应用基因重排技术诊断淋巴瘤
2021年淋巴瘤诊疗规范(版)
淋巴瘤诊疗规范（2018年版）欧阳光明（2021.03.07）一、概述淋巴瘤（lyphoma）是我国最常见的恶性肿瘤之一。
根据国家癌症中心公布的数据，2014年我国淋巴瘤的确诊发病率为 5.94/10万，2015年预计发病率约为 6.89/10万。
由于淋巴瘤病理类型复杂，治疗原则各有不同，为进一步提高淋巴瘤诊疗能力和规范化水平，配合抗肿瘤药品供应保障有关政策调整，保障医疗质量与安全，现对《中国恶性淋巴瘤诊疗规范（2015年版）》进行修订和更新。
二、淋巴瘤的诊断应当结合患者的临床表现、体格检查、实验室检查、影像学检查和病理学等进行诊断。
（一）临床表现淋巴瘤的症状包括全身和局部症状。
全身症状包括不明原因的发热、盗汗、体重下降、皮肤瘙痒和乏力等。
局部症状取决于病变不同的原发和受侵部位，淋巴瘤可以原发于身体的任何器官和组织，通常分为原发于淋巴结和淋巴结外两大类。
最常见表现为无痛性的进行性淋巴结肿大。
如有以上述症状的患者在基层医院就诊时，应予以重视，并尽早转诊至上级医院或肿瘤专科医院。
（二）体格检查应特别注意不同区域的淋巴结是否增大、肝脾的大小、伴随体征和一般状态等。
（三）实验室检查应完成的实验室检查包括血常规、肝肾功能、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、β2微球蛋白、红细胞沉降率、乙型肝炎和丙型肝炎病毒检测以及骨髓穿刺细胞学和活检等，还应包括人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）筛查在内的相关感染性筛查。
对原发胃的黏膜相关边缘带B细胞淋巴瘤，应常规进行幽门螺杆菌（helicobacter pylori，Hp）染色检查；对NK/T细胞淋巴瘤患者，应进行外周血EB病毒DNA滴度检测。
对于存在中枢神经系统受累风险的患者应进行腰穿，予以脑脊液生化、常规和细胞学等检查。
（四）影像学检查常用的影像检查方法：计算机断层扫描（computed tomography，CT）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，MRI）、正电子发射计算机断层显像（positron emission tomography，PET-CT）、超声和内镜等。
弥漫性大B细胞淋巴瘤bcl
弥漫性大B细胞淋巴瘤bcl蒋会勇，陈愉，张三泉，朱梅刚，赵彤【关键词】弥漫Correlation between bcl2/IgH gene rearrangement and GCB molecular subtype in diffuse large Bcell lymphoma【Abstract】AIM: To explore the correlation between bcl2/IgH gene rearrangement and germinal center Bcelllike (GCB) molecular subtype in diffuse large Bcell lymphoma (DLBCL). METHODS: Selfdesigned heminested PCR was used to detect bcl2/IgH gene rearrangement in 60 cases of DLBCL. Positive PCR products were cloned and sequenced. The tissue microarray of 60 specimens of DLBCL was prepared and the expressions of CD20, CD10, Bcl6 and MUM1 were investigated by immunohistochemical SP method. GCB and nongerminal center Bcelllike (nonGCB) were subclassified. RESULTS: Six of the 60 DLBCL were bcl2/IgH positive by conventional PCR method. Selfdesigned heminested PCR was used to amplify 6 positive cases again and bcl2/IgH gene was verified rearrangement in 5 cases by cloning and sequencing and 1 had the gene segment of BAC331191 of human chromosome 19. CD20 waspositive in the 60 DLBCL cases. Positive expression rates of CD10, Bcl6 and MUM1 were %, % and % respectively. 