阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544免疫原性蛋白的鉴定
现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2013, Vol.29, No.6
1370
阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544免疫原性蛋白的鉴定
王健，杜欣军，王硕 （天津科技大学，教育部食品营养与安全重点实验室，天津 300457）
摘要：克罗诺杆菌是一种新型的食源性致病菌。迄今为止，对阪崎克罗诺杆菌的免疫原和潜在毒力因子了解很少，而免疫原性
蛋白在细菌的致病性方面发挥着重要的作用。本研究利用免疫蛋白组学的方法，鉴定了阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544的免疫原性蛋白。
利用固定后的阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544菌体免疫新西兰兔，制备多克隆抗体；采用蔗糖密度梯度离心法，提取蛋白质，并利用双向电泳对蛋白质进行分离；以制备的多克隆抗体作为一抗进行免疫印迹分析，对具有免疫反应的蛋白点进行质谱鉴定，结果共鉴定出
7种具有明显免疫反应的蛋白质。 关键词：阪崎克罗诺杆菌；免疫原性蛋白；免疫蛋白质组学；双向电泳
文章篇号：1673-9078(2013)6-1370-1373
Identification of Immunogenic Proteins in Cronobacter sakazakii
ATCC29544
WANG Jian, DU Xin-jun, WANG Shuo
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin
300457, China) Abstract: Cronobacter spp. are emerging opportunistic pathogens. So far, little is known about the species’ immunogens and potential
virulence factors. Immunogenic proteins play an important role in the pathogenicity of bacteria. In this study, the immunogenic proteins of C.
sakazakii ATCC 29544 was identified using immunoproteomics. The polyclonal antibody was prepared using the formaldehyde-fixed C.
sakazakii ATCC 29544 as antigen. Then the proteins of C. sakazakii ATCC 29544 were extracted using sucrose density gradient centrifugation
and separated using two-dimensional electrophoresis. Western blot was used to detect the surface-exposed proteins and mass spectroscopy was used to identify them. 7 immunoreactive proteins were identified in this study.
Key words: Cronobacter sakazakii; immunogenic proteins; immunoproteomics; two-dimensional electrophoresis 克罗诺杆菌是近年来在奶粉(乳)制品行业中发现
的一种条件致病菌。其主要危害人群为新生儿、早产儿等，会引起脑膜炎、败血症及坏死性的小肠结肠炎
和系统性脓毒疾等疾病，具有较高的死亡率。因此，
该菌已引起世界多国相关部门的重视。克罗诺杆菌目
前被分为8个种[1~3]，其中有3个种被认为与脑膜炎有
关，阪崎克罗诺杆菌是其中之一[4]。 免疫蛋白质组学（immunoproteomics）是蛋白质
组学的新分支，它是伴随着基因组研究和蛋白质组学
研究的兴起和发展、以及生物质谱技术的发展，而产
生的一门新兴的学科[5~7]。随着双向电泳技术的不断完
善[8~9]、病原菌基因组研究的不断深入、生物质谱技术
收稿日期：2013-01-17
基金项目：教育部科学技术研究重点项目（212009），天津市高等学校科技
发展基金计划项目（2010ZD01）
