双向电泳步骤--标准操作完整版
蛋白质组双向电泳原理及实验步骤ppt课件.ppt
中国历史上吸烟的历史和现状、所采 取的措 施以及 由此带 来的痛 苦和灾 难，可 以进一 步了解 吸烟对 人民健 康的危 害，提 高师生 的控烟 意识
• 最高电压10,000 V • 10–25C 温度控制 • 7, 11, 17, 18, 和 24 cm的聚
焦盘，可以各放12根胶条 • 可以储存10个程序，每个程序有
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实验操 作
Method
原理
Theory
应用
Application
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二维SDS-PAGE
• 同普通SDS-PAGE类似。
• 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因 为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩， 可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺 胶）充当了浓缩胶。
l 设置等电聚焦时的温度。（17℃）
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配制SDS-PAGE凝胶
配制12%的丙烯酰胺凝胶，直接用双向电 泳专用梳子；或在上部留0.5cm的空间， 用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封胶。 聚合30分钟。
第
一
向
双向电泳技术流程
Analytical Load (silver staining)
10~100ug/125ul 50~200ug/185ul 100~300ug/300ul
Preparative Load (Coom staining)
200~500ug/125ul 250~1000ug/185ul
样品制备
• 样品的纯化
蛋白样品的纯化
样品进行纯化的试剂盒 ReadyPrep 2D Clean-up Kit:去除盐分及其他杂质 ReadyPrep Reduction-Alkylation Kit:显著提高碱性蛋白分辨率
ReadyPrep 2-D Kits
样品中DNA的去除
• DNA/RNA等可以同蛋白质形成超大分子量 的复合物，从而影响蛋白质的电泳分离。 • 一般在用40mM Tris溶液裂解细胞时，加入 DNA消化酶，即可有效去除DNA。 • 量：1ml溶解液中加入150~300U的内切核酸 酶，室温反应20min即可。
高不溶性蛋白的分离：主要还是要增加蛋白质 的溶解度，采用顺序抽提法进行。
亚蛋白质组样品的制备
主要是应用超速离心技术和顺序抽提法将总蛋白质 组分成不同的蛋白质组亚群，再用适当的蛋白溶解 液溶解，以降低样品的复杂性、提高分辨率。常用 方法为： 1、用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成 分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解，这不仅大 大减少样品的复杂性，而且展示出的蛋白质可确定 其亚细胞定位。该法需要专业仪器，有时会出现假 阳性。
ddH2O
Suggested Bio-lyte ampholyte composition for IPG use
IPG pH Range 3-10 4-7 3-6 5-8 7-10 Bio-Lyte Ampholyte (stock) range 3/10 4/6 5/7 3/5 4/6 5/8 7/9 8/10 Bio-Lyte Ampholyte (stock) Conc.(w/v) 40% 40% 40% 40% 40% 40% 40% 20% Sample Solution Volume Per 5ml 25ul 12.5ul 12.5ul 25ul 12.5ul 25ul 12.5ul 25ul Sample Solution Volume Per 50ml 250ul 125ul 125ul 250ul 125ul 250ul 125ul 250ul
蛋白质双向电泳实验流程
蛋白质双向电泳实验流程一．样品制备1.研磨研磨时间要尽量短，并需及时补充液氮，研磨要充分，同时要保证损失少。
2.重新加入8mltris饱和状态酚（ph8.8）和8ml裂解液，在通风橱内研磨30s。
先加8mltris饱和状态酚，tris饱和状态酚会变为液态，此时需以研磨碓将液态的tris饱和状态酚研磨变成小块。
接着重新加入8ml裂解液，也须要将液态的裂解液研磨变成小块。
等三者搅匀后，将粉末迁移至45mltube。
3.振荡30min。
室温静置，等待tube中液态变为液体后，已经开始震荡。
震荡须要持续30min，每震荡1min，放在冰上加热1min。
4.10000g，4℃，10min。
将酚相（topphase）转移至45mltube。
酚相（topphase）可置于冰上。
酚二者必须就是绿色的，水相必须就是淡黄色的。
5.取6ml的抽提液和6ml饱和酚加入水相，蜗旋振荡30min。
振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。
6.10000g，4℃，10min。
将酚二者（topphase）迁移至45mltube。
7.沉淀酚相。
取一定体积（是酚相的5倍）的0.1m乙酸铵/甲醇溶液（c20℃保存）于酚相（45mltube）。
振荡30s，c20℃培育1h或过夜。
8.冲洗结晶①15min，20,000g，4℃。
弃上清。
