量工作，延缓了杀虫剂抗性的产生，但昆虫对杀虫剂的抗药性上升趋势仍不可遏制。综述了昆虫对化学农药、苏云金杆菌、阿维菌素的抗性机制。 １昆虫对化学农药的抗性机制 １．１表皮穿透性的降低 昆虫表皮对药剂穿透性降低，可延缓杀虫剂到达靶标部位的时间，使昆虫有更多的机会来降解杀虫剂。虽然表皮穿透下降只表现低水平抗性，但作为其它抗性因子的修饰者则很重要，如与解毒作用相结合，就可大大影响死亡率而增加抗性。表皮穿透性降低机制在家蝇、埃及伊蚊、致倦库蚊、淡色库蚊等均有发现［１］。不同的杀虫剂或不同的昆虫表现出的穿透性降低在程度上存在差别，但穿透性降低是所有昆虫抗性普遍存在的一个因素，杀虫剂穿透性的降低是受“Ｐｅｎ”基因所控制的［２１。 １．２解毒酶活力的增强 与杀虫剂代谢相关的解毒酶的解毒作用增强是抗性产生的主要原因之一。这些解毒酶主要包括细胞色素Ｐ４５０介导的多功能氧化酶、谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）、水解酯酶等。 多功能氧化酶是昆虫体内参与各类杀虫剂以及其它外源和内源化合物代谢的主要解毒酶系，可使杀虫剂降低或失去杀虫活性，从而使昆虫产生抗药性。Ｐ４５０酶系的解毒代谢能力增强是因为抗性昆虫体内Ｐ４５０过表达。与抗性相关的Ｐ４５０基因主要有６个：ＣＹＰ６Ａ１、ＣＹＰ６Ａ２、ＣＹＰ６Ａ８、ＣＹＰ６Ａ９、ＣＹＰ６８２和ＣＹＰ６Ｄ１［３］。多功能氧化酶是多种昆虫对拟除虫菊酯、辛硫磷、吡 ?收稿日期：２００８—１１－０４ 作者简介：王芙蓉，女．山东烟台人．研究方向：昆虫学．虫啉、有机磷、氮基甲酸酯类以及生长调节剂定虫隆等多种杀虫剂产生抗性的主导因素。杀虫剂中许多有机磷化合物是被虫体的ＧＳＴ所解毒。一些抗有机氯和有机磷的昆虫体内ＧＳＴ含量很高。ＧＳＴ解毒能力增强也是由于基因在体内的过表达。多种害虫对有机磷杀虫剂、拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性也与酯酶和水解酯酶有关。酯酶和羧酸酯酶活力增加也能导致棉蚜对有机磷杀虫剂产生抗性。以酯酶为基础的昆虫抗药性机制在分子水平上是因为酯酶基因扩增的结果。另外在昆虫体内还存在ＤＤＴ一脱氯化氢酶，它能把ＤＤＴ分解为无毒的ＤＤＥ，从而使昆虫对ＤＤＴ产生抗性。 １．３神经系统敏感性的下降 靶标不敏感性是昆虫对杀虫剂产生抗药性的一个极为重要的生化机制，已在多种昆虫对多种杀虫剂的抗性中发现。涉及变构乙酰胆碱酯酶（ＡｃｈＥ）对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性、不敏感的钠通道对ＤＤＴ和拟除虫菊酯的击倒抗性和不敏感的ｙ一氨基丁酸（ＧＡＢＡ）受体对环戊二烯类杀虫剂的抗性。 乙酰胆碱酯酶是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。许多昆虫的乙酰胆碱酯酶基因发生突变与昆虫的抗药性有着密切的关系［３。。基因发生突变后，其编码的ＡｃｈＥ对杀虫剂敏感度降低，这是造成昆虫对杀虫剂产生抗性的一个重要原因。现已在很多昆虫中发现不敏感的ＡＣｈＥ，不敏感的ＡＣｈＥ既可能是抗性昆虫ＡＣｈＥ酶量过高所致，也可能是ＡＣｈＥ发生了性质改变。通常情况下抗性是由ＡＣｈＥ变构引起的，不同昆虫的ＡＣｈＥ变构的部位不同。至今在ＡＣｈＥ中已
乙酰胆碱酯酶试剂盒说明书
乙酰胆碱酯酶试剂盒说明书 人胆碱乙酰化酶(CHAc)ELISA试剂盒说明书本试剂盒仅供体外研究使用! 预期应用 ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中CHAc含量。 实验原理 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗CHAc抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗CHAc抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的CHAc呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板:一块(96孔) 2. 标准品(冻干品): 2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10 ng/ml，做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释)后，分别稀释成10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，0.156 ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，临用前15分钟内配制。如配制5 ng/ml标准品:取0.5ml (不要少于0.5ml ) 10 ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3. 样品稀释液:1×20ml。 4. 检测稀释液A:1×10ml。 5. 检测稀释液B:1×10ml。 6. 检测溶液A:1×120μl(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，
实验2 乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药