作者简介：王健（1982-），女，博士，从事食品微生物方向研究
通讯作者：王硕教授 和生物信息学的不断发展，使得免疫蛋白的分离和鉴
定的成功率极大的提高。因此，免疫蛋白质组学被迅速的应用于免疫原性蛋白的研究中。
细菌的免疫原性蛋白在宿主和细胞的相互作用和
引发宿主产生免疫反应的过程中发挥着重要的作用。
因此它被认为可以用来控制疾病发展的有效方法[10]。
阪崎克罗诺杆菌是具有吸附能力的菌株，它可以吸附不同的上皮细胞和血管内皮细胞。因此，确定阪崎克
罗诺杆菌与宿主相互作用过程中的潜在毒力因子和保
护性抗原，是了解该菌致病机制和免疫机制的重要途
径。
本研究以阪崎克罗诺杆菌ATCC29544为研究对象，制备了多克隆抗体，利用免疫蛋白质组学的方法
（2-DE、免疫印迹和质谱技术），识别、鉴定其免疫
原性蛋白，为这一细菌致病机制的阐明奠定了良好的
基础。
现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2013, Vol.29, No.6
1371 1 材料与方法
1.1 实验材料
实验菌种：C. sakazakii ATCC 29544购自美国菌
种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。
实验中使用的常规药品均为市售，蛋白质样品预
处理用到的脱盐试剂盒为Perfect-FOCUSTM (For
Preparing Low Conductivity Samples for IEF/2D-Gel Electrophoresis)，购自G-BIOSCIENCES公司。 1.2 多克隆抗体的制备
1.2.1 抗原制备
将阪崎克罗诺杆菌活化、转接培养至对数期后，
收集菌体，加入甲醛（0.5%），37 ℃水浴固定24 h，
PBS洗涤3次；用0.9%的生理盐水重悬菌体，利用麦氏比浊管，将固定菌体调整至1×109 CFU/mL。
1.2.2 抗体制备
采取背部皮下多点注射和腿部肌肉注射进行免
疫。每两周免疫一次，每次免疫剂量为1×109 CFU，
共免疫五次。从第三次免开始，免疫一周后采血，利用间接ELISA法检测抗血清效价[11~13]，以监测免疫过
程。第五次免疫一周后，收集血液，室温或37 ℃培
养箱中放置2~3 h凝血后，放置4 ℃冰箱中过夜，使
血块收缩；将析出的血清全部转移到新的离心管中；
血块于4 ℃，4500 r/min离心20 min，取上清液与前面的血清混合，每毫升血清中加10%的叠氮钠10 μL，
分装，-20 ℃冻存。免疫前，采血2 mL，作为后期实
验的阴性对照。
1.3 蛋白样品的制备
利用蔗糖密度梯度超速离心法制备阪崎克罗诺杆菌蛋白质[14]：将500 mL菌液收集到的菌体用8 mL预
冷的缓冲液（50 mM Tris HCl，1 mM EDTA（pH 7.8），
1%（V/V）蛋白酶抑制剂）重悬，200 W超声10 min
后，3000×g离心10 min去除未破损的细胞。上清液
100,000×g超速离心1 h，沉淀用10 mM/L HEPES（pH 7.4）重悬。经过蔗糖密度梯度（2.02 mol/L、1.44 mol/L、
0.78 mol/L的不连续梯度）80,000×g超速离心16 h后，
收集蛋白，于-80 ℃保存。
1.4 一维SDS-PAGE电泳
一维SDS-PAGE电泳采用6%的浓缩胶和12%的分离胶分离阪崎克罗诺杆菌蛋白，电泳条件为恒压80
V，电泳后用考马斯亮蓝R-250染色观察。
1.5 双向电泳
1.5.1 样品脱盐
利用脱盐试剂盒纯化蛋白样品后，Broadford法测浓度，确保每块胶上样量为200 μg。
1.5.2 双向电泳条件
11 cm的pH 3~10的胶条按照使用说明在溶胀液
中浸泡12~16 h。一维等电聚焦条件：电压0~500 V，
500 V·h；500 V，2 000 V·h；500~3 000 V，5000 V·h；3000 V，20000 V·h；3000~500 V，25 000 V·h。二维
电泳条件：12%的分离胶分离外膜蛋白，恒压200 V。
同时进行两块二维凝胶电泳，其中一块用考马斯亮蓝
G-250染色观察，另一块用作免疫印迹反应。
1.6 免疫印迹 电泳后的蛋白经过半干式电泳仪转印至PVDF
膜。转膜条件：200 mA恒流电转90 min。转膜后，
PVDF膜立即用5%的脱脂奶粉封闭，与一抗（1:500）
过夜反应后，加入酶标二抗（1:5000）反应，利用4-
氯-1-萘酚显色。 1.7 质谱鉴定
利用4700 Proteomics Analyzer质谱仪进行质谱鉴
定。
质谱结果判定标准：质谱结果中Protein Score
C.I.%（一级）或Total Ion Score C.I.%（二级）列数值达到95%以上认为鉴定成功。
2 结果与分析