32 %) were GCB and 28 %) were nonGCB. Bcl2/IgH gene rearrangementpositive cases were all GCB subtypes, which were significantly correlated with the expression of CD10 (P= and not with Bcl6 and MUM1. CONCLUSION: Selfdesigned heminested PCR can improve the detection accuracy of bcl2/IgH gene rearrangement. Bcl2/IgH gene rearrangement detection helps the DLBCL determination of GCB subtypes.【Keywords】 lymphoma, Bcell, diffuse large；bcl2; gene rearrangement【摘要】目的: 探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）bcl2/IgH 基因重排与分子亚型生发中心样（GCB）的相关性. 方式:采纳自行设计的半巢式PCR对60例DLBCL的bcl2/IgH基因重排进行了检测，并对阳性产物进行克隆、测序. 同时采纳免疫组化SP法在组织微阵列上同步观测CD20，CD10，Bcl6，黑色素瘤相关抗原（突变体）1 (MUM1)的表达,进行GCB和非生发中心样(nonGCB)分子分类. 结果: 常常规法扩增bcl2/IgH，有6/60例DLBCL bcl2/IgH阳性；在6例阳性样本中,采纳本组设计的半巢式PCR扩增，经克隆及测序证明5例bcl2/IgH 基因重排阳性，1例为人类第19号染色体BAC 331191基因的片段. 60例DLBCL CD20表达全数阳性；CD10，Bcl6， MUM1的阳性表达率别离为%，%，%；GCB 32（%）例，nonGCB 28（%）例. bcl2/IgH基因重排阳性的病例均属GCB分子亚型, 且与CD10表达有显著性相关（P=），而与Bcl6及MUM1表达无相关性. 结论:利用本组设计的半巢式PCR 可提高bcl2/IgH基因重排检测的准确性. bcl2/IgH基因重排的检测可协助确信部份GCB分子亚型的DLBCL.【关键词】弥漫性大B细胞淋巴瘤； bcl2; 基因重排0引言弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large Bcell lymphoma, DLBCL）是最多见、高度恶性的非霍奇金淋巴瘤，但新近cDNA芯片的研究结果显示，该瘤存在生发中心样（germinal center Bcelllike，GCB）和非生发中心样（non germinal center Bcelllike, nonGCB）两种分子亚型，GCB的预后明显好于nonGCB类型［1-2］. Hans等［3］以cDNA 芯片为参照标准，发觉利用“套餐”式免疫标记物CD10，Bcl6，黑色素瘤相关抗原（突变体）1 ［melanoma associated antigen(mutated)1, MUM1］也能够对DLBCL进行分子分类. bcl2/IgH基因重排是人类恶性淋巴瘤最多见的染色体异样，存在bcl2基因重排的病例有较好的生存率. 咱们利用组织微阵列(tissue microarray, TMA)技术对60例DLBCL进行分子分类, 采纳PCR技术检测bcl2/IgH基因重排，探讨bcl2/IgH基因重排与分子亚型的相关性，旨在为临床判定DLBCL的预后提供更多的信息.1材料和方式1．1材料1999/2003年诊断明确资料齐全的DLBCL 60（男29，女31）例，中位年龄（16~91）岁，所有标本均为40 g/L中性甲醛固定, 常规石蜡切片HE染色. 由3名专门从事淋巴瘤研究的医师按新的WHO分类方式进行诊断. SP试剂盒购自北京中山生物技术; CD20购于福州Maxim公司；CD10购于美国Zymed公司；Bcl6购于美国Neomarker 公司； MUM1 mAb由意大利Perugia大学血液病研究所Dr. Falini馈赠.1．2方式1．IgH基因重排的检测DNA提取采纳我室成立的石蜡切片刮片法，每例切片1张，厚 3 μm，常规脱蜡、干燥. 用无菌刀片刮入Eppendorf管，加入50 μL消化液(10 mmol/L , 1 mmol/L EDTA, 200 mL/L Tween 20)，同时加入蛋白酶K（终浓度为200 mg/L），56℃水浴孵育留宿，充分消化后，98℃, 10 min灭活蛋白酶K，12 000 g离心10 min，分装上清液，用分光光度计检测DNA的浓度，将浓度调整至200～400 μg/L，-20℃保留备用.1．2．