K 0 K t 吸光度A 实验二 乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药 目前有机磷、氨基甲酸酯类农药是我国大量使用的杀虫剂，虽然这类农药与过去使用的有机氯农药相比，降解速度较快，但在果蔬中的残留仍然较为严重。由于该类农药能抑制人体内乙酰胆碱酯酶的生理活性，神经传导因此受阻，引起神经麻痹乃至死亡，对人类健康造成极大危害。对于果蔬中的农药通常采用气相色谱等方法进行分析，但分析时间长，操作步骤烦琐，适用于实验室分析。长期以来在大部分果蔬市场中，通常采用乙酰胆碱酯酶抑制法进行快速检测，即以乙酰胆碱酯酶作为检测试剂，采用农药残留检测仪，根据乙酰胆碱酯酶活性变化的程度来测定果蔬样品中的残留农药。 一、 实验目的 1． 了解果蔬中残留农药的分析方法； 2． 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法； 3． 理解农药残留性评价的意义。 二、 实验原理 有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，酶抑制法就是根据这一昆虫毒理学原理，对农药残留进行检测。 以乙酰胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶（ACHE ）的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫双对硝基苯甲酸（DNTB ）产生显色反应，使反应液呈黄色（于410nm 处有最大吸收峰）。 根据酶促反应动力学原理，在没有有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时，底物在酶的催化作用下发生水解，反应速率可以用吸光度值随时间的变化率K 0来表示。当有机磷和氨基甲酸酯类农药加入到酶的显色体系中时，农药抑制了酶的活性，影响显色体系的反应速度，此时体系吸光度随时间的变化率为K t ，则有机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的活性的抑制率Y 的计算公式如下： %1000 0?-= K K K Y t K 0：空白样品的吸光度随时间变化曲线的斜率值 K t ：样品溶液的吸光度随时间变化曲线的斜 率值 其中K 0和K t 都可通过以下过程进行推导和计算。 在样品的测量过程，选取每隔等步长时间测定一次吸光度值，3分钟内共测定7个数据点。设数据点如下 表： t 1 2 3 4 5 6 7 A A 1 A 2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7 则线性回归所得A ～t 曲线的斜率K 为： 2 22272176543212 2 )721(7 1 )721() ()721(71 )765432()(7171 +++-++++++?+++-++++++= -- = ∑∑∑∑∑ A A A A A A A A A A t t A t A t K i i i i i i
乙酰胆碱酯酶染色液(铅铜硫胆碱法)
乙酰胆碱酯酶染色液(铅铜硫胆碱法) 简介： 胆碱酯酶(cholinesterase)属于特异性酯酶，可分为两大类。一类是乙酰胆碱酯酶(Acetyl cholinesterase ，AChE)又称为真性胆碱酯酶，能水解乙酰胆碱，起到生理的调节作用；另一类为胆碱酯酶，又称假性胆碱酯酶(Pseudo cholinesterase ，PsChE)，能水解胆碱的酯而不能水解乙酰胆碱酯。乙酰胆碱酯酶主要存在于神经元的胞质内、神经与肌肉接头处即所谓运动终板处；PsChE 主要存在于血浆、胰腺、唾液腺内，生理功能尚不明确。显示乙酰胆碱酯酶的方法有Koell 法、Snell 和Garrett 法、Karnovsky 和Roots 法等。 Leagene 乙酰胆碱酯酶染色液(铅铜硫胆碱法)染色原理是乙酰胆碱酯酶水解碘化乙酰硫代胆碱，释放乙酸和硫代胆碱，磷酸盐与铅离子形成磷酸铅沉淀，再被S 2+置换，形成硫化铅沉淀。其优点是操作简便、酯酶的扩散较少，其缺点是对底物对组织的渗透性较差，有可能出现假阳性。 组成： 自备材料： 1、 10%甲醛钙固定液 2、 恒温培养箱 3、 光学显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、 冰冻切片，厚6μm ，不固定或置于遇冷的10%甲醛钙固定。 2、 蒸馏水洗。 编号 名称 DE0055 4×20ml DE0055 4×50ml Storage 试剂(A): AChE 孵育液 A1: AChE Iodide 48mg 120mg 4℃ 避光 A2: AChE Buffer A 18.4ml 46 ml RT A3: AChE Buffer B 0.8ml 2ml 4℃ 避光 A4: AChE Buffer C 0.8ml 2ml 4℃ 避光 A5: Iso-OMPA 0.4ml 1ml -20℃ 避光 试剂(B): AChE 漂洗液 2×20ml 2×50ml RT 试剂(C): AChE 硫化液 2×1ml 3×1ml RT 避光 使用说明书 1份
昆虫乙酰胆碱酯酶基因研究进展
昆虫乙酰胆碱酯酶基因研究进展1 林同，李立娜 华南农业大学林学院，510642 E-mail：lintong@https://www.360docs.net/doc/ee12143706.html, 摘要：昆虫乙酰胆碱酯酶是有机磷杀虫剂和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标，乙酰胆碱酯酶基因突变可导致乙酰胆碱酯酶对杀虫剂不敏感而是昆虫产生抗药性。黑腹果蝇和家蝇等昆虫只有一个乙酰胆碱酯酶基因，但冈比亚按蚊等昆虫乙酰胆碱酯酶基因有两个或多个拷贝。本文还综述了昆虫乙酰胆碱酯酶基因的结构和表达调控等。 关键词：乙酰胆碱酯酶基因；基因点突变；抗药性；基因拷贝 乙酰胆碱酯酶（AChE）是在神经系统中的一种主要的酶，能通过催化神经传递介质胆碱酯酶的水解而终止神经冲动。AChE是有机磷酸酯类(OP)和氨基甲酸酯类杀虫剂的主要靶标[1]，数量和性质的改变会使昆虫对杀虫剂产生抗性[2，3]。 1. 昆虫乙酰胆碱酯酶基因的结构与表达调控 人们已经研究了20多种昆虫乙酰胆碱酯酶生化特性[4]，并对一些昆虫乙酰胆碱酯酶基因(Ace)结构进行了分子分析，这些昆虫包括黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）[5]、印度按蚊（Anopheles stephensi）[6]、埃及伊蚊（Aedes aegypti）[7]、马铃薯叶甲（Leptinotarsa decemlineata）[8]、、家蝇（Musca domestica）[9]、尖音库蚊（Culex pipiens）[10]、黑尾夜蝉（Nephotettix cincticeps）[11]、铜绿蝇（Lucilia cuprina）[12]、麦二叉蚜（Schizaphis graminum）[13]、油橄榄果实蝇（Bactrocera oleae） [14]、棉蚜（Aphis gossypii）[15]和冈比亚按蚊（A. gambiae）[16]等。 