②提10ml0.1m乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
③15min，20,000g，4℃。
弃上清。
④重新加入10ml乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑤15min，20,000g，4℃。
弃上清。
⑥提10ml80%丙酮（ice-cold)，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑦15min，20,000g，4℃。
弃上清。
⑧重新加入10ml80%丙酮(ice-cold)，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑨15min，20,000g，4℃。
弃上清。
双向凝胶电泳实验方法
双向凝胶电泳实验方法实验方案1.样品制备(Sample preparation)1.1仪器高速离心机1.2试剂NS(制备好的);Citrated human plasma ;溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base) 1.3样品处理方法1).吸取适量的制备好的NS加入到Citrated human plasma 中，在温度为37°下孵化5min。
NS与血浆的加入比例为0.6:8ml。
2)孵化后，将样品高速离心，离心转速为，时间为。
3)除去上清液，将沉淀的纳米球再混悬于0.05M，pH7.4的磷酸缓冲盐中，再次以上次条件离心，本步骤重复三次。
4)将离心后收集到的总蛋白溶解于溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)。
2.第一相等电聚焦(IEF)2.1固定化 pH 剃度胶条的水化(IPG strip rehydration) 2.1.1仪器IPGphor2.1.2试剂水化液(8 M 尿素，2 % CHAPS，15 mM DTT 和 0.5 % IPG 缓冲液) 水化液需当天新鲜配制2.1.3实验步骤A. 加样品溶涨1).用样品溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品。
蛋白质上样浓度(Q:如何确定上样浓度,)不要超过 10 mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。
2).吸取适量(见下表1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。
表1 IPG胶条所需水化液体积3).去掉 IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将 IPG 胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下 IPG 胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条。
6第四节 双向电泳(2DGE)-生化分析
二、 双向电泳技术
1．ISO-Dalt系统 向将不同pI的蛋白质通过等电聚焦电泳分离，获
得了按等电点差异分离的蛋白质组分，然后再经 SDS-PAGE，将等电点相同或相近的、相对分子质 量有差异的蛋白质组分分开，最终得到不同相对分 子质量的蛋白质组分。
一般情况细胞内同时具有pI和相对分子质量都相同的 蛋白质，其概率是非常少的。所以，双向电泳得到的蛋白 质组分绝大部分都是单一组分。
2．IPG-Dalt系统 原理：固相pH介质是丙烯酰胺的衍生物，通过化学 方法以共价键的形式结合到聚丙烯酰胺凝胶上。pH 梯度在凝胶聚合时就已经形成，所以，该pH梯度不 受脱水、重新水化和电场等因素的影响，能得到很 稳定的pH梯度，不会产生pH漂移，电泳时不同pI的 蛋白质，根据其pI聚焦在相应的位置。
5 000～8 000多种蛋白质，这是其他任何分析鉴定技 术无法与其相比的。所以，双向电泳在样品的全组分 鉴定中占有重要的地位。
1970年Kaltschimidt 和Wittmann提出了用双向电 泳技术分离有效组分的研究。 双向电泳(two-dimensional electrophoresis，简称 2DE)分离技术是将样品进行一次电泳后，再沿它 的直角方向进行一次电泳。 随着双向电泳第一向的等电聚焦技术的发展，等 电聚焦形成的pH梯度有载体两性电解质pH梯度、 固相pH梯度及二者的“杂交”技术形成的pH梯 度。这些技术被引入双向电泳中以后，大大提高 了双向电泳的分辨率和重复性。
双向电泳泳实验方案
双向电泳实验方案1.双向电泳总蛋白(培养细胞）提取方法：方案一细胞培养在10cm的培养皿中，待培养至80％左右密度时，细胞用预冷的PBS漂洗3次，加450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至1.5ml离心管中，反复吹打。
（折合在六孔板中，每孔加裂解液50μl）之后将样品用超声波细胞破碎仪超声处理超声时间为5s，间歇时间为10s，功率为100-120W，超声处理至溶液清澈无粘稠物为止，处理过程在冰浴中进行，超声处理后，4℃、25000g离心1h。
取上清进行蛋白质浓度测量，按实验所需的量分装后-80℃冰箱中保存。
（裂解液成分：8mol/L脲，65mmol/L DDT，4％CHAPS，40mmol/L Tris）方案二1.1试剂（1）抽提缓冲液9mol/L脲 5.4g4％CHAPS 0.4g0.5％IPG缓冲液（PH 3-10）（AP Biotech） 50.0μl50mmol/L DDT 0.077gH2O 加至10ml（2）IPG缓冲液（PH 3-10）（AP Biotech）(3) 磷酸盐缓冲液（PBS）,冰冻1.2仪器(1) 细胞刮刀（2）离心机（低温，低速）（3）滤纸（4）冰浴装置（5）超速离心机（低温）（6）漩涡混合器1.3细胞培养的GC-1 spg细胞1.4方法1.从培养皿中转移细胞：用细胞刮刀从培养皿中刮下细胞，用5ml移液器将培养基和细胞转移至15ml离心管中。