2半巢式PCR检测bcl2/IgH基因重排bcl2/IgH 基因重排的检测采纳半巢式PCR. 第一次扩增PCR引物为：上游:MBR 5′TTAGAGAGTTGCTTTACGTGGCCTG3′; 下游JH1: 5′ACCTGAGGAGACGGTGACC3′. 该对引物为检测bcl2/IgH 基因重排经常使用引物［4］. 利用专业的引物设计软件Primer premier, 咱们在MBR下游设计了第二重引物: Mbr1 5′CAACACAGACCCACCCAGAG3′与原下游引物JH1组成半巢式PCR反映的第二对引物. 反映体系为:10×PCR 缓冲液2 μL, 25 mmol/L MgCl2 μL, 10 mmol/L dNTP μL,上下游引物各μL,Taq DNA聚合酶μL，模板1 μL(浓度200~500 mg/L),三蒸水μL,总反映体系为20 μL. 半巢式PCR的反映体系为10×PCR缓冲液2 μL, 25 mmol/L MgCl2 μL, 10 mmol/L dNTP μL,上下游引物各1 μL, Taq DNA聚合酶μL，模板1 μL,三蒸水μ℃变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 共35个循环，然后，72℃终末延伸10 min，4℃保留30 min. 半巢式PCR 模板为一步法的产物稀释100倍. 产物以20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭（EB）μL染色. 所有PCR操作进程中严格按PCR操作规程进行. 阳性对照采纳经测序证明为基因重排阳性的DNA，阴性对照为双蒸水. PCR阳性产物经TA克隆连于T载体，送上海博亚公司进行测序. 测序采纳3730测序仪，DNA测序技术要紧依据Sanger双脱氧链终止法. 测序结果在基因库中进行比对，以明确是不是为 bcl2/IgH 基因重排片段.制作第一对60例DLBCL蜡块组织的苏木精-伊红染色切片作形态学观看，选择有代表性的肿瘤区域，在相应位置进行标记；然后利用组织微阵列仪（Beecher Instruments, MTA1）制作受体蜡块并打孔，依照原有切片的标记部位，用供体针在蜡块相应部位取样，所用组织芯直径为 mm，将供体组织芯放入受体蜡块. 每例标本在标记区域内随机取2~4条组织芯. 在组织样本填入蜡孔时记录每一个样本在二维阵列中的具体位置，并在必然位置上标记出TMA的方位.免疫组化染色采纳SP法进行免疫组化染色. 以CD20染色来判定每一个组织点的肿瘤细胞数，每例标本以肿瘤细胞数最多的点作分析. 抗体的阳性判定标准为：CD20，CD10阳性定位于细胞膜，Bcl6，MUM1阳性定位于细胞核, >20%的肿瘤细胞染色判为阳性［3］. 采纳CD10， Bcl6和MUM1 3种抗体对DLBCL进行分类［3］. CD10， Bcl6作为生发中心细胞的标志物，CD10+或CD10+/Bcl6+为GCB类；CD10-/Bcl6-为nonGCB类；MUM1作为后生发中心细胞来源的标志物，假设CD10-/Bcl6+，那么用MUM1来分类：MUM1+为nonGCB类，MUM1-为GCB类.统计学处置: 利用SPSS 软件,对数据进行Fisher精准查验. 2结果2．1组织学分型依照WHO新分类方式对DLBCL进行分型，中心母细胞型(centroblastic，CB) 53例%)，免疫母细胞型（immunoblastic，IB）3例%)，间变性大B细胞型（anaplastic，AP) 2例%)，未分型2例%).2．2蛋白表达60例DLBCL患者的组织切片CD20表达全数阳性. CD10， Bcl6， MUM1的阳性表达率别离为%， %， %，其中CD10+ Bcl6+ 14例， CD10+/MUM1+ 13例，Bcl6+/MUM1+ 16例，CD10+/Bcl6+/MUM1+ 8例（图1）. 经统计学分析，年龄性别等因素与CD20, CD10, Bcl6表达无关（表1）.2．3DLBCL TMA分子分类60例DLBCL中， 32例（%）GCB，28例（%）nonGCB. 在32例GCB类中， 26例（%）CD10+，18例（%）Bcl6+，14例（%） CD10+/Bcl6+， 6例%) CD10-/Bcl6+. 在28例nonGCB类中，24例（%）MUM1+，8例（%） MUM1+/Bcl6+.A：细胞膜CD20+ ×100; B：细胞核Bcl6+ ×100; C: 细胞膜CD10+ ×200; D: 细胞核MUM1+ ×100.图1弥漫性大B细胞淋巴瘤免疫组化染色SP2．4基因重排检测因bcl2/IgH基因断裂在不同病例略有不同，因此扩增出的片段为100～300 bp(图2). 