铜绿蝇AChE序列和其他双翅目昆虫的高度同源，尤其是和家蝇和黑腹果蝇。铜绿蝇序列与家蝇的AChE有92.4%的氨基酸相似性，与黑腹果蝇的有85.3%氨基酸相似性，近似于按蚊和伊蚊之间的相似性[6，7]。 麦二叉蚜完整的cDNA序列有3283bp,其中包含2028 bp的开放阅读框（ORF），起始密码子（蛋氨酸）在257 bp处。终止密码子TGA在2285–2287bp处，后面是976 bp非翻译区，其中包括23 bp poly(A) 尾。在3＇非翻译区poly(A) 尾上游15 bp处有一个典型的AATAAA 信号。在非编码区（222–223 bp位置）和编码区(1775–1776 bp位置)各有一个Eco R I位点，在C末端非编码区(3181–3182位置)有 Hind III位点[13]。 黑腹果蝇[17]和斯氏按蚊(A. stephensi) [6] AChE基因有9个内含子。埃及伊蚊乙酰胆碱酯酶基因5＇非翻译区前导序列中有一个很长的内含子（19kb）,其大小及位置和果蝇乙酰胆碱酯酶基因5＇非翻译区前导序列中的第一个内含子相似[18]；在开放阅读框内的内含子和外显子有很强的保守性[6，17]，但第一和第二个内含子（分别是19kb和大于7kb）比印度按蚊乙酰胆碱酯酶基因的内含子（55-105bp）长[6]。 埃及伊蚊乙酰胆碱酯酶基因转录起始位点上游40bp处没有类似于TATA的序列，其启动子和多数脊椎动物的乙酰胆碱酯酶基因一样没有TATA盒[18，19]。但果蝇乙酰胆碱酯酶基因中含有TATA盒[17]。在人类这样没有 TATA盒的乙酰胆碱酯酶基因中，去除转录起始元件几乎会去掉启动子的活性，这表明转录起始元件在没有 TATA盒的乙酰胆碱酯酶基因的驱动表达中起重要作用。埃及伊蚊乙酰胆碱酯酶基因转录起始位点上游有五个调控元件。-496至 1本课题得到广东省自然科学基金（04300488）和华南农业大学校长科学基金（2004k051）资助
实验三 杀虫剂对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用
实验三杀虫剂对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用 一、试验原理和目的 在昆虫中枢神经系统的兴奋性突触中，乙酷胆碱是主要神经递质，它通过生物合成、释放以及与受体的结合，使得神经传导能正常进行。当神经接受到某一刺激时，冲动传导到突触处，就由突触前膜释出含有乙胆碱的小囊胞，一次冲动可释出小囊胞100-150个，每个小囊胞含有乙酰胆碱(ACh)分300-2000个。在突触后膜上约有乙酰胆碱分子900个就可产生局部膜电位的去极化，致神经传导正常进行。多余的乙酰胆碱分子及完成刺激受体后而解离的乙酰胆碱分子应立即被突触间隙的乙酰胆碱酯酶(AChE)所水解，使神经又处于静止状态而有利于迎接下一个刺激。因此，比较乙酰胆碱酯酶的活力和性质，可以作为测定神经递质的一个指标。 有机磷酸酯和氨基甲酸酯类杀虫剂在昆虫体内主要作用于神经系统，抑制胆碱酯酶的活性，导致神经传导的阻抑而引起昆虫中毒死亡。研究其毒理机制，胆碱酯酶活力是重要指标之一。其活力测定方法较多，发展较快，有测压和测pH法、比色法、电化学法、荧光法、放射法等。其中比色法中由于应用的底物和显色剂不同，又有不同的测定方法。本实验主要介绍一种常用的比色测定方法乙酰硫代胆碱一二硫双对硝基苯甲酸法(ASCh一DTNB法)。 该法是Ellmanl961年创制的方法，其原理是应用乙酰硫代胆碱(ASCh)为底物，在胆碱酯酶作用下水解为硫代胆碱及乙酸，然后以二硫双对硝基苯甲酸(DTNB)为显色剂，形成黄色产物，在412nm处有最大吸收峰。生成物浓度和光密度在一定范围内密切相关，故用分光光度计可以进行定量测定，以此代表AChE的活性。 本实验通过测定有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂对昆虫乙酰胆碱酯酶活力的影响，以理解该两类杀虫剂的作用机理，并熟练掌握该酶活性测定方法。 二、仪器、试剂和材料 1. 仪器 721型分光光度计、冰箱、离心机、恒温水浴、匀浆器、具筛刻度试管、吸管等。 2. 供试昆虫 5或6龄的粘虫或家蝇成虫。 3. 试剂 (1) 1.5%溶液生理盐水：称取kcl 1.5g，加入98.5ml蒸馏水，置于100ml的容量瓶中。 (2) 2.0×10-3M谷胱甘肽（还原型）生理盐水溶液：称取谷胱甘肽（还原型）0.030733g，以1.5%的1.5%溶液生理盐水定容于50ml的容量中。
乙酰胆碱酶抑制剂
乙酰胆碱酯酶抑制剂，即抗胆碱酯酶药。能抑制乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)的活性，使胆碱能神经末梢释放的ACh不致被AChE水解，导致ACh浓度增高，使ACh的作用延长并增强。因此是间接的拟胆碱药。根据抗胆碱酯酶药与AChE结合后水解速率的快慢，可分为可逆性和不可（难）逆性乙酰胆碱酯酶抑制及两类。 （一）可逆性乙酰胆碱酯酶抑制 生物碱，季铵类，叔胺类。 毒扁豆碱(Physostigmine) 是一种生物碱，为用于临床的可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂。化学结构中甲氨基甲酸酯部分是抑酶作用的必要结构，当与AChE的催化部位结合后，生成无活性的氨基甲酰化的AChE，其水解速率较乙酰化的AChE 慢的很多，但最终还是可以被水解，释放出活性的AChE，因此为可逆性的抑制剂。毒扁豆碱为氨基甲酸芳酯类，性质不稳定。