2.1 阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544多克隆抗体的制备
以固定的ATCC 29544菌株为抗原，免疫新西兰大白兔。为了排除兔子个体差异对抗血清效价的影响，
同时免疫2只兔子。间接ELISA测得的抗血清效价分
别为30000和20000，选取效价为30000的抗血清进
行后续的免疫印迹实验。
2.2 蛋白质的检测 超声破碎细菌（200 W，10 min）后，利用蔗糖密
度梯度法提取阪崎克罗诺杆菌蛋白质，结果如图1所
示。从图1可以看出，提取的细菌蛋白分布在14~100
kDa之间，主要密集分布在30~62 kDa之间。
图1 ATCC 29544蛋白一维电泳图
Fig.1 SDS-PAGE of proteins in C. sakazakii ATCC 29544
阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备与特性鉴定
阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备与特性鉴定
周鹤峰;邵敏;于立强;葛正龙
【期刊名称】《中国免疫学杂志》
【年(卷),期】2012(028)009
【摘 要】目的:制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定.方法:采用灭活的阪崎肠杆菌菌体为抗原,免疫BALB/c小鼠,取血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,通过Western blot和间接ELISA法鉴定该单克隆抗体的特性、效价及mAb相对亲和力.结果:获得2株能稳定分泌抗阪崎肠杆菌mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1H7、2B12,抗体Ig亚类分别为IgG1和IgG2b;交叉反应显示单抗具有良好的特异性;ELISA分析表明制备的单抗效价在1×107~2×107,相对亲和常数达109L/mol,染色体鉴定分别为104和106条,符合杂交瘤细胞的特性.结论:抗阪崎肠杆菌单克隆抗体的成功制备为其快速检测方法的建立奠定了基础.
【总页数】4页(P817-820)
【作 者】周鹤峰;邵敏;于立强;葛正龙
【作者单位】遵义医学院珠海校区生物工程系,珠海,519041;遵义医学院珠海校区生物工程系,珠海,519041;山东省烟台第三中学,烟台,264000;遵义医学院生物化学教研室,遵义,563003
【正文语种】中 文 【中图分类】R392.11
【相关文献】
1.茄科劳尔氏菌单克隆抗体的制备及其特性鉴定 [J], 马兰;王艳;董庆利;刘箐;曾海娟;谢曼曼;胡谦;丁承超;王淑娟;翟绪昭;孙静娟;李杰
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RAPIDSakazakii Agar克罗诺杆菌属显色培养基的性能评价
JOURNALOFINSPECTIONANDQUARANTINE检验检疫学刊Vol.28No.12018年第1期RAPID'SakazakiiAgar克罗诺杆菌属显色培养基的性能评价张西萌韩笑付溥博曾静*魏海燕陈鑫魏咏新渊北京出入境检验检疫局北京100026冤
1前言克罗诺杆菌属原名阪崎肠杆菌袁在自然界中分布广泛袁在水尧土壤尧食品中均可分离出该菌遥克罗诺杆菌属能导致严重的新生儿脑膜炎尧小肠结肠炎和菌血症袁并可引起神经系统后遗症和死亡袁因该菌感染引起的死亡率高达50%以上[1]遥该菌属[2袁3]包括1个新组合尧4个新种和3个新亚种遥新组合为阪崎肠克罗诺杆菌曰4个新种分别为苏黎世克罗诺杆菌尧丙二酸盐阳性克罗诺杆菌尧穆汀斯克罗诺杆菌尧都柏林克罗诺杆菌曰3个新亚种分别为都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种尧都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种尧都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种遥此外还有1个克罗诺杆菌基因种1不是新种袁但属于克罗诺杆菌属袁即克罗诺杆菌属共有6个种[4]遥在目前采用的克罗诺杆菌属检测方法中袁传统培养分离法仍是最常用的鉴定方法袁而最常见的显色培养基为DFI琼脂袁可选择的其他类似培养基并不多见遥因此袁本研究通过国家标准GB4789.40方法及伯乐公司研发的新型培养基RSA快速筛选方法对50株克罗诺杆菌属及30株非克罗诺杆菌属进行RAPID'SakazakiiAgar渊以下简称RSA冤显色培养基鉴定及应用研究遥2材料与方法2.1材料2.1.1实验菌株共选取50株目标菌株袁其中1株为ATCC29544标准菌株袁其余49株分离株分别来源于奶粉尧婴幼儿食品