经一步法扩增，发觉6例阳性，对阳性样本进行半巢式PCR扩增时发觉5例基因重排阳性，考虑一步法扩增有假阳性，经克隆及测序证明为人类第19号染色体BAC331191基因的片段，其序列为: TTAGAGAGTTGCTTTACGTGGCCTGCCTCTCTCACCTCCCAGGTGAACGGTGTGGACATGAAGCTGCCCGTGGTGCTGGCCAACGGCCAGATCCGTGCCTCCCAGCATGGTTCAGATGTTGTGATTGAGACCGACTTCGGCCTGCGTGTGGCCTACGACCTTGTGTACTATGTGCGGGTCACCGTCTCCTCAGGT, 因此bcl2/IgH基因重排为5例. 基因重排阳性的5例病例均为GCB亚类. CD10阳性及阴性病例bcl2/IgH基因重排的发生率别离为%(5/26)及0%(0/34)，有统计学不同（P=）(表1).表1弥漫性大B细胞淋巴瘤免疫组化与临床资料及bcl2/IgH基因重排关系(略)图2PCR检测bcl2/IgH重排3讨论本组60例DLBCL，CD10的阳性率高于西方Hans等［3］的28%和Colomo等［4］的21%, 可能与本组选用的病例多为CB变型的B细胞淋巴瘤有关. CD10诊断GCB的灵敏性较低，经CD10和Bcl6联合应用，在GCB类中发觉了6例CD10阴性、Bcl6阳性，说明联合应用CD10及Bcl6可提高GCB亚类的检出率. 本组检测MUM1阳性率与文献报导（50%~77%）相近［5-6］. 咱们利用传统引物进行bcl2/IgH基因重排检测发觉的阳性样本，采纳本组设计的半巢式PCR扩增及克隆、测序证明有1例为人类第19号染色体BAC 331191基因的片段，该片段的上下游别离有9个碱基能与传统引物互补配对，因此进行PCR时可能将其扩增出来，而非真正的基因重排. 这可能是传统引物检测重排发生假阳性的分子生物学基础. 结果显示采纳咱们所设计的半巢式PCR 引物检测bcl2/IgH基因重排可有效的幸免假阳性的发生. 在咱们的研究中，所有存在bcl2基因重排的病例均表达CD10，统计学资料说明二者存在相关性，因此通过对bcl2基因重排的检测可确信部份GCB 类的DLBCL. 这部份DLBCL与其它类型的DLBCL相较可能有不同的发病机制，属不同的疾病亚型［7-8］. 正确的检测方式对这种疾病的正确诊断有着重要意义，咱们利用的半巢式PCR提高了诊断重排的准确性.本研究在进行免疫组化进程中，咱们采纳了TMA技术，由于所有标本均在一张切片上进行免疫组化染色，人为误差少，一致性更强，有助于在同一水平进行观看分析和比较研究，因此本研究的免疫组织化学染色结果是靠得住的.【参考文献】［1］ Rosenwald A, Wright G, Chan WC, et al. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse largeBcell lymphoma［J］. N Engl J Med,2002,346(25):1937-1947.［2］ Shipp MA, Ross KN, Tamayo P, et al. Diffuse large Bcell lymphoma outcome prediction by geneexpression profiling and supervised machine learning ［J］. Nat Med, 2002,8(1):68-74.［3］Hans CP, Weisenburger DD, Greiner TC, et al. Confirmation of the molecular classification of diffuse large Bcell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray ［J］. Blood, 2004,103(1):275-282.［4］ Colomo L, LopezGuillermo A, Perales M, et al. Clinical impact of the differentiation profile assessed by immunophenotyping in patients with diffuse large Bcell lymphoma ［J］. Blood, 2003,101(1):78-84.［5］Tsuboi K, Iida S, Inagaki H, et al. MUM1/IRF4 expression as a frequent event in mature lymphoid malignancies ［J］. Leukemia, 2000,14(3):449-456.［6］ Natkunam Y, Warnke RA, Montgomery K, et al. Analysis of MUM1/IRF4 protein expression using tissue microarrays and immunohistochemistry ［J］. Mod Pathol, 2001,14(7):686-694.