2.480g、4℃离心沉淀细胞5min。
3.弃去上清，勿搅动沉淀要点：操作一下步骤时，所有细胞需保持冰冻状态；不离心或震荡时保持细胞在冰上。
4.离心管中加入10ml冰冻PBS,来回吹打重悬细胞。
5.480g、4℃再次离心细胞5min。
6.弃去上清，勿搅动沉淀。
7.重复步骤4-6两次。
8.在最后一次洗涤后，把离心管完全空干，用滤纸将沉淀上残留的PBS吸干。
9.用移液器将抽提缓冲液加到离心管中。
依赖所研究的细胞系来确定抽提缓冲液的体积。
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析操作步骤:1.样品准备:将待测蛋白质混合物进行样品处理，如蛋白质提取、浓缩和去污等步骤，以获得高纯度、高浓度的样品。
2.第一维电泳:将样品加载到等电点聚焦凝胶中。
等电点聚焦是根据蛋白质的等电点进行分离的方法，即根据蛋白质电荷差异使其定位到等电点位置。
通常使用毛细管等电点聚焦，具体操作步骤是：将样品注入到毛细管中，两端分别连接正负电极，施加电压使得蛋白质开始迁移，直到在等电点位置停止。
这个阶段的电流较低。
3. 第一维凝胶电泳结束后，可使用pH梯度(pH gradient)的凝胶电泳或两种缓冲液浸泡在两边以建立静电场将蛋白质进一步扩散。
4.第二维电泳:将第一维电泳分离得到的凝胶嵌入到另一种凝胶中进行第二次电泳。
通常使用SDS-凝胶。
该凝胶使用离子溶液降解电荷，所有的蛋白质都将带有同样的电荷。
这个阶段的电流较高。
5. 染色和图像分析: 电泳结束后，可以用染色剂进行染色，如Coomassie蓝染色或银染色。
然后使用透射扫描或数字图像分析仪，获取电泳凝胶的图像，并进行质谱分析。
解析与解释:1.蛋白质双向凝胶电泳可以提供更高的分辨率和更好的分离效果，因为它结合了等电点聚焦和SDS-的优势。
2.在等电点聚焦过程中，蛋白质根据其等电点的差异而聚集在凝胶中的不同位置。
这一步骤可以将样品分离成多个窄条带，每个窄条带包含具有相似等电点的蛋白质。
3.在第二维电泳中，蛋白质将根据其分子质量而进一步分离。
较小分子量的蛋白质可以迁移到更远的位置，而较大分子量的蛋白质则停留在较近的位置。
4.通过染色和图像分析，可以将电泳凝胶的图像数字化并用于质谱分析。
这将帮助确定每个蛋白质的分子质量和相对丰度。
蛋白质双向凝胶电泳是一种非常有价值的蛋白质分析方法，尤其适用于分析复杂的混合物。
通过合理的操作步骤和解析方法，可以获得高质量的实验结果。
这些结果对于了解蛋白质的功能和相互作用，以及发现新的生物标志物具有重要的意义。
二维电泳步骤
双向电泳细胞样品的制备收集、裂解0、100μM Res作用24h的A549细胞：(1)倒净培养基，冷PBS洗涤3遍；(2)250mM蔗糖溶液洗涤3遍，吸净蔗糖溶液；(3)加入临时配好的裂解缓冲液（每100μl Lysis Buffer 加入DTT 1μl和pharmalyte 2μl），刮刀轻轻刮取细胞，装入EP管中，冰上裂解30 min；(4)离心（10000rpm，10min，4℃）后收集上清蛋白样品。
以上操作均在4℃条件下进行。
细胞全蛋白除盐(1)混匀蛋白样品和2%脱氧胆酸钠，按99：1的比例，冰上放置30min。
(2)加入100%TCA到样品中，使TCA终浓度为15%，涡旋30sec，防止形成大的沉淀物。
(3)蛋白样品在-20℃冰箱中沉淀过夜。
(4)15000*g下离心10min，吸出TCA和已经溶解的物质。
(5)无水乙醇冰浴清洗蛋白，过程中尽量把蛋白沉淀打碎，可以涡旋30min，在室温放置5min。
(6)15000*g下离心10min，吸出上清液倒掉。
(7)重复无水乙醇冰浴清洗蛋白过程三次，在室温放置到蛋白快干，加入裂解液溶解蛋白。
Bradford法测定蛋白浓度(1)将蛋白标准品（0.5mg/mlBSA,牛血清白蛋白）取出复温至完全溶化；(2)将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 μl加入96孔板中，用PBS补足至20μl；(3)将适量体积样品加入至96孔板中，加PBS补足至20μl；每个样品做平行孔3个；(4)每孔加入200μl 考马斯亮蓝G250染色液，室温振荡3～5min；(5)用酶标仪测定630nm吸光度，以OD630为X轴、标准蛋白浓度为Y轴制作标准曲线，根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
第一向等电聚焦（IEF）(1)样品水化：a.根据计算好的样品上样体积计算上入槽内的混合膨胀液RS总体积，将现配的RS（每100μl Rs Buffer 加入DTT 1μl和pharmalyte 0.5μl），平铺在膨胀槽内（根据胶条长度）；b.从冰箱取出胶条，撕开胶条上的膜，膜面朝上、胶面朝下慢慢放入铺有RS的槽段（尽量避免产生气泡），来回轻轻拉动胶条，使胶条均匀覆盖样品；c.滴上石蜡油覆盖胶条，盖上盖子膨胀12-20h（注意调好膨胀槽至水平位）。
2-DE
双向电泳双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE 的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
