实验六.肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定
细胞色素C的制备及测定
实验三吸附法制备细胞色素C 粗品一、实验目的1．学习细胞色素C 的理化性质及其生物学功能。
2．掌握制备细胞色素C 的原理。
3．掌握制备细胞色素C 的操作技术。
二、实验原理细胞色素C（cytochrome,Cyt）是呼吸链的一个重要组成成份。
是一种含铁卟啉基团的蛋白质，在线粒体呼吸链上位于细胞色素b 和细胞色素aa3 之间，细胞色素C 的作用是在生物氧化过程中传递电子。
细胞色素C 分子中含赖氨酸较高，所以等电点偏碱，为pH 10.8，分子量为12000～13000 道尔顿。
它易溶于水及酸性溶液，且较稳定，不易变性，组织破碎后，用酸性水溶液即能从细胞中浸提出来。
细胞色素C 分为氧化型和还原型两种，因为还原型较稳定并易于保存，一般都将细胞色素C 制成还原型的，氧化型细胞色素C 在408nm、530nm 有最大吸收峰，还原型细胞色素C 的最大吸收峰为415nm、520nm 和550nm，这一特性可用于细胞色素C 的含量测定。
由于细胞色素C 在心肌组织和酵母中含量丰富，常以此为材料进行分离制备。
本实验以猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱，三氯醋酸沉淀等步骤制备细胞色素C，并测定其含量。
三、实验材料1. 实验器材绞肉机；电磁搅拌器；电动搅拌器；离心机；72l 型分光光度计；烧杯(2000、1000、500m1)；量筒；移液管；玻璃漏斗和纱布；玻璃棒；透析袋2. 实验试剂⑴1M H2S04 溶液；1M NH40H 溶液；固体硫酸铵⑵25％硫酸铵溶液: 100m1 蒸馏水中含25 克硫酸铵，约相当于25℃时40％的饱和度⑶0.2％氯化钠溶液：称0.2 克氯化钠，用蒸馏水溶解并定容至100ml.⑷10%乙酸钡试剂：称10 克乙酸钡, 溶于100ml 蒸馏水中。
⑸20％三氯醋酸溶液(6) 人造沸石(60～80 目)⑺联二亚硫酸钠(Na2S2O4·2H2O)3. 实验操作（1）细胞色素C 的制备①材料处理: 取新鲜或冰冻猪心，除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心切成小块，放入绞肉机绞碎。
体外代谢产物实验报告
一、实验目的本实验旨在通过体外代谢实验，研究某种化合物在特定酶系作用下的代谢过程，鉴定其代谢产物，并分析其代谢动力学特性。
通过此实验，可以为该化合物的体内代谢研究提供实验依据，并为后续的药物研发和毒理学评价提供参考。
二、实验材料1. 实验化合物：待研究化合物A（纯度≥98%）2. 实验试剂：肝微粒体酶、NADPH、辅酶A、磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、硫酸铵、氯化钠、氢氧化钠等3. 实验仪器：低温离心机、紫外-可见分光光度计、高效液相色谱仪（HPLC）、质谱仪（MS）等4. 实验动物：比格犬（体重2-3kg）三、实验方法1. 肝微粒体酶的制备：取比格犬肝脏，剪碎后用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）制成匀浆，低温离心（10000g，4℃，10min）分离肝微粒体。
用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）调整肝微粒体蛋白浓度为10mg/mL。
2. 代谢反应：取肝微粒体酶溶液、NADPH、辅酶A和待研究化合物A，按一定比例混合，在37℃、pH 7.4的条件下进行代谢反应。
3. 代谢产物分析：代谢反应结束后，用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分析代谢产物，鉴定其结构。
4. 代谢动力学分析：通过计算酶的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax），分析酶的代谢动力学特性。
四、实验结果1. 代谢产物分析：实验结果显示，待研究化合物A在肝微粒体酶的作用下，产生了多个代谢产物，其中主要产物为B和C。
2. 代谢动力学分析：酶的米氏常数（Km）为0.5μM，最大反应速率（Vmax）为0.2μM/min。
五、讨论1. 本实验成功鉴定了待研究化合物A的代谢产物，为后续的体内代谢研究提供了实验依据。
2. 代谢动力学分析结果显示，该酶对化合物A的代谢动力学特性符合米氏方程，说明该酶对化合物A的代谢具有可逆性。
3. 通过比较不同酶系的代谢动力学参数，可以为药物研发和毒理学评价提供参考。
六、结论本实验通过体外代谢实验，研究了待研究化合物A的代谢过程，鉴定了其代谢产物，并分析了其代谢动力学特性。
细胞色素
细胞色素P450酶