［7］ Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, et al. Distinct types of diffuse large Bcell lymphoma identified by gene expression profiling ［J］. Nature, 2000,403(6769):503-511.［8］ Huang JZ, Sanger WG, Greiner TC, et al. The t(14,18)defines a unique subset of diffuse large Bcell lymphoma with a germinal center Bcell gene expression profile ［J］. Blood, 2002,99(7):2285-2290.。
淋巴瘤的临床诊断思路
内容
• 淋巴瘤的检查方法 • 淋巴瘤规范诊断的意义
• 淋巴瘤病理诊断的重要意义 • 淋巴瘤的分期及意义 • IPI评分 • 早期诊断 部分淋巴瘤能治愈
必要的检查不可少
• 淋巴瘤是一种复杂的疾病，治疗开始前，需要进 行彻底的检查，才能准确划分疾病类型和阶段， 采用最合适的治疗方案，同时，治疗过程中的定 期检查也可以作为判断治疗是否有效的一个依据 。因此，一些必要的检查是不可缺少的。
淋巴瘤的检查方法
• 淋巴瘤的确诊，特别是对于初诊患者，最主要是依靠对病 灶的组织病理学检查，当然也要结合体格检查、影像学和 核医学检查、血液生化检查以及血液、骨髓检查结果作综 合分析和判断
– 组织病理学检查： HE染色切片、辅助检查（免疫组化、基因重排、原位 杂交、流式细胞分析等）
– 其它检查：细胞病理学检查（病灶、血液、骨髓）、 血液生化检查、体格检查、影像学（CT）和核医学 （PET-CT）检查等
混合细胞型
淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜 较差，平均存活2.5年，易转 酸粒细胞及中等量RS细胞混同存在 为其他组织恶性肿瘤
淋巴细胞减少型
淋巴细胞少见，RS细胞大量增生或呈 纤维硬结样
最差，1年左右
内容
• 淋巴瘤的检查方法 • 淋巴瘤规范诊断的意义 • 淋巴瘤病理诊断的重要意义
• 淋巴瘤的分期及意义
非霍奇金淋巴瘤的临床分期
• 非霍奇金淋巴瘤的分期大致比照霍奇金病的分期 ，但由于它的发病部位常呈 “跳跃式”，分期与 临床预后的相关性不如霍奇金淋巴瘤。
• 非霍奇金淋巴瘤的类型很多，结合其临床表现， 分为低度恶性，中度恶性或高度恶性疾病以供治 疗参考。
分期诊断的价值
• 选择治疗方案前，医生需要根据患者的病情进行 临床分期，针对不同的病情来做最适当的治疗和 估计预后
基因重组与基因重排
基因重组与基因重排基因重组和基因重排是分子生物学领域中的两个重要概念，它们对于理解基因组结构和功能的演化以及生物多样性的形成具有重要意义。
本文将就基因重组和基因重排的定义、机制以及其在生物学研究中的应用进行探讨。
一、基因重组的定义和机制基因重组是指在染色体水平上，以某种方式重组基因序列的现象。
通常情况下，基因重组是通过基因间的交叉互换发生的，它能够导致基因型的重组组合。
基因重组的机制主要是由DNA上的同源重组过程控制的。
同源重组是指在有相同或相似的DNA序列的两条父本DNA分子之间，通过物理相互作用引起的基因重组现象。
同源重组的主要步骤包括DNA片段的剪接和连接，以及DNA链的交叉互换。
这种重组机制使得基因序列在不同个体之间的组合得以改变，从而增加了基因组的多样性。
二、基因重排的定义和机制基因重排是指在染色体上，由于基因片段间的插入、删除或倒位等变化而导致的基因序列重排现象。
基因重排通常发生在免疫系统中，它对于免疫细胞的发育和功能具有重要作用。
基因重排的机制主要涉及DNA片段的重新排列和连接。
比如，在免疫系统中，B细胞和T细胞的免疫受体基因通过基因重排机制来生成多样性的抗体和T细胞受体。
这种重排过程涉及到基因片段的插入、删除和倒位等调整，以及基因片段之间的剪切和重连。
基因重排的发生使得免疫系统能够识别和应对多样性的抗原，从而保证了机体对抗病原体和其他外界入侵的能力。
三、基因重组与基因重排的应用基因重组和基因重排的研究在生物学领域有广泛的应用。
以下是一些典型的应用领域：1. 生物工程：基因重组技术是生物工程中最常用的技术之一，它可以通过将外源基因插入到宿主生物的基因组中，实现对目标物质的生产和表达。
例如，利用基因重组技术，人类生产了许多重要的药物和工业化合物，如胰岛素和乳酸菌。
2. 进化研究：基因重组和基因重排对于演化过程的研究很重要。
通过比较不同物种中的基因重组和重排事件，可以了解基因组的进化历程和生物多样性的起源。
nkt细胞淋巴瘤诊断标准
nkt细胞淋巴瘤诊断标准一、引言nkt细胞淋巴瘤是一种相对少见的非霍奇金淋巴瘤，其诊断标准对于确定疾病类型、制定治疗方案和评估预后具有重要意义。
本文将就nkt细胞淋巴瘤诊断标准的相关方面进行综述，以期为临床医生和研究人员提供参考。
二、nkt细胞淋巴瘤概述nkt细胞淋巴瘤是一种起源于NK或T细胞的恶性肿瘤，属于非霍奇金淋巴瘤的一种亚型。