尧蛋白粉尧黄油尧芝士尧冰淇淋尧面包粉等食品袁详见表1遥2.1.2试剂RAPID'SakazakiiAgar克罗诺杆菌属显色培养基院RSA伯乐2C0010袁法国曰脑心浸液肉汤院BRAIN-HEARTINFUSIONBHI梅里埃1001221840袁法国曰克罗诺杆菌属显色培养基院DFI陆桥121227袁国产曰缓冲蛋白胨水院BafferPeptoneWaterBPWOXIOD摘要依据RSA快速筛选方法及GB4789.40方法袁在特异性尧检测灵敏度尧样品种类尧培养条件等方面对伯乐公司RAPID'SakazakiiAgar克罗诺杆菌属显色培养基的性能进行评价遥结果显示袁该培养基特异性和选择性好袁具有高检出率尧易观察尧易配制尧使用方便等特点袁可以作为一种选择性培养基在微生物检测行业推广使用遥关键词克罗诺杆菌属曰显色培养基曰鉴定中图分类号TS207.4IdentificationandApplicationofChromogenicMediumofCronobacterapp.ZHANGXimeng袁HANXiao袁FUPubo袁ZENGJing*袁WEIHaiyan袁CHENXin袁WEIYongxin渊BeijingEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau袁Beijing袁100026袁China冤Abstract院ThroughanumberofexperimentsonCronobacterapp.bychromogenicmediumforperfor-manceevaluation袁theidentificationoftargetandnontargetbacteriawascarriedoutbyusingthenationalstandardGB4789.40-2010method.TheresultshowedthatRAPID'SakazakiiAgarmediumcanbeenusedinmicrobialdetectionindustrypromotion袁withitshighdetectionrate袁easyobservation袁easypreparation袁convenient.KeyWords院Cronobacterapp.曰ChromogenicMedium曰Appraisal
阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备与特性鉴定 2
周鹤峰等阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备与特性鉴定第９期
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－４８４Ｘ．２０１２．０９．０１２
・免疫学技术与方法・
阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备与特性鉴定①
周鹤峰邵敏于立强②葛正龙③ （遵义医学院珠海校区生物工程系，珠海５１９０４１）
中国图书分类号Ｒ３９２．１１ 文献标识码Ａ 文章编号１０００－４８４Ｘ（２０１２）０９－０８１７－０４ ［摘要］ 目的：制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法：采用灭活的阪崎肠杆菌菌体为抗 原，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取血清效价高的小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，间接ＥＬＩＳＡ法筛选阳性杂交瘤细胞，ｍＡｂ 亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型，通过Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和间接ＥＬＩＳＡ法鉴定该单克隆抗体的特性、效价及ｍＡｂ相对亲和 力。结果：获得２株能稳定分泌抗阪崎肠杆菌ｍＡｂ的杂交瘤细胞株，分别命名为１Ｈ７、２Ｂ１２，抗体Ｉｇ亚类分别为ＩｇＧ１和 ＩｇＧ２ｂ；交叉反应显示单抗具有良好的特异性；ＥＬＩＳＡ分析表明制备的单抗效价在ｌ×１０ ～２×１０ ，相对亲和常数达１０ Ｌ／ｍｏｌ， 染色体鉴定分别为１０４和１０６条，符合杂交瘤细胞的特性。结论：抗阪崎肠杆菌单克隆抗体的成功制备为其快速检测方法的 建立奠定了基础。 ［关键词］ 阪崎肠杆菌；单克隆抗体；杂交瘤；交叉反应
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ
Ｓａｋａｚａｋｉｉ