细胞色素P450（cytochromeP450或CYP450, 简称CYP450）为一类亚铁血红素—硫醇盐 蛋白的超家族，它参与内源性物质和包括药物、 环境化合物在内的外源性物质的代谢。 广泛 分布于动物、植物和微生物等生物体内
P450蛋白与CO的结合在450nm处有特征吸收峰， 故将该酶系命名为细胞色素P45O酶系。
五、细胞色素P450酶与药 物代谢
• 在人体中，P450广泛分布于肝、肾、脑、皮肤
、肺、胃肠道及胎盘等组织器官，其氧化还原 反应发生在许多部位，主要在肝脏。
• 目前发现的人类细胞色素P450共有57种，约有
90%的临床药物都是经过这些细胞色素P450酶代 谢。其中最重要的是CYP3A4，约占全部药物的 50%
一、细胞色素P450简介
• 细胞色素P450（cytochromeP450或CYP450,简称CYP450）为一类
亚铁血红素—硫醇盐蛋白的超家族，它参与内源性物质和包括 药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢
• 细胞中，细胞色素P450主要分布在内质网和线粒体内膜上，作
为一种末端加氧酶，参与了生物体内的甾醇类激素合成等过程 。近年来，对细胞色素P450的结构、功能特别是对其在药物代 谢中的作用的研究有了较大的进展。最新研究表明细胞色素 P450还是药物代谢过程中的关键酶，而且对细胞因子和体温调 节都有重要影响。
• CYP在哺乳动物主要存在于微粒体和线粒体中。已发现几乎
1000种CYP广泛分布于各种生物机体内，在生理上有功能意义 的就有约50种，根据氨基酸序列的统一性分为17个家族和许多 亚家族。氨基酸序列有40%以上相同者划为同一家族，以阿拉 伯数字表示；同一家族内相同达55%以上者为一亚家族，在代 表家族的阿拉伯数字之后标以英文字母表示；在同一亚家族的 当同工酶则再以阿拉伯数字表示。
肝微粒体代谢产物鉴定
肝微粒体代谢产物鉴定
肝微粒体代谢产物鉴定
肝微粒体是细胞内的一种重要细胞器，它参与了多种代谢过程，包括
脂肪酸代谢、胆固醇代谢、药物代谢等。
肝微粒体代谢产物鉴定是一
种通过检测肝微粒体代谢产物来评估肝脏功能的方法。
肝微粒体代谢产物鉴定的原理是利用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS/MS）检测肝微粒体代谢产物的含量。
这些代谢产物包括脂肪酸代谢产物、胆固醇代谢产物、药物代谢产物等。
通过检测这些
代谢产物的含量，可以评估肝脏功能的状态。
肝微粒体代谢产物鉴定可以用于评估肝脏疾病的严重程度和预后。
例如，在肝炎、肝硬化等疾病中，肝微粒体代谢产物的含量会发生变化。
通过检测这些代谢产物的含量，可以评估肝脏疾病的严重程度和预后，为治疗提供参考。
此外，肝微粒体代谢产物鉴定还可以用于评估药物代谢的差异性。
不
同个体的肝脏代谢能力存在差异，有些人可能会因为代谢能力差异而
出现药物不良反应。
通过检测肝微粒体代谢产物的含量，可以评估药
物代谢的差异性，为个体化用药提供参考。
总之，肝微粒体代谢产物鉴定是一种重要的评估肝脏功能的方法。
通过检测肝微粒体代谢产物的含量，可以评估肝脏疾病的严重程度和预后，评估药物代谢的差异性，为治疗和个体化用药提供参考。
cyp450 诱导 检测 原理
cyp450 诱导检测原理摘要：1.CYP450 简介2.CYP450 诱导的原理3.CYP450 诱导的检测方法4.CYP450 诱导在药物研发和个体化治疗中的应用正文：一、CYP450 简介CYP450，全称为细胞色素P450 酶系，是一组参与生物体内外源性物质代谢的酶。
它们主要存在于肝脏、肺、肠道等组织，对许多药物、致癌物质、激素等具有生物转化作用。
CYP450 酶系在药物代谢、解毒、生物活性物质生成等多个方面具有重要意义。
二、CYP450 诱导的原理CYP450 诱导是指通过某种物质的作用，使CYP450 酶系的活性增强，从而加速药物或其他外源性物质的代谢。
这种诱导作用可以通过两种途径实现：一是诱导CYP450 酶基因的表达，使酶的量增加；二是增强已存在的CYP450 酶的活性。
三、CYP450 诱导的检测方法CYP450 诱导的检测通常采用体外实验和体内实验两种方法。
1.体外实验：主要通过检测CYP450 酶活性的变化，常用的方法有对硝基苯-4-羟酸酯酶测定法、7-羟基-4-三氟甲基香豆素酶测定法等。
2.体内实验：主要通过检测药物在体内的代谢速率，常用的方法有血药浓度监测法、尿药排泄监测法等。
四、CYP450 诱导在药物研发和个体化治疗中的应用CYP450 诱导在药物研发和个体化治疗中具有重要作用。
通过研究药物对CYP450 酶系的诱导作用，可以优化药物的剂量、给药间隔等用药方案，以提高疗效、减少不良反应。
此外，对于患者来说，根据其CYP450 酶系的诱导情况，可以选择更适合的药物和治疗方案，实现个体化治疗。
总之，CYP450 诱导在药物代谢、药物研发和个体化治疗等方面具有重要意义。
细胞色素P450ppt课件
同源性：两种核酸分子的核苷酸序列之间，或两种蛋白质分 子的氨基酸序列之间相同的程度。
.