蛋白质组研究蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心. 双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化. 双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离. 目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点(spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行.样品制备(sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效，目标是尽可能扩大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白，两者联合有协同作用. 对IEF(isoelectric focusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质. 理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理. 而离液剂2 mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients)胶上的转换. 三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP )取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键，增强了蛋白的溶解度，并导致转至第二向的增加］. 两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度，作为互补试剂会更有效. 在保持样品的完整性的前提下，可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA). 除此之外，机械力被用来对蛋白分子解聚，如超声破碎］等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制剂，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的，可在其水化的过程中加样，覆盖整个IPG胶，避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失］. 此外，低丰度蛋白(low abundance protein)在细胞内可能具有重要的调节功能，代表蛋白质组研究的“冰山之尖”，故分离低丰度蛋白是一种挑战. 亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1～15 mg级的标准)、应用敏感性检测，可以提高其敏感性. 如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测. 提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basic proteins)的分离是另一难点. 由于碱性pH 范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生，对PI(等电点)超过10的碱性蛋白，通过产生?0～10%?的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之. 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性.蛋白质组研究蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心. 双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化. 双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离. 目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点(spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行.样品制备(sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效，目标是尽可能扩大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白，两者联合有协同作用. 对IEF(isoelectric focusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质. 理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理. 而离液剂2 mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients)胶上的转换. 三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP )取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键，增强了蛋白的溶解度，并导致转至第二向的增加］. 两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度，作为互补试剂会更有效. 在保持样品的完整性的前提下，可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA). 