对其结构改造发展了合成的抗胆碱酯酶药，用于临床的有溴新斯的明(Neostigmine Bromide)，溴吡斯的明(Pyridostigmine Bromide)。一些用于临床的季铵类抗胆碱酯酶药有依酚氯铵(Edrophonium Chloride，亦称腾喜龙)和安贝氯铵(Ambenonium Chloride，亦称酶抑宁，酶斯的明)。氢溴酸加兰他敏Galantamine Hydrobromide)为一种生物碱，作用均与新斯的明类似。加兰他敏和一些新开发的吖啶类抗胆碱酯酶药，目前正研究用于治疗老年性痴呆。众多研究发现一些具有乙酰胆碱酯酶抑制的活性成分，主要为生物碱类、萜类和香豆素类等结构类型的化合物，表1、图1分别对其活性和结构进行了归纳。其中生物碱类乙酰胆碱酯酶抑制剂如石杉碱甲、加兰他敏等因活性高、选择性强而受到广泛的关注。 不可（难）逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂 即，有机磷农药
重组乙酰胆碱酯酶的表达及其分子进化研究进展
董洁娴 等/重组乙酰胆碱酯酶的表达及其分子进化研究进展 Chinese Journal of Biotechnology May 25, 2012, 28(5): 557?564 https://www.360docs.net/doc/ee12143706.html,/cjbcn ?2012 Chin J Biotech, All rights reserved Received : August 30, 2011; Accepted : December 12, 2011 Supported by : National Natural Science Foundation of China (No. 30871755), Science and Technology Planning Project of Guangdong Province (No. 2009A020101004). Corresponding author : Yuanming Sun. Tel: +86-20-85283448; E-mail: ymsun@https://www.360docs.net/doc/ee12143706.html, 国家自然科学基金 (No. 30871755)，广东省科技计划项目 (No. 2009A020101004) 资助。 生物工程学报 重组乙酰胆碱酯酶的表达及其分子进化研究进展 董洁娴，李振峰，雷红涛，何永盛，王弘，孙远明 华南农业大学食品学院 广东省食品质量安全重点实验室，广东 广州 510640 董洁娴, 李振峰, 雷红涛, 等. 重组乙酰胆碱酯酶的表达及其分子进化研究进展. 生物工程学报, 2012, 28(5): 557?564. Dong JX, Li ZF, Lei HT, et al. Expression and molecular evolution of recombinant acetylcholinesterase for detection of pesticide residues: a review. Chin J Biotech, 2012, 28(5): 557?564. 摘 要: 乙酰胆碱酯酶 (Acetylcholinesterase ，AChE) 是酶抑制法检测农药残留的核心试剂。但天然提取的 AChE 存在含量低、纯化困难、稳定性差等不足，因此，高性能的重组AChE 制备成为研究学者关注的热点。文中综述了重组AChE 的表达、和分子进化等方面的研究成果，并指出酶定向进化策略与表面展示技术结合是重组AChE 活性改造的未来趋势。 关键词: 农药残留，重组乙酰胆碱酯酶，酶抑制检测法 Expression and molecular evolution of recombinant acetylcholinesterase for detection of pesticide residues: a review Jiexian Dong, Zhenfeng Li, Hongtao Lei, Yongsheng He, Hong Wang, and Yuanming Sun Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety , Food College of South China Agricultural University , Guangzhou 510640, Guangdong , China Abstract: Acetylcholinesterase (AChE) plays a key role in the pesticide determination. However, the extraction of AChE from natural materials has the disadvantages of low yield, complex purification and poor stability. Therefore, the preparation of recombinant AChE with high performance becomes the hot topic of researchers in recent years. In this article we summarize the progress in the expression of recombinant AChE and the improvement of its analytical characteristic. 综 述
乙酰胆碱酯酶活性测定