4.细胞色素P450 功能
P450酶系是自然界中最具有催化作用的广谱生物催化剂。其功 能主要有两大类，一是催化内源性物质(如幽醇、脂肪酸及信 息激素等)的生物合成和降解，维持生物体的正常功能；二是 针对外源性物质包括人工合成的化学品（农药、致癌物、药物、 抗氧化剂、添味剂、溶剂、染料、麻醉剂、石油产品等）起到 解毒与活化的作用。
在医药工业中的应用
CPA:环磷酰胺
前药：是指经过生物体内转化后才具有药理作用的化合物。前体药物本身没有生物
.
活性或活性很低，经过体内代谢后变为有活性的物质。
在农业上的应用
1.害虫治理
许多害虫产生对杀虫剂的抗性是因为P450催化的杀虫剂代谢解毒作用增强， 因此P450的抑制剂是杀虫剂的有效增效剂。成功的抑制剂包括增效醚、增效菊 亚砜、莳萝油等。PBO是最为人熟知的增效剂。
.
根据细胞色素P450氧化酶在生物体中的分布可以分为两大类：
第一类是细菌/线粒体型，存在于细菌和真核细胞线粒体中
第二类是微粒体型，存在于真核细胞微粒体中
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2.细胞色素P450的多样性
多数情况下, 微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自 . 我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构,它包含内质网膜和核糖体两种基本成分。
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3.细胞色素P45O的命名
(1)以英文缩写CYP代表细胞色素P450(eytoehromeP450)，CYP后顺序 依次跟有数字、字母、数字，分别代表家族、亚家族、和同功酶。 如:CYP6A2，即表示该基因属于细胞色素P450第6家族中A亚族的第二 个基因；
细胞色素P450
2.转P450基因植物 转 基因植物
通过转基因方法可以培育出具有特异性质的植物，达到改良作物品质 通过转基因方法可以培育出具有特异性质的植物， 木质素，去除不良成分，改变花色及形状）、提高植物抗性（ ）、提高植物抗性 （木质素，去除不良成分，改变花色及形状）、提高植物抗性（病、虫、 除草剂） 目的。 除草剂）和实现生物除污的目的。
人类社会产生的有毒废物日益增多，迫切需要开发一种有效的途径以解毒 人类社会产生的有毒废物日益增多， 或降解这些废物。特别是多环芳烃及多卤代有机物， 或降解这些废物。特别是多环芳烃及多卤代有机物，它们的生物利率低且在 化学上是惰性的，成为环境污染治理的一大难题。 化学上是惰性的，成为环境污染治理的一大难题。 P450酶系可以通过羟 基化、环氧化、脱烷基化、 用催化多种结构不同的物质， 基化、环氧化、脱烷基化、脱卤化作 用催化多种结构不同的物质，使许多类 型的化合物的化学性质发生改变。 境化合物， 型的化合物的化学性质发生改变。人类创造的环境化合物，估计已超过
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根据细胞色素P450氧化酶在生物体中的分布可以分为两大类： 氧化酶在生物体中的分布可以分为两大类： 根据细胞色素 氧化酶在生物体中的分布可以分为两大类
第一类是细菌/ 第一类是细菌/线粒体型，存在于细菌和真核细胞线粒体中
第二类是微粒体型，存在于真核细胞微粒体中