该病发病机制尚未完全明确，但与EB病毒感染、免疫缺陷状态、长期慢性炎症刺激等因素有关。
nkt细胞淋巴瘤临床表现多样，可累及淋巴结、骨髓、消化道等多个器官和组织。
三、病理学诊断标准病理学诊断是nkt细胞淋巴瘤确诊的金标准。
病理学诊断主要依赖于淋巴结或受累组织活检的病理组织学检查。
以下为nkt细胞淋巴瘤的病理学诊断标准：1.肿瘤细胞形态学：肿瘤细胞形态不规则，大小、染色深浅不一，核分裂像多，胞质少。
根据肿瘤细胞的形态特征可分为弥漫型和结节型。
2.免疫表型：肿瘤细胞表达T细胞或NK细胞相关抗原，如CD3、CD56、TIA-1等，不表达B细胞相关抗原如CD20。
免疫表型分析有助于鉴别nkt细胞淋巴瘤与其他类型的淋巴瘤。
3.遗传学改变：nkt细胞淋巴瘤可伴有t(2;5)、t(10;14)、inv(14)等染色体异常，以及MYC、BCL-2和BCL-6基因重排。
这些遗传学改变有助于确诊和疾病分型。
4.EB病毒感染：EB病毒感染与nkt细胞淋巴瘤发病密切相关。
约70%的nkt细胞淋巴瘤患者EB病毒抗体阳性，肿瘤组织中可检测到EB病毒DNA。
四、临床诊断标准在病理学诊断的基础上，结合临床表现、实验室检查和影像学检查可作出临床诊断。
以下为nkt细胞淋巴瘤的临床诊断标准：1.临床表现：nkt细胞淋巴瘤患者可出现淋巴结肿大、脾脏肿大、全身症状如发热、盗汗、消瘦等。
受累器官和组织的临床表现因肿瘤侵犯部位而异。
2.实验室检查：血常规检查可发现贫血、血小板减少和白细胞增多等异常；生化检查可见肝肾功能异常、高血钙等；免疫学检查可发现免疫球蛋白异常、自身抗体阳性等。
皮肤假性淋巴瘤组织病理与基因重排特点
合临 床 、 织病 理 、 组 免疫 组 化 和（ ） 因重 排 与长期 或 基 随访 ， 以鉴别 本 课 题 旨在 应 用 聚 合 酶链 式 反 Ｊ 加 立
瘤 转化 的可 能 ， 判断 预后 和 临床 随访 提供 依据 。 为
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考 文 献 ＿ ｊ 电泳 分 析 ： 上 述 Ｐ Ｒ 产 物 １ ， １ 。 取 Ｃ ０ ｌ加
据 处理 ， 用 Ｓ Ｓ １ ． 统 软 件 分析 ， 采 Ｐ Ｓ ３ ０系 Ｐ＜０ ０ ． ５表 示 有统 计 学意义 。
２ 结 果
公司 ） ３例 皮 肤 假 性 淋 巴 瘤 标 本 为 １ ９ 。１ ９ ９—２ ０ ０７
（ Ｃ 方 法 ， 究 Ｃ Ｉ患 者 石 蜡 标 本 组 织 Ｔ 细 胞 受 Ｐ Ｒ） 研 Ｐ
ＩＨ 基 因 引 物 序 列 为 Ｆ Ｒ ５’ ｇ ３ Ａ： 一ＡＣ （ Ｃ Ａ Ｃ； Ｃ Ｇ Ｇ Ｆ ７ Ａ Ｃ ｑ ＿３ ， Ｊ ５ ～ Ｉ Ａ ＧＧ Ｃ Ｇ ’ ＴＴ Ａ Ｔ Ｇ 、 ’Ｉ Ｈ： ’ ＇ Ａ ＧＡ Ｇ
具 有重要 价值 。
关 键 词 皮 肤 假 性 淋 巴 瘤 ； 织 病 理 学 ； 疫 组 化 ； 因 重排 ； 合 酶 链 式 反 应 组 免 基 聚 皮肤假 性淋 巴瘤 是一 组 由多 种 因素刺 激 引起 的 Ｄ ＮＡ。 Ｐ Ｒ 扩 增 ： Ｃ Ｃ Ｔ Ｒ一口基 因 引 物 序 列 为 Ｔ Ｒ一 Ｃ
基因重排检测技术联合玻璃体液中IL-10和IL-6检测对PIOL的诊断价值
关键词：原发性眼内淋巴瘤；基因重排检测技术；细胞因
子；白介素-10；白介素-6 D01: 10.3980/j.issn.1672-5123.2021.7.05
1162
Analysis of the diagnostic value of gene rearrangement detection combined with vitreous fluid IL - 10 and IL-6 cytokine detection for primary intraocular lymphoma
were 71. 43% and 100. 00%. Patients with PIOL had significantly higher vitreous humor IL-10 and IL-10/IL- 6
levels than those with uveitis, but no statistically
“恶性淋巴瘤”的临床诊断及治疗方法
“恶性淋巴瘤”的临床诊断及治疗方法一概述恶性淋巴瘤（malignant lymphoma，ML）是一组起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤的总称，其主要临床表现是无痛性淋巴结肿大，全身各组织器官均可受累。
淋巴瘤患者在发现淋巴结肿大前或同时可出现发热、盗汗、消瘦、皮肤瘙痒等全身症状。
根据病理、临床特点以及预后转归等将淋巴瘤分为非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）和霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma，HL）两类。