ＺＨＯＵ Ｈｅ—Ｆｅｎｇ，ＳＨＡＯ Ｍｉｎ，ＹＵ Ｌｉ—Ｑｉａｎｇ，ＧＥ Ｚｈｅｎｇ—Ｌｏｎｇ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｕｎｙｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ
Ｚｈｕｈａ Ｃａｍｐｕｓ，Ｚｈｕｈａ ５１９０４１．Ｃｈｉｎａ ．
食品克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验原始记录
食品克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验原始记录
样品编号： 检验开始时间： 年 月 日
样品名称： 检验完成时间： 年 月 日
检测项目：克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌） 检测依据：GB 4789.40-2016第一法第二法
一、克罗诺杆菌属定性检验
无菌操作称（量）取样品100g或ml置于灭菌锥形中，加入900mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水，摇动充分溶解，36±1℃培养18±2h，移取1mL转种于10mLST-Vm肉汤，44±0.5℃培养24±2h。轻轻混匀培养物，各取1环，分别划线于两个阪崎杆菌显色培养基平板，36±1℃培养24±2h。挑取可疑菌落，划线于TSA平板，25±1℃培养48±4h。观察，挑取可疑菌落进行生化鉴定。
二、克罗诺杆菌属平板计数法
无菌操作称（量）取样品100g（ml）、10g（ml）、1g（ml）置于灭菌锥形中，加入900mL、90mL、9mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水，摇动充分溶解，36±1℃培养18±2h，移取1mL转种于10mLST-Vm肉汤，44±0.5℃培养24±2h。轻轻混匀培养物，各取1环，分别划线于两个阪崎杆菌显色培养基平板，36±1℃培养24±2h。挑取可疑菌落，划线于TSA平板，25±1℃培养48±4h。挑取可疑菌落进行生化鉴定。
注：+生长或有可疑菌落；-未生长或无可疑菌落。 计算及结果：定性检验：得 100g(mL) 计数法，查MPN检索表，得 MPN/g,mL
电子天平编号： 使用状况 试验前： 试验后：
培养箱编号： 使用状况 试验前： 试验后：
阪崎克罗诺杆菌的16S rDNA鉴定分型
中国食物与营养２０１５，２１（７）：３９４２ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎａ
阪崎克罗诺杆菌的１６Ｓ ｒＤＮＡ鉴定分型
娄彬彬 ，满朝新 ，费 鹏 ，牛婕婷 ，李 然 ，柴云雷 ，李理 ，姜毓君
（ 东北农业大学食品学院／乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨１５００３０；
东北农业大学／国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨１５００２８）
摘要：阪崎克罗诺杆菌（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ）是一种重要的食源性条件致病菌，易引发新生儿、早产儿、 低体重新生儿和免疫力低下的婴幼儿产生严重的脑膜炎、茵血症和坏死性小肠结肠炎。本研究以分离自不同来源、 通过生化鉴定的３７株阪崎克罗诺杆菌作为研究对象，利用１６Ｓ ｒＤＮＡ基因测序的方法对阪崎克罗诺杆菌进行鉴定和
分型。结果表明：ＥＳ４并非为阪崎克罗诺杆菌，说明采用１６Ｓ ｒＤＮＡ基因测序进行阪崎克罗诺杆菌的鉴定更为可靠； 通过构建系统发育树分析，分离菌株位于同一系统发育分支；根据序列同源性比对，可将这一分支下的所有菌株分
成７个子群，这表明１６Ｓ ｒＤＮＡ基因测序可以对阪崎克罗诺杆菌进行分型，进一步揭示其系统发育关系。
关键词：阪崎克罗诺杆菌；１６Ｓ ｒＤＮＡ；鉴定；分型
阪崎克罗诺杆菌是一种含周身鞭毛、能运动并兼性 厌氧的革兰氏阴性无芽孢的粗短杆菌。目前克罗诺杆菌
属有７个种 ，包括阪崎克罗诺杆菌（Ｃ．ｓａｋａｚａｋｉｉ）、
丙二酸盐阳性克罗诺杆菌（Ｃ．ｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ）、苏黎世克
罗诺杆菌（Ｃ．ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ）、穆汀斯克罗诺杆菌
（Ｃ．ｍｕｙｔｊｅｎｓｉｉ）、都柏林克罗诺杆菌（Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｅｎｓｉｓ）、传
奇克罗诺杆菌（ｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌｉｓ）、调味品克罗诺杆菌
