双向电泳步骤--标准操作完整版

细胞裂解（蛋白质提取）

一、试剂配置：

PBS配方PBS缓冲液一般作为溶剂

氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g

氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g

十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM 3.63g

磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM 0.24g

加水至1L配好后进行高压灭菌。

Washing buffer（500mL）配方

Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g

蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g

加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH）

裂解储液配方（细胞）：

尿素(MW 60.06) 7M 4.2g

硫脲(MW 76.12) 2M 1.52g

CHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。

裂解储液配方（组织）：

尿素(MW 60.06) 5M 3g

硫脲(MW 76.12) 2M 1.52g

CHAPS(MW614.89) 2% 0.2g

Tris（MW 121.1） 40mM 0.048g

加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。

裂解液：

裂解液储液 100uL

IPG buffer（pH可选） 2% 2uL

Pi 2uL

NucLease mix（100×） 1uL

PMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uL

DTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uL

Pi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装

考马斯亮蓝G-250：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。

考马斯亮蓝G-250 0.01% 100g

95%乙醇 4.7% 50ml

H3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，与用水溶解的100ml H3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。

二、实验准备：

1、准备冰盒，细胞裂解过程均在冰盒内进行（4℃）；

2、准备4℃离心机，开机降温，保证温度下降至4℃；

3、取出置于-20℃保存的试剂，需冰上融化，最后取出细胞样品。

三、样品制备：

（一）细胞

细胞裂解准备：

1、收集细胞，使用大于500g转速离心5min；

2、弃去上清，使用washing buffer重悬细胞沉淀，震摇待

细胞完全打散后，继续用大于500g转速离心5min；

3、重复步骤2两次，并使用转速2000rpm离心5min，弃上清。

细胞可置于-80冰箱保存数周，或使用裂解液裂解。

细胞裂解：

1、配置裂解液：注意先不要加入DTT。DTT也常常被用于蛋

白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。临用前加入PMSF 抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；后，立即将细胞裂解液加入待裂解的细胞中。

2、加入裂解液的细胞置于冰盒内，每隔5-7min取出，于漩

涡振荡器上震摇数秒，并再次放于冰盒中，保证细胞裂解时的温度为4℃。

3、裂解15-20min后加入DTT。

4、裂解完成后，置于4℃离心机中，以最大转速13200rpm离

心30min，取上清，弃沉淀。上清所含提取的蛋白。

5、使用bradford法测定提取蛋白浓度。

（二）、组织：

组织裂解准备：

1、提取动物组织。提取时务必保证组织的纯度，尽量减少组织

混杂，尤其注意血液的混入。

2、使用washing buffer冲洗组织2-3遍，洗净组织的血液、体

液、和其他影响实验结果的残留成分。

3、准备研钵，洗净并且烘干，准备适量的组织裂解液，准备充

足的液氮，石英砂适量。

组织裂解：

1、配置裂解液：注意先不要加入DTT、 PMSF。

2、将适量石英砂加入到研钵中，加入液氮冷却。

3、将组织放入装有液氮的研钵中，研磨组织，在研磨过程中保

证样品在低温状态下。

4、研磨完成后将样品及石英砂收集到离心管中，在裂解液中迅

速加入PMSF，混匀后将裂解液加入含有样品的离心管中。保持4℃，震荡混匀，每隔5-7min取出，于漩涡振荡器上震摇数秒，并再次放于冰盒中。

5、裂解15-20min后加入DTT。

6、使用2000g离心10min，吸取上清即为所提取的蛋白，下层

石英砂及组织碎片则丢弃。将上清使用13200g转速离心，弃去沉淀。

（三）、血清：

血清样品可直接用于双向电泳实验。

但样品中含有大量的IgG和白蛋白，需要使用试剂盒去除。四、试剂说明：

裂解液成分：

溶液中还原剂的含量不要超过20mM。

尿素/硫脲：变性剂，中性促溶剂，促进样品溶解，破坏氢键等次级结构，使所有离子基团暴露在溶液里。硫脲可以促进膜蛋白的溶解。尿素在30℃以上容易降解，降解产物异氰酸盐可使样本中蛋白质甲氨酰化，对蛋白质进行修饰，造成等电点改变，形成人为地“斑点串”。

CHAPS:两性表面活性剂，CHAPS是一种非变性的zwitterionic 去垢剂、蛋白质裂解液，用于增溶膜蛋白和裂解蛋白-蛋白之间的相互作用。CHAPS是两性离子去垢剂，分子结构中具有一个胆酸和硫代甜菜碱。在紫外区的低吸光性成为用紫外方法检测膜蛋白的首选去垢剂，CMC值均为8 mM。常用于于双向电泳等实验。原理：CHAPS保护蛋白质的天然状态，可溶解膜蛋白，从而互作用。透析可除去。

SDS：(FW 288.38)离子型去垢剂，裂解力强，基本可以把细胞完