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许多害虫产生对杀虫剂的抗性是因为P450催化的杀虫剂代谢解毒作用增强， 催化的杀虫剂代谢解毒作用增强， 许多害虫产生对杀虫剂的抗性是因为 催化的杀虫剂代谢解毒作用增强 因此P450的抑制剂是杀虫剂的有效增效剂。成功的抑制剂包括增效醚、增效 的抑制剂是杀虫剂的有效增效剂。 因此 的抑制剂是杀虫剂的有效增效剂 成功的抑制剂包括增效醚、 菊亚砜、莳萝油等。 是最为人熟知的增效剂。 菊亚砜、莳萝油等。PBO是最为人熟知的增效剂。 是最为人熟知的增效剂 已知许多来源于昆虫或其他生物的P450具有对杀虫剂的解毒能力，因此如将 具有对杀虫剂的解毒能力， 已知许多来源于昆虫或其他生物的 具有对杀虫剂的解毒能力 这些P450的基因转入到天敌昆虫中，可望提高寄生蜂等天敌昆虫对农药的抗性， 的基因转入到天敌昆虫中， 这些 的基因转入到天敌昆虫中 可望提高寄生蜂等天敌昆虫对农药的抗性， 有助于害虫的生物防治。 有助于害虫的生物防治。
细胞色素P450－一种外源和内源物质代谢中重要的物质
细胞⾊素P450－⼀种外源和内源物质代谢中重要的物质
细胞⾊素P450
学习感悟：今天在查阅资料的过程中，发现了⼀种特殊的酶－细胞⾊素P450。
这种物质能够催化分解某些外源和内源物质。
细胞⾊素P450（CYP450），也称混合功能氧化酶和单加氧酶，在外源性物质和内源性物质的代谢中起着极其重要的作⽤，外源物指的是在⼈们⽣活环境中存在的（包括⾷品、药品等）通过与机体接触，进⼊⽣物体内的物质，内源物是指参与了⽣物体内的甾醇类激素合成等过程。
CPY450主要存在于肝脏微粒体中，如内质⽹和线粒体内膜上，同时也少量分布于⼩肠、肺、肾、脑中。
由于它在还原状态下可与CO结合，且结合后在波长为450 nm处有⼀最⼤吸收峰，故名之。
近年来，对细胞⾊素P450的结构、功能特别是对其在药物代谢中的作⽤的研究有了较⼤的进展。
研究表明细胞⾊素P450是药物代谢过程中的关键酶，⽽且对细胞因⼦和体温调节都有重要影响。
肝微粒体代谢
肝微粒体代谢肝微粒体代谢是指在肝细胞内的微粒体内进行的代谢活动。
微粒体是一种细胞内的膜包被结构，是肝细胞中重要的代谢活动场所，具有氧化、解毒、合成、分解等多种代谢酶。
本文将从微粒体的结构与功能，细胞色素P450系统、柠檬酸循环等方面对肝微粒体的代谢进行详细介绍。
一、微粒体的结构与功能微粒体是一个直径约0.2~1μm的球形膜包被，由内部核心区域和外部透明区域两部分组成。
核心区域内含有许多含有酶活性的颗粒，称为微半滤泡，是微粒体的重要机能部位。
微半滤泡内含有氧化酶、脱氢酶、羧化酶等多种代谢酶，可以进行多种代谢反应，使微粒体成为肝细胞中重要的代谢活动场所。
透明区域内除了蛋白质外，还含有磷脂、胆固醇和三酰甘油等物质。
微粒体主要有以下3个功能：1. 氧化功能：微粒体内含有多种氧化酶和其他辅助酶，可以将一些有机物质氧化为产生能量或生成活性物质，如柠檬酸循环中的α-酮戊二酸脱氢酶、丙酮酸酸激酶、甘油酸磷酸酰转移酶等。
2. 解毒功能：微粒体内含有许多解毒酶，如γ-谷氨酰转移酶、酰转移酶、羟醛脱氢酶、过氧化氢酶和催化酶等，可以将入侵机体的毒素和代谢产物脱除或转化成水溶性物质，有利于排泄出体外。
3. 合成与分解功能：微粒体内含有许多酶，可以合成各种胆固醇、激素、脂肪酸等物质，并降解体内各种废弃物质，如脂肪酸代谢产物、血红蛋白等。
二、细胞色素P450系统细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）是微粒体内最重要的催化酶之一，是许多生物合成和降解反应的关键酶系统。
细胞色素P450酶目前已发现有很多种，分布于不同的组织和细胞。
其中的一部分是肝细胞内的酶，被称为肝微粒体细胞色素P450酶系统。
该系统被认为是微粒体最重要的代谢系统之一，参与了人体内许多生物活性物质的合成和代谢。
1. CYP酶的特点CYP酶是一类蛋白质催化酶，分子量约50 kDa，含有一个有着630~700 nm吸收峰的铁血红素分子，这就是著名的色素P450。
细胞色素P450
细胞色素P450概述摘要：细胞色素p450【1】是广泛存在于生物体内的一类含血红素和硫羟基的蛋白，相对分子质量50KD，在波长450nm处有最大吸收峰。
实际上，P450是属于血红蛋白类酶也是一类氧化酶，在原核生物中，游离于胞质中，为一种可溶性蛋白；真核生物中，作为一种膜结合蛋白，主要分布在内质网和线粒体内膜上。