乙酰胆碱酯酶酶活的测试 作者：陈志坚 1 准备工作 0.1mol/L pH=8.0的磷酸缓冲液：NaH2PO4 1.68g，Na2HPO4 12.21g溶于1L水。 2 酶液制备 SD大鼠，断头处理后，冰台快速取大脑，放入玻璃皿中，玻璃皿加入少量冰冻的磷酸盐缓冲液( 磷酸盐缓冲液漂洗，用干净的滤纸吸去大脑组织表面的水分和血液，称质量) ，用眼科剪尽快剪碎组织块。将剪碎的组织倒入玻璃匀浆器中，再用少许冰冻磷酸盐缓冲液冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆器中进行冰浴匀浆。然后再加入冰冻的磷酸盐缓冲液，按脑组织质量与匀浆总体积1:10的比例，稀释混匀。将制备好的10%脑匀浆以3000r/min离心15min，取上清液待测。 3 酶活性抑制测试 3.1 配药液 参照脲酶实验 3.2DTNB 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、ATCh碘化硫代乙酰胆碱 0.0314mol/L DNTB，0.0314mol/L ATCH 3.3 酶活测试 在3.00ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液,混匀后37℃保温20min后, 依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。酶活力定义为每克脑蛋白每分钟水解底物的umol数。这是未加药酶活力为E1。 在2.98ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液，并加入不同浓度的药物（一个浓度测定一次），依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。计算出此时酶活，为E2。 抑制率计算公式为I（%）=(E1-E2)/E1*100% 得到一系列不同浓度的抑制率以后，利用SPSS计算出药物的IC50。
乙酰胆碱酯酶试剂盒说明书
人胆碱乙酰化酶(CHAc)ELISA试剂盒说明书 本试剂盒仅供体外研究使用! 预期应用 ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中CHAc含量。 实验原理 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗CHAc抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗CHAc抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的CHAc呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板：一块(96孔) 2. 标准品(冻干品)： 2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10 ng/ml，做系列倍比稀释(注：不要直接在板中进行倍比稀释)后，分别稀释成10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，0.156 ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，临用前15分钟内配制。如配制5 ng/ml标准品：取0.5ml (不要少于0.5ml ) 10 ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3. 样品稀释液：1×20ml。 4. 检测稀释液A：1×10ml。 5. 检测稀释液B：1×10ml。 6. 检测溶液A：1×120μl(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔)，实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如10μl 检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 7. 检测溶液B：1×120μl/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。 8. 底物溶液：1×10ml/瓶。 9. 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10. 终止液：1×10ml/瓶(2N H2SO4)。 11. 覆膜：5张 12. 使用说明书：1份
胆碱酯酶抑制剂
胆碱酯酶抑制剂治疗阿尔茨海默病的系统评价 自1997年首次使用胆碱酯酶抑制剂(ChEI)治疗阿尔茨海默病以来,多数临床医师和绝大多数患者均把胆碱能药物,如多奈哌齐、加兰他敏和利凡斯的明作为轻至重度阿尔茨海默病的一线药物治疗用药。这些药的药代动力学特征有轻度差异,但都是通过阻断乙酰胆碱酯酶,抑制乙酰胆碱这种与记忆相关的重要神经递质的失活。这类药物可以改善阿尔茨海默病的临床表现。为评估上述药物治疗因阿尔茨海默病引发的轻、中或重度痴呆的疗效,英国牛津大学的Birks检索了Cochrane痴呆与认知改善组登记库,从中提取相关数据进行分析,并于今年1月25日在线发表了分析结果。 多奈哌齐、加兰他敏和利凡斯的明这3种ChEI对轻至重度阿尔茨海默病都是有效的。在治疗开始前,无法确定药物治疗对哪些患者更有效。无证据表明ChEI治疗是没有价值效益的。尽管上述3种药的作用模式略有不同,但没有证据表明其疗效存在差异。与利凡斯的明相比,多奈哌齐导致的不良反应更少。如果在给患者用药前逐步细致地进行超过3个月的常规剂量滴定,患者对加兰他敏和利凡斯的明的耐受性与多奈哌齐相当。多奈哌齐的滴定较简单,因考虑使用较低剂量。 阿尔茨海默预后和治疗 认知功能的衰退是不可避免的,但病情进展的速度是不可预料的.存活期自2年至20年不等,平均为7年. 对阿尔茨海默病的一般性治疗原则与所有痴呆的治疗相同(见上文痴呆的治疗). 某些能增强胆碱能神经传递的药物,例如Donepezil[即安理申(aricept)],至少在疾病的早期阶段能暂时改善记忆功能.不过,这些药物并不能改变基本病理变化的稳步恶化.他克林(tacrine)引起的不良反应较多.安理申开始试用的剂量是每天晚上1次5mg,过4~6周以后,可增加至10mg；须连续用药数月才能评估其疗效.有关抗氧化剂(如维生素E),雌激素和非类固醇抗炎药的治疗尚在研究之中. 许多药物都能引起中枢神经系统不良反应,包括精神错乱和倦怠.