除此之外，机械力被用来对蛋白分子解聚，如超声破碎］等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制剂，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的，可在其水化的过程中加样，覆盖整个IPG胶，避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失］. 此外，低丰度蛋白(low abundance protein)在细胞内可能具有重要的调节功能，代表蛋白质组研究的“冰山之尖”，故分离低丰度蛋白是一种挑战. 亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1～15 mg级的标准)、应用敏感性检测，可以提高其敏感性. 如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测. 提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basic proteins)的分离是另一难点. 由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生，对PI(等电点)超过10的碱性蛋白，通过产生?0～10%?的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之. 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性.2-DE面临的挑战2-DE面临的挑战是高分辨率和重复性. 高分辨率确保蛋白最大程度的分离，高重复性允许进行凝胶间配比(match). 对2-DE而言，有3种方法分离蛋白：1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O’Farrell’s技术为基础. 第一向应用载体两性电解质(carrier ampholyte, CA)，在管胶内建立pH梯度. 随着聚焦时间的延长，pH梯度不稳，易产生阴极漂移. 2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis)用于分离碱性蛋白(pH>7.0). 如果聚焦达到平衡状态，碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失. 因此，在等电区域的迁移须在平衡状态之前完成，但很难控制. 3)IPG-DALT 发展于80年代早期. 由于固相pH梯度(Immobilized pH gradient, IPG)的出现解决了pH梯度不稳的问题. IPG通过immobiline共价偶联于丙烯酰胺产生固定的pH梯度，克服了IEF的缺点，从而达到高度的重复性. 目前可以精确制作线性、渐进性和S型曲线，范围或宽或窄的pH梯度. 新的酸性pH 3～5或碱性pH 6～11的IPG凝胶梯度联合商品化的pH 4～7的梯度可对蛋白质形成蛋白质组重叠群(proteomic contigs)从而有效分离.分离后的斑点检测分离后的斑点检测(spot detection)亦很重要. 所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外，还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性. 目前，没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术. 银染已成为一种检测2-DE的流行方法，可检测少到2～5ng的蛋白，因此较考马斯亮蓝R-250敏感. 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色，一些有机染料不适于PVDF膜. 放射性标记不依赖其代谢的活性，并仅适于对合成的蛋白质检测. 另有一种改良的2-DE(差异凝胶电泳)，即应用两种不同的染料荧光标记两个样品，使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个，避免了几种2-DE的比较，可在纳克级进行检测.较早期相比，2-DE有两个主要的进步：首先，极高的重复性使有机体的参考图谱，可通过Internet获得，来比较不同组织类型、不同状态的基因表达；其次，高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术.常见问题及其解答重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑2D 的一向吗？一般情况下是可以的。
双向电泳操作双向电泳的技术流程和样品制备ppt课件
第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽 提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的 11%（W/W）。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸 展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能 量域。其典型代表是尿素和硫尿。
双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括 多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。
防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰
（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证
Amount 4.1ml of 8.5 stock or 2.1g urea in 3ml H2O 760mg
50ul of 200mM TBP stock
200mg See table 10ul of 0.1% stock To 5ml
Multiple surfactant solution preparation 经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用
IPG pH Range 3-10 4-7
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细胞裂解（蛋白质提取）一、试剂配置：PBS配方PBS缓冲液一般作为溶剂氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM 3.63g磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM 0.24g加水至1L配好后进行高压灭菌。
Washing buffer（500mL）配方Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH）裂解储液配方（细胞）：尿素(MW 60.06) 7M 4.2g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。
裂解储液配方（组织）：尿素(MW 60.06) 5M 3g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 2% 0.2gTris（MW 121.1） 40mM 0.048g加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。
裂解液：裂解液储液 100uLIPG buffer（pH可选） 2% 2uLPi 2uLNucLease mix（100×） 1uLPMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uLDTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uLPi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装考马斯亮蓝G-250：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比。
考马斯亮蓝G-250 0.01% 100g95%乙醇 4.7% 50mlH3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，与用水溶解的100ml H3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。
二、实验准备：1、准备冰盒，细胞裂解过程均在冰盒内进行（4℃）；2、准备4℃离心机，开机降温，保证温度下降至4℃；3、取出置于-20℃保存的试剂，需冰上融化，最后取出细胞样品。
三、样品制备：（一）细胞细胞裂解准备：1、收集细胞，使用大于500g转速离心5min；2、弃去上清，使用washing buffer重悬细胞沉淀，震摇待细胞完全打散后，继续用大于500g转速离心5min；3、重复步骤2两次，并使用转速2000rpm离心5min，弃上清。
细胞可置于-80冰箱保存数周，或使用裂解液裂解。
细胞裂解：1、配置裂解液：注意先不要加入DTT。
DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。
临用前加入PMSF 抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；后，立即将细胞裂解液加入待裂解的细胞中。
2、加入裂解液的细胞置于冰盒内，每隔5-7min取出，于漩涡振荡器上震摇数秒，并再次放于冰盒中，保证细胞裂解时的温度为4℃。
3、裂解15-20min后加入DTT。
4、裂解完成后，置于4℃离心机中，以最大转速13200rpm离心30min，取上清，弃沉淀。
上清所含提取的蛋白。
5、使用bradford法测定提取蛋白浓度。
（二）、组织：组织裂解准备：1、提取动物组织。
提取时务必保证组织的纯度，尽量减少组织混杂，尤其注意血液的混入。
2、使用washing buffer冲洗组织2-3遍，洗净组织的血液、体液、和其他影响实验结果的残留成分。
3、准备研钵，洗净并且烘干，准备适量的组织裂解液，准备充足的液氮，石英砂适量。
组织裂解：1、配置裂解液：注意先不要加入DTT、 PMSF。
2、将适量石英砂加入到研钵中，加入液氮冷却。
3、将组织放入装有液氮的研钵中，研磨组织，在研磨过程中保证样品在低温状态下。
4、研磨完成后将样品及石英砂收集到离心管中，在裂解液中迅速加入PMSF，混匀后将裂解液加入含有样品的离心管中。
保持4℃，震荡混匀，每隔5-7min取出，于漩涡振荡器上震摇数秒，并再次放于冰盒中。
5、裂解15-20min后加入DTT。
6、使用2000g离心10min，吸取上清即为所提取的蛋白，下层石英砂及组织碎片则丢弃。
将上清使用13200g转速离心，弃去沉淀。
（三）、血清：血清样品可直接用于双向电泳实验。
但样品中含有大量的IgG和白蛋白，需要使用试剂盒去除。
四、试剂说明：裂解液成分：溶液中还原剂的含量不要超过20mM。
尿素/硫脲：变性剂，中性促溶剂，促进样品溶解，破坏氢键等次级结构，使所有离子基团暴露在溶液里。
硫脲可以促进膜蛋白的溶解。
尿素在30℃以上容易降解，降解产物异氰酸盐可使样本中蛋白质甲氨酰化，对蛋白质进行修饰，造成等电点改变，形成人为地“斑点串”。