（Ｃ．ｃｏｎｄｉｍｅｎｔｉ）。阪崎克罗诺杆菌是重要的食源性条件
致病菌，能够引起严重的新生儿脑膜炎 、坏死性小肠
结肠炎Ｈ 和菌血症 。该菌能分离自广泛的食品来源
奶粉中的健康杀手——克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测标准解读
奶粉中的健康杀手——克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检测标准解读！
克罗诺杆菌属（Cronobacterspp.）是由Iversen等人于2008年建议创立的隶属于肠杆菌科的一个新属，该属是寄生在人和动物肠道内的一种有周生鞭毛、能运动、兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌的发展经历了4个时期：
１
起初该菌因其产生黄色素，被认为是肠杆菌属中阴沟肠杆菌的生物变形种──黄色阴沟肠杆菌；
２
1989年，Farmer通过DNA杂交、生化反应、黄色素产生及抗生素敏感性等实验，发现该菌与阴沟肠杆菌有所不同，为此更名为“阪崎肠杆菌”；
３
2008年，Iversen等人通过荧光扩增片段长度多态性、自动核糖体分型、16SrRNA基因测序、DNA-DNA杂交和表型阵列等多种分子生物学技术研究，将该菌由种（阪崎肠杆菌）扩大为属（克罗诺杆菌属），这个新属包括6个种；
４
2012年，Joseph等利用16SrRNA基因序列分析和多位点测序技术对克罗诺杆菌属进行分类研究，提出将克罗诺杆菌属分为7个种。
克罗诺杆菌属是一种重要的食源性条件致病菌，可通过污染婴幼儿配方奶粉等食品导致新生儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎。其名字“克罗诺”（Cronos）来源于希腊神话，克罗诺是希腊神话中十二个泰坦巨神之一，传说他的每个孩子一出生就被他一口吃掉，其行为表现和该菌的致病特性很吻合，因此“Cronobacterspp.”被译成“克罗诺杆菌属”。
该菌作为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌，对其相关产品的检测及监管尤为重要，常用的检测方法有：
另外，2016年12月23日卫计委发布了新标准GB 4789.40-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验》，将于2017年6月23日实施，并将代替GB 4789.40-2010、SN/T
1632.1-2013。该标准与GB 4789.40-2010相比，主要变化有：
奶粉中阪崎肠杆菌分离鉴别方法研究
*基金项目:国家质量监督检疫总局科研项目(2004IK097) 作者单位:中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,北京100025 作者简介:赵贵明(1963-),男,山西人,研究员,学士,研究方向:食品微生物检验技术研究。文章编号:1001-0580(2006)02-0207-02 中图分类号:R378.2 文献标识码:B=实验研究>
奶粉中阪崎肠杆菌分离鉴别方法研究*
赵贵明,袁飞,陈颖,黄文胜,刘沛,张旭
阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)可引发婴儿、早产儿
脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎,散发和暴发病例在全球范围
均有报道11~32。国际相关组织认为,奶粉中的阪崎肠杆菌与
沙门菌一样,是导致幼儿感染、死亡的主要原因,已有报道从
婴幼儿配方奶粉中检出阪崎肠杆菌13,42。因此,有效地从奶
粉中分离阪崎肠杆菌,准确鉴别尤为重要,本文根据所有阪崎
肠杆菌菌株均产生A-葡萄苷酶的原理152,在营养琼脂中添加
5-溴-4-氯-3-吲哚-A-葡萄苷作为底物,月桂基硫酸盐作为抑制
剂,制成改良显色培养基,检测80份市售奶粉,同时使用肠杆
菌科细菌生化鉴定试剂(API20E),对可疑菌株进行鉴别并分
析遇到的问题。现报告如下。
1 材料与方法
111 材料 (1)标准菌珠:大肠埃希菌44104,产气肠杆菌
45103,阴沟肠杆菌45301,奇异变形杆菌49005,普通变形杆
菌49027,鼠伤寒沙门氏菌51315,弗氏柠檬酸杆菌11732,肺
炎克雷伯菌46114以及金黄色葡萄球菌6株,表皮葡萄球菌
9株,均由中国药品生物制品检定所提供;阪崎肠杆菌ATCC
29544;阪崎肠杆菌样品分离株1~4,分离自奶粉样品中。
(2)试剂与培养:肠杆菌增菌肉汤,结晶紫中性红胆盐葡萄糖
琼脂(VRBGA,由北京陆桥公司生产);阪崎肠杆菌显色培养
基,胰酪胨大豆胨琼脂(TSA),由本实验室配制;API20E(梅