镇静剂如苯二氮类药物,应尽可能避免使用.抗胆碱能药物,例如某些三环类抗抑郁剂,抗组胺制剂,抗精神病药物以及苯甲托品,均应避免使用. 银杏叶浸出物能使阿尔茨海默病或血管性痴呆病例的记忆丧失与其他症状进展有所减慢或有中度的逆转.银杏叶制剂可能起着自由基清除剂的作用.不良反应很轻微；治疗应用尚需进一步研究. 老年痴呆症前兆是什么 导读：一般老年痴呆症前兆有什么呢?由于前期老年痴呆症患者的生活基本可以自理，所以很多时候人们往往忽视了老年痴呆症前兆，被发现时基本都是中晚期了。因此了解老年痴呆症前兆可以帮助患者及时发现病情，以及更好的治疗老年痴呆症。 老年痴呆症,指的是一种持续性高级神经功能活动障碍,简单点说就是在没有意识障碍的状态下,记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面发生了障碍。一般老年痴呆症常常发生在50岁以后,起病隐匿,发展缓慢,最早期往往是以逐渐加重的健忘开始,如果不注意,通常不容易发现,常听有些老年人说:“老了,记性不行了,不中用了。”这其实可能就是老年痴呆症的先兆。 一般老年痴呆症前兆有什么呢?下面请百济药师来为大家介绍老年痴呆症前兆。 老年痴呆症前兆 1、记忆力减退：尤其是近记忆力减退是老年痴呆症早期最常见的前兆。经常忘记近期得到的一些信息，如约会、人名或电话，忘记熟人的名字，不记得刚刚发生(甚至自己做过)的事，还有拿什么东西转手就忘。 2、不能完成熟悉的工作：难以胜任日常家务，而这些家务通常不需要思考。例如，经常做饭的人现在却不知如何做，以前是个精于计算的人，现在连买菜的小账和简单的加减法都算不清。
昆虫对杀虫剂的抗性机制概述
昆虫对杀虫剂的抗性机制概述 摘要: 昆虫抗性机制的研究对于抗性监测、治理等具有重要意义, 综述了昆虫对几种杀虫剂的抗性机制。 关键词: 杀虫剂; 抗药性; 苏云金杆菌; 阿维菌素 随着杀虫剂长期、大量、广泛地使用, 昆虫对杀虫剂产生的抗性也越来越引起人们的关注。尽管在杀虫剂的更新、混合、交替使用方面做了大量工作, 延缓了杀虫剂抗性的产生, 但昆虫对杀虫剂的抗药性上升趋势仍不可遏制。综述了昆虫对化学农药、苏云金杆菌、阿维菌素的抗性机制。 1 昆虫对化学农药的抗性机制 1. 1 表皮穿透性的降低 昆虫表皮对药剂穿透性降低, 可延缓杀虫剂到达靶标部位的时间, 使昆虫有更多的机会来降解杀虫剂。虽然表皮穿透下降只表现低水平抗性, 但作为其它抗性因子的修饰者则很重要, 如与解毒作用相结合, 就可大大影响死亡率而增加抗性。表皮穿透性降低机制在家蝇、埃及伊蚊、致倦库蚊、淡色库蚊等均有发现[ 1] 。不同的杀虫剂或不同的昆虫表现出的穿透性降低在程度上存在差别, 但穿透性降低是所有昆虫抗性普遍存在的一个因素, 杀虫剂穿透性的降低是受Pen 基因所控制的[ 2] 。 1. 2 解毒酶活力的增强 与杀虫剂代谢相关的解毒酶的解毒作用增强是抗性产生的主要原因之一。这些解毒酶主要包括细胞色素P450 介导的多功能氧化酶、谷胱甘肽转移( GST ) 、水解酯酶等。多功能氧化酶是昆虫体内参与各类杀虫剂以及其它外源和内源化合物代谢的主要解毒酶系,可使杀虫剂降低或失去杀虫活性, 从而使昆虫产生抗药性。P450 酶系的解毒代谢能力增强是因为抗性昆虫体内P450 过表达。与抗性相关的P450 基因主要有6 个: CYP6A1、CYP6A2、CYP6A8、CYP6A9、CYP6B2 和CYP6D1[ 3] 。多功能氧化酶是多种昆虫对拟除虫菊酯、辛硫磷、吡虫啉、有机磷、氨基甲酸酯类以及生长调节剂定虫隆等多种杀虫剂产生抗性的主导因素。杀虫剂中许多有机磷化合物是被虫体的GST 所解毒。一些抗有机氯和有机磷的昆虫体内GST 含量很高。GST 解毒能力增强也是由于基因在体内的过表达。多种害虫
不同酶源乙酰胆碱酯酶的抑制剂筛选
· 27 · 刘佳莉1，2 ?苑玉和1?陈乃宏1 1. 天然药物活性物质与功能国家重点实验室，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京，100050，中国 2. 天津中医药大学，天津，300193，中国 【摘要】 目的：建立一种可靠、快速、便捷、经济的乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase ，AChE ）抑制剂的筛选方法，为新药发现阶段AChE 抑制剂的筛选提供经济可靠的微量筛选方法，然后对植物提取物样品进行筛选。方法：分别采用电鳗AChE 、人源红细胞AChE 、大鼠海马区、纹状体匀浆液中的AChE 为酶源。以96孔板为载体，利用优化的Ellman 方法，在生理pH 值和温度的条件下，以他克林和石杉碱甲作为阳性对照，检测对不同酶源AChE 的抑制作用，确定最佳酶反应条件（最佳底物浓度、反应时间、显色剂浓度），并对植物提取物样品的AChE 抑制作用进行检测。结果：采用上述四种酶源的AChE 进行AChE 抑制剂微量筛选方法操作简便快速、可靠经济。其中应用电鳗AChE 进行筛选显示灵敏度较高，他克林和石杉碱甲对电鳗AChE 的抑制作用相当，而对人源红细胞AChE 、大鼠海马区、纹状体匀浆酶源的抑制作用，石杉碱甲明显优于他克林，所筛选植物提取物对AChE 均没有抑制作用。结论：本实验中所建立的筛选方法操作简便、快速、可靠经济，可用于纯化合物的筛选。【关键词】 乙酰胆碱酯酶；石杉碱甲；他克林；阿尔茨海默病 【中图分类号】 R965.1 【文献标识码】 A 文章编号：2095-1396（2011）03-0027-004 Comparative Study on Screening Acetylcholinesterase Inhibitors from Different Enzyme Sources LIU Jia -li 1，2 ，YUAN Yu -he 1，CHEN Nai -hong 1 1. S tate Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines ，Institute of Materia Medica ，Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College ，Beijing ，100050，China 2. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine ，Tianjin ，300193，China 【ABSTRACT 】 Objective ：To establish a reliable ，fast ，convenient and economical method of screening acetylcholinesterase inhibitors ，and use it to screen acetylcholinesterase inhibitors from extracts of plants. Methods ：Using the optimized Ellman method ，we examined the inhibition effects of tacrine and huperzine on acetylcholinesterase enzyme from electric eel ，human erythro-cyte ，rat hippocampus ，striatum homogenate in 96-well plates under physiological pH value and temperature. The concentration of AChE ，substrate and DTNB ，and reaction time were optimized. We also detected the inhibition effect of plant extracts on AChE. Results ：Practical microassays for screening AChE inhibitors were successfully established by using AChEs mentioned above. 不同酶源乙酰胆碱酯酶的抑制剂筛选方法比较 基金项目： 国家自然科学基金项目（No.U832008，30973887，81073078，81102831，90713045，81072541），科技部项目（No.2010DFB32900）， 国家科技重大专项（No.2012ZX09301002-004） 作者简介：刘佳莉，女，硕士生；研究方向：神经药理学和神经生物学；Tel/Fax：+86-10-63165182，E -mail：liujialiyx@https://www.360docs.net/doc/ee12143706.html, 通讯作者：?陈乃宏，男，研究员，博士生导师；研究方向：神经系统疾患创新药物开发及作用机制；Tel/Fax：+86-10-63165177，E -mail： chennh@https://www.360docs.net/doc/ee12143706.html,
乙酰胆碱酯酶活性抑制剂筛选比色法检测试剂盒产品说明书
乙酰胆碱酯酶活性抑制剂筛选比色法检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 乙酰胆碱酯酶活性抑制剂筛选比色法检测试剂是一种旨在通过乙酰胆碱酯酶反应系统中，在抑制剂存在与否的情况下，所释放出巯基胆碱，与Ellman试剂反应后，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物，出现吸光峰值的变化，即采用比色法来评价样品酶活抑制能力的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种抑制剂筛选检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase；AchE；EC3.1.1.7），又称为红细胞胆碱酯酶（RBC cholinesterase），广泛存在于真核生物，包括某些植物，尤其在脑组织、神经肌肉连接处（neuromuscular junction）、中枢神经系统的胆碱能突触（cholinergic synapses）和红细胞膜上高度表达，催化主要的神经传导介质乙酰胆碱的水解反应，产生乙酸和胆碱，终止突触传导。其功能在于调节乙酰胆碱作用。神经毒气，例如有机磷沙林（Sarin），抑制乙酰胆碱酯酶活性，导致神经肌肉瘫痪，最终发生窒息（asphyxiation）。血清乙酰胆碱酯酶浓度显著降低与有机磷杀虫剂中毒有关，因此血液检测是环境污染的重要指标。基于人工合成底物碘化硫代乙酰胆碱（acetylthiocholine iodide），在抑制剂存在与否的情况下，通过乙酰胆碱酯酶的作用，水解产生乙酸和硫代胆碱（thiocholine），与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析乙酰胆碱酯酶抑制剂的效应。乙酰胆碱酯酶反应系统为： Acetylcholinesterase acetylthiocholine iodide →acetate + thiocholine inhibitor DTNB + thiocholine →TNB + choline-S-S-TNB 产品内容 缓冲液（Reagent A）20毫升 反应液（Reagent B）2毫升 底物液（Reagent C）2毫升 阴性液（Reagent D）1毫升 产品说明书1份 保存方式 保存在－20℃冰箱里；反应液（Reagent B）和底物液（Reagent C）避免光照；有效保证6月 用户自备
二化螟体内乙酰胆碱酯酶的分布及纯化方法