CHAPS:两性表面活性剂，CHAPS是一种非变性的zwitterionic 去垢剂、蛋白质裂解液，用于增溶膜蛋白和裂解蛋白-蛋白之间的相互作用。
CHAPS是两性离子去垢剂，分子结构中具有一个胆酸和硫代甜菜碱。
在紫外区的低吸光性成为用紫外方法检测膜蛋白的首选去垢剂，CMC值均为8 mM。
常用于于双向电泳等实验。
原理：CHAPS保护蛋白质的天然状态，可溶解膜蛋白，从而互作用。
透析可除去。
SDS：(FW 288.38)离子型去垢剂，裂解力强，基本可以把细胞完全破坏掉。
并且使蛋白变性失活。
不得与强氧化剂混合。
它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸蛋白复合物。
NP-40：乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P 40；）很温和的非离子型去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。
与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。
尤其用于膜蛋白的非变性条件下的溶解。
TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚，一种非离子型表面活性剂，能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。
1%的Triton X-100常用于漂洗组织标本，0.3%的Triton X-100则常用于稀释血清，配制BSA等。
能力介于NP-40和SDS之间，偏向于NP-40，在保护蛋白活性方面有一定作用。
EDTA：变性剂和稳定剂，通过螯合金属离子有效抑制蛋白酶的活性。
DTT：二硫苏糖醇，还原剂，储液配置：0.4g/mL。
使用浓度约为40mM。
防止蛋白通过巯基氧化聚合，增加蛋白的可溶性。
DTE：二硫赤酰糖醇，与DTT近似，也做还原剂。
ASB14: Amidosulfobetaine 14，TBP:tri-Butyl-Phosphate磷酸三丁酯、三丁基膦，有毒，具有较低的表面张力，难溶于水，常用作消泡剂。
非巯基还原剂，使用浓度为2mM，但溶解性有限，在溶液中不稳定，在样品制备时需DTT联合使用。
脱氧胆酸钠：Sodium deoxycholate，中度变性剂和蛋白溶解剂。
SB3-10：硫代甜菜碱10，诱食剂，甲基供给剂。
DeStreak试剂和DeStreak水化溶液：将蛋白质巯基转变为稳定地二硫化物基团，防止发生非特异性氧化反应，有效减少蛋白质在电泳过程中因再氧化而发生的拖尾，特别是pH7-11的范围内（碱性蛋白质）。
PMSF：苯甲基磺酰氟，储液配置(100mM)：20mg/mL，在水中易失活，使用异丙醇或DMSO配置。
强大的不可逆蛋白酶抑制剂，抑制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶以及含有巯基的蛋白酶，使用浓度为1mM。
浓度测定：核酸酶（Nuclease mix）：核酸酶的构成是由牛胰腺Dnase 和Rnase以及维持最佳核酸酶活性所必须的各种辅助因子组成。
核酸酶受EDTA的干扰，使用核酸酶时避免加入EDTA。
可与蛋白酶抑制剂（PI）同时使用，但要注意必须选择无EDTA的蛋白酶抑制剂。
（注意：核酸酶试剂组为悬浮液，使用前务必震荡混匀后分装。
）考马斯亮蓝：Coomassie brilliant blue.考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）比考马斯亮蓝R250多二个甲基。
MW=854；λmax=590―610nm。
测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
灵敏度比Lowry 法还高4倍，染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。
优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。
所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。
可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL。
该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。
去污剂的浓度超过0．2％影响测定结果。
如TritonX-100、SDS、NP-40等。
考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。
待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
R250较敏感，做定量实验用,染胶效果较好.染色后为红蓝色。
染色灵敏度比氨基黑高5倍。
尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。
但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。
此方法优点：干扰物质少，K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。
（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
蛋白质纯化一、目的：蛋白质纯化的目的在于去除样品蛋白中的盐、糖以及一些大分子杂质，杂质的存在严重影响双向电泳的结果。