HL的病理学形态特征为多种非肿瘤性炎症细胞增生的背景中见到诊断性的里-斯（Reed-Steinberg，R-S）细胞。
2008年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）将HL按照病理类型分为结节性淋巴细胞为主型和经典型，后者包括：富于淋巴细胞的经典型、结节硬化型、混合细胞型和淋巴细胞消减型。
NHL是一组具有较强异质性的淋巴细胞异常增殖性疾病的总称，其发病率远高于HL。
NHL的组织病理学特点是淋巴结结构消失，皮质和髓质分界不清，淋巴窦及淋巴滤泡或淋巴结包膜受侵，整个淋巴结呈弥漫性，为不同分化程度的淋巴细胞代替。
根据NHL 的自然病程，可以分为三大临床类型，即高度侵袭性、侵袭性和惰性淋巴瘤。
根据淋巴细胞起源的不同，又可分为B细胞、T细胞和自然杀伤（natural killer，NK）细胞淋巴瘤。
二病因淋巴瘤是在机体内外因素的共同作用下，不同发育阶段的免疫活性细胞发生分化和增殖异常引起的疾病。
淋巴瘤的病因至今尚未完全阐明，其发生发展涉及遗传、病毒及其他病原体感染、放射线、化学药物等理化因素及免疫状态等诸多发面。
三临床表现ML是具有相当异质性的一大类肿瘤，虽然好发于淋巴结，但是由于淋巴系统的分布特点，使得淋巴瘤基本上属于全身性疾病，几乎可以侵犯到全身任何组织和器官。
因此，ML的临床表现既具有一定的共同特点，同时按照不同的病理类型、受侵部位和范围又存在着很大的差异。
DNA重排的检测方法
小麦－簇毛麦F1 代染色体间易位
染色体涂染显示人染色体组
荧光标记探针
• 不对环境构成污染 • 灵敏度能得到保障 • 可进行多色观察分析，可同时使用多个
探针，缩短因单个探针分开使用导致的 周期过长和技术障碍。
4. 比较基因组杂交
Comparative Genomic Hybridization (CGH)
• 原理：在扩增反应中加入不等量的两段寡核 苷酸引物，引物量相差100倍，通过PCR扩增 获得单链DNA，然后利用双脱氧法直接测序。
• 应用：扩增产物的测序，可以很容易确定群 体中某一特定基因的序列变异情况，这种方 法是了解目的基因突变的较理想的方法。
(5) 原位PCR技术
• 原理：即聚合酶原位扩增技术。将PCR技术 与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织 的原有位置，直接在组织、细胞或病原体原 位研究基因变化的技术。
光谱核型分析原理(Spectral karyotyping, SKY)
1996 年 Schroch等首次描述了SKY技术。 应用5种荧光素同时标记24条人染色体，制成 染色体涂染探针，应用Fourier光谱仪，CC成 像和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处 理，46条染色体形成具有不同颜色的核型影像, 可用以分析各种染色体异常。
应用：
• 主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化 • 物种间染色体同源性比较 优势：
• 可快捷检测中期、间期基因组 • 不需预先知道DNA发生改变的部位 • 一次实验即可检出待测样本整个基因
组拷贝数的增减
四、分子生物学技术
1. Southern-blotting • 应用于基因重排检测是1981年Korsmeyer等
• 优势：Southern分析已被应用于IgH、 Igk、 Igl及各种TCR(T-细胞受体)克隆性重排的检测， 并以其令人满意的灵敏度和可靠性被视为基因 重排检测的“金标准”。
肝脾T细胞淋巴瘤13例临床病理分析及预后
肝脾T细胞淋巴瘤13例临床病理分析及预后陈旭;赵武干;王冠男;李文才【摘要】目的探讨肝脾T细胞淋巴瘤(HSTCL)的临床病理学特点、诊断及鉴别诊断.方法收集13例HSTCL的临床资料并进行形态学观察,应用免疫组化和TCR基因重排检测,并复习相关文献.结果 13例瘤细胞CD2、CD3、CD7均阳性,T细胞限制性胞内抗原TIA-1、CD56部分阳性,细胞毒性相关分子粒酶B(Granzyme-B)、EBER阴性.11例标本TCR克隆性重排检测阳性.13例患者临床治疗方案不同(脾切除术后化疗,保脾化疗,自体造血干细胞移植),随访6～58个月,预后均较差.结论HSTCL是一类罕见的结外侵袭性外周T细胞淋巴瘤,其病理表现多样且独特,结合免疫表型、TCR基因重排可确诊.【期刊名称】《河南外科学杂志》【年(卷),期】2019(025)003【总页数】3页(P1-3)【关键词】肝脾T细胞淋巴瘤;γδT细胞抗原受体;TCR基因重排【作者】陈旭;赵武干;王冠男;李文才【作者单位】郑州大学第一附属医院病理科郑州 450052;郑州大学第一附属医院病理科郑州 450052;郑州大学第一附属医院病理科郑州 450052;郑州大学第一附属医院病理科郑州 450052【正文语种】中文【中图分类】R730.263肝脾T细胞淋巴瘤(Hepatosplenic T cell lymphoma，HSTCL)是一种较罕见的外周T细胞淋巴瘤(Peripheral T cell lymphoma，PTCL)，占非霍奇金淋巴瘤的10%～20%，占所有外周T细胞淋巴瘤的5%以下[1]。