昆虫学报Acta Entomologica Sinica ,April 2002,45(2):209-214ISS N 045426296 基金项目:国家“九五”攻关项目(L9601)和江苏省“九五”攻关项目(BE96370) 第一作者简介:彭宇,男,1967年9月生,博士,教授,研究方向为昆虫抗药性及害虫生物防治。现联系地址:湖北大学生命科学学院,武汉210095,E 2mail :y fengw @public 1wh 1hb 1cn 收稿日期Received :2000211214;接受日期Accepted :2001204226 二化螟体内乙酰胆碱酯酶的分布及纯化方法 彭 宇,王荫长,韩召军,陈长琨,李国清 (南京农业大学植物保护学院,南京 210095) 摘要:研究了二化螟Chilo suppressalis 乙酰胆碱酯酶(AChE )的体躯和亚细胞分布,并用凝胶过滤层析和2种亲和层析方法从二化螟幼虫体内分离、纯化乙酰胆碱酯酶。结果表明:二化螟幼虫乙酰胆碱酯酶的活性主要集中于头部和胸部,而成虫胸部乙酰胆碱酯酶的活性最低,显著低于头部和腹部。成虫体内AChE 的活性明显高于幼虫。在亚细胞的分布上,乙酰胆碱酯酶主要位于膜上(86%),近46%的活性存在微粒体中。在3种纯化乙酰胆碱酯酶的方法中,以32羧基苯基2乙基二甲基铵作配体的亲和层析法纯化效果最佳,乙酰胆碱酯酶的最高纯化倍数为536105倍,产率30146%。关键词:二化螟;乙酰胆碱酯酶;亲和层析;分布;纯化 中图分类号:Q96519 文献标识码:A 文章编号:045426296(2002)022******* Distribution and purification of acetylcholinesterase in Chilo suppressalis PE NG Y u ,W ANG Y in 2Chang ,H AN Zhao 2Jun ,CHE N Chang 2K un ,LI G uo 2Qing (C ollege of Plant Protection ,Nanjing Agricultural University ,Nanjing 210095,China ) Abstract :The distribution in body and subcellular distributions and purification of cetylcholinesterase (AChE )in insec 2ticide 2resistant population of Chilo suppressalis were investigated.AChE was purified from the larvae of the same popula 2 tion by gel filtration and 2species of affinity chromatography on 32carboxyphenyl ethyldimethyl amm onium (CE A )and procainamide.The results showed that specific activity of AChE in adults was higher than that in larvae.AChE in larvae was distributed m ostly in the head and the thorax ;in adults ,AChE activity in thorax was lower than those in the head and the abdomen significantly.The major portion of the total AChE was member 2bound (86%)and ass ociated pri 2marily with micros ome (46%).A ffinity chromatography on CE A was optimum for purification of AChE am ong 3species purified methods.The extent of purification reached about 536105folds with recoveries of 30146%.K ey w ords :Chilo suppressalis ;acetylcholinesterase ;affinity chromatography ;distribution ;purification 乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase ,AChE )(EC 3111117)是昆虫神经系统中最重要的酶系之一,同时又是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标(F ournier and Mutero ,1994)。AChE 的敏感度降低是昆虫和螨类对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂产生抗性的重要机理之一(T ang ,1993;G unning et al .,1998)。我们的研究表明,二化螟Chilo sup 2pressalis 对甲胺磷的抗性也与AChE 的敏感性下降有关(彭宇等,2001)。有关AChE 的研究一直是昆虫毒理学研究的热点,主要内容涉及AChE 的毒理学、生物化学,AChE 的分离、纯化,AChE 的分子型、基因结构和表达,AChE 的变构与昆虫抗药性的关系等(Zhu and Brindely ,1992;Zhu and Clark ,1994,1995;高希武,1996,1998)。本文报道了二 化螟体内AChE 的分布,并采用凝胶过滤层析和2种亲和层析方法,从二化螟幼虫中分离、纯化AChE ,以便更好地了解AChE 在二化螟抗药性中的作用。 1 材料与方法 111 虫源 试验所用的二化螟为采自浙江温岭的抗性品系,用稻苗饲养(尚稚珍和王银淑,1984)。112 试剂 考马斯亮蓝G 250、碘化硫代乙酰胆碱、毒扁豆碱均为Fluka 公司产品。5,5′2二硫双硝基苯甲酸(DT NB ),华美公司。溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B (C NBr 2Sepharose 4B ),羟乙基活化的琼脂糖凝胶4B