里埃公司)。(2)样品:从国内超市及其他途径采集国产袋装
副溶血弧菌免疫原性蛋白的鉴定及克隆表达
浙江理工大学学报，第３Ｏ卷，第６期，２０１３年１１月
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｓｃｉ—Ｔｅｅｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖｏ１．３０，Ｎｏ．６，Ｎｏｖ．２０１３
文章编号：１６７３—３８５１（２０１３）０６—０８８１—０６
副溶血弧菌免疫原性蛋白的鉴定及克隆表达
田丽花，叶智鸽，温良优，潘建义，赵辅昆
（浙江理工大学生命科学学院，杭州３１００１８）
摘要：运用蛋白质组学及免疫学技术筛选和鉴定副溶血弧茵的外膜蛋白中具有较好免疫原性的外膜蛋白，为 防治副溶血弧茵类疾病的亚单位疫苗的研发奠定基础。用灭活的副溶血弧茵免疫ＩＣＲ小鼠制备抗血清；通过对外 膜蛋白进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ分析筛选免疫原性蛋白，经ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ－ＭＳ质谱分析，对免疫原性 蛋白进行鉴定。克隆表达免疫原性蛋白ＶＰ０８０２，并对该蛋白的表达条件进行优化，最后纯化蛋白ＶＰ０８０２，并免疫 小鼠获得抗血清，通过Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ验证蛋白ＶＰ０８０２的免疫原性。结果：免疫小鼠所得到的抗血清效价为 １：５ ０００；经免疫印迹分析确定了ｌ２种外膜蛋白具有较好免疫原性，其中１ｏ种外膜蛋白经质谱分析得到鉴定，分别 为ＬＰＳ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＶＰ０８０２，Ｍａｈｏｐｏｒｉｎ，Ｃｈｉｔｏｐｏｒｉｎ，ＯｍｐＣ，ＯｍｐＡ，ＯｍｐＵ，ＯｍｐＫ，ＶＰ１２４３和ＶＰ０９６６。 成功构建免疫原性蛋白ＶＰ０８０２的高表达菌株；该菌株在低温低转速的条件下诱导，目的蛋白仍以包涵体形式存在， 在３７℃，２２０ ｒ／ｍｉｎ，ＩＰＴＧ终浓度为１ ｍｍｏｌ／Ｌ的条件下诱导，目的蛋白表达量较高，纯化得到蛋白ＶＰ０８０２并验证 了该蛋白的免疫原性。表明在副溶血弧茵的外膜蛋白中存在多种与免疫原性相关的蛋白，且部分蛋白为首次发现 具有免疫原性。 关键词：副溶血孤茵；外膜蛋白；免疫原性；ＶＰ０８Ｏ２ 中图分类号：Ｑ５１１ 文献标志码：Ａ
乳品中4种常见致病菌多重PCR检测方法的建立
乳品中4种常见致病菌多重PCR检测方法的建立
苗小草;陈万义;施春雷;张娟;余水静
【摘 要】建立同时快速检测乳品中检出率较高的沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、克罗诺杆菌属(原阪崎肠杆菌)4种食源性致病菌的四重PCR方法.采用针对沙门氏菌ompC基因、单核细胞增生李斯特菌hly基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、克罗诺杆菌属gyrB基因特异性引物,建立并优化多重PCR体系,检测特异性和灵敏度,并用建立的体系检测实际样品.该体系具有特异性,对混合模板中沙门氏菌模板的灵敏度达10-6 ng/μL,单核细胞增生李斯特菌、克罗诺杆菌属的灵敏度达10-3 ng/μL,金黄色葡萄球菌的灵敏度达10-2 ng/μL.可有效检出经过增菌后初始菌浓度为1 CFU/mL的4种菌.本多重PCR方法能够特异、高效、准确地检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、克罗诺杆菌属4种食源性致病菌.%The objective of this study is to develop a multiplex PCR assay
that can simultaneously detect Salmonella spp.,Staphylococcus
aureus,Listeria monocytogenes and Cronobacter spp.which with high
detection rate in dairy products.Species-specific PCR primers were
designed based on ompC gene for Salmonella spp.,hly gene for Listeria
monocytogenes,nuc gene for Staphylococcus aureus and gyrB gene for
Cronobacter spp..Developing and optimizing the multiplex PCR reaction