1990年首次提出，1994年被REAL分型确认为一个独立的淋巴瘤亚型。
根据T细胞受体(T-cell receptors，TCR)的不同，HSTCL分为γδ和αβT细胞淋巴瘤两种亚型，前者占绝大多数。
WHO(2001)淋巴造血系统肿瘤分类将其正式归入PTCL，命名为HSTCL。
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应用基因重排技术诊断淋巴瘤
淋巴瘤是发生于淋巴组织的恶性肿瘤。
淋巴组织由T、B淋巴细胞，组织细胞等免疫活性细胞组成。
由于其组织学结构特殊，当它受到抗原刺激时能产生不同程度的反应性增生，淋巴结正常结构紊乱，免疫母细胞增生，核分裂相增多等假恶性图象。
因此仅凭形态学观察有时很难确定其良、恶性。
目前，一般病理科大约有70%左右的淋巴组织增生性疾病，凭常规切片可以明确诊断，约25%的病例。
但对于无表面标记的早期未成熟细胞，或失去表面标记的异常细胞却无能为力。
对反应性增生细胞成分较多的病例，瘤细胞即使有免疫表型也可能被掩盖。
相反，由于操作等原因造成抗原扩散也可能造成假阳性。
近年发展起来的克隆性基因重排检测技术为疑难、早期或微量标本确定诊断提供了可能，是对形态学检查和免疫组化方法的重要补充。
安徽医科大学第一附属医院皮肤性病科盛宇俊
淋巴细胞表面具有与抗体或抗原特异性结合能力的一类有多个亚单位组成的糖蛋白，包括B淋巴细胞产生的IgH与IgL和T细胞产生的TCR(T细胞受体)。
两者的基因编码相似，一般由可变区(V区)、多变区(D区)、连接区(J区)及恒定区(C区)构成。
胚系状态下，这些区域在染色体上的分部是不连续的。
V、D、J、C基因从5'端到3'端呈线状排列在DNA单链上，尚有长度不等的插入序列将其分开。
当淋巴细胞发育到一定阶段，在特别的重组酶作用下，有选择地将它们连接起来(即基因重排)，才能构成一个有表达功能的基因。
淋巴细胞从母细胞分化到成熟需要经过多次基因重排。
由于V、D、J区均有多个可供选择的基因片段，使基因重排的自由度可达106~107之多。
从个体上看，每个淋巴细胞的抗原或受体基因编码均有特定的基因重排形式，即独有的基因编码结构。
如果T或B淋巴细胞在重排的某一阶段产生单克隆性增生即成为淋巴瘤。
也就是说淋巴瘤细胞克隆性增生的结果，会使其特殊的基因重排形式占一定的数量优势。
从而成为细胞克隆性的检测指标。
这就是淋巴瘤基因诊断的理论基础。
目前，用于淋巴瘤基因重排分析的方法主要有两种。
一、多聚酶链反应扩增技术(PCR)
此方法首先由美国Mullis等设计成功(1985年)。
在1989年即有用于淋巴瘤基因疹断的报告。
其原理是：选取IgH与TCR的V、D、J、C区基因编码中20个左右的保守核苷酸序列，人工合成一对或多对(家族基因)引物，与待测的模板DNA单链碱基互补，扩增目的DNA 序列片段。
如果是淋巴瘤则扩增产物电泳出现单克隆性单带。
而良性增生性淋巴组织则出现弥漫涂片状，不行成单带。
文献报告PCR基因诊断淋巴瘤，具有特异、敏感、快速等优点，且可用于新鲜组织和石蜡包埋组织。
但目前用PCR方法检测基因重排较成功的仅是IgH基因。
并且IgH基因重排的PCR检测方法也同样存在着两个明显的问题：1、影响因素多，稳定性欠佳。
2、仍有10%以上的假阴性，灵敏度有待提高。
二、 Southern印迹杂交法
该方法首先由苏格兰爱丁堡大学Southern报告(1975年)。
其原理是两条单链DNA碱基可与人工合成的互补单链DNA探针相结合(一般用同位素标记)。
Southern Blot方法应用于基因重排检测是1981年Korsmeyer等首先进行的。
将细胞DNA抽提出来，用限制性内切酶进行酶切，胚系DNA就会产生特征性片段。
但发生过基因重排的细胞DNA的酶切位点有所改变，会产生有别于胚系的DNA酶切片段。
转膜后，与标记的DNA探针杂交，如有一定数量的克隆性增殖的淋巴细胞存在(>1~5%)，克隆性的基因重排条带就可显示出来。
对于正常或多克隆性的淋巴细胞增生，由于重排片段大小各异而显弥散带。
Southern分析已被应用于IgH、Igk、Ig1及各种TCR克隆性重排的检测，并以其令人满意的灵敏度和可靠性视为基因重排检测的'金标准'。
但由于需要较大量(10mg)新鲜或冰冻组织，操作复杂、时间过长(约两周)，且需使用过射性同位素标记、易污染等缺点，仅适用于科研而不适用于临床诊断。
DAKO公司推出的荧光素标记IgH、Igk、Ig1及各种TCR探针化学发光试剂盒克服了上述缺点，以荧光素取代了同位素作为标记；缩短了曝光时间(5~10分钟)，但敏感性并不降低，非常有利于在临床诊
断中推广、应用。