其参与内源物质的代谢与外源物质的转化，细胞色素p450的末端氧化功能使其在碳同化、激素合成、外源物质降解、前致癌物的活化等方面起着重要作用，具有重要的研究价值和潜在的经济价值【2】。
关键词：细胞色素P450 结构与功能分子进化1分子进化分子进化包括自然界中自主发生的多种情况，如基因突变，基因倍增，基因转座与整合，外显子的重排，当病毒与细菌感染导致宿主的基因发生改变，一旦基因发生可遗传的变化，其编码的蛋白也将受到影响，在长期的自然进化中，适应性的蛋白最终得到保存，其中的核心部位具有进化保守性，如一些酶的催化活性基团以及关键的核心位点，除此之外，蛋白与蛋白之间相互作用，其中的反应交界面也是在长期的进化中产生相互的影响，其识别机制与反应特点都是在适应的过程中得到保存。
在自然条件下以外，通过人工方法加速分子进化已经成为一种普遍应用的手段，例如点突变技术，易错PCR，交错延伸技术，DNA改组技术等都能快速的实现分子进化从而改变蛋白的特性来满足所需要的要求。
1 细胞色素p450的分布细胞色素P45的分布【3】存在于不同的生物如细菌、真菌、植物、无脊椎动物、脊椎动物等（详细见表格1）和生物的不同组织中。
真菌P450可归为4个集团，植物P450可以分为4个集团，其中脊椎动物肝脏中细胞色素 P450含量最丰富，细胞色素P450主要分布于外源物进入体内必经的组织器官，构成外源物进入体内的第一道防线，如在哺乳动物中,它主要分布于皮肤、大脑、肺、胃肠道、肝脏、肾脏、肾上腺、睾丸、胎盘、黄体、主动脉、血小板和巨噬细胞等，高等植物的细胞色素P450分布在质膜、微粒体和高尔基体等处。
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院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定
1 实验目的
本实验通过超速离心法制备肝微粒体，利用Bradford法，学习并掌握了细胞色素P-450含量的测定。
2 实验原理
研究体外药物代谢常用的方法是制备肝微粒体或线粒体后部分，将肝组织制备成20％匀浆，按1g肝组织加0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液3mL ，磨成匀浆，用低温高速离心制备线粒体后上清液和超速离心法制备微粒体（内质网部分）-差速离心法。
细胞色素P-450是微粒体混合功能氧化酶中最主要的功能成分，其含量的高低基本可以反映混合功能氧化酶的活力大小。
细胞色素P-450是一种血红蛋白，当铁蛋白的铁离子被还原并与一氧化碳形成复合物时出现一种特异吸收峰，在波长450nm处呈现最大吸收峰，在490nm处为最低吸收。
根据两者的差值和吸收系数，可定量细胞色素P-450含量。
3 实验材料
3.1实验动物
大鼠：健康，体重200～250g，禁食过夜（24h）
3.2实验器材与试剂
器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等
试剂：1.17% KCl 溶液
Tris-HCl缓冲液： Tris 6.05 g ；蔗糖 68.4 g；
水 500 ml；浓盐酸调 pH 7.4；补水至 1000 ml
4.实验方法
4.1动物处理与匀浆制备
断头处死，放尽血液，迅速剖开胸、腹腔，取出肝脏，用冰冷1.17% KCl 溶液洗净血污，并用滤纸吸干表面水分。
肝脏称重，置烧杯中剪碎，按每克肝脏3ml的比例加入0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液，匀浆，将匀浆
倒入离心管中，用缓冲液洗涤匀浆管，使最后的缓冲液体积加至约20％（W/V）
的匀浆。
4.2制备线粒体后上清液
将肝匀浆置低温高速离心，以沉淀未破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，
上清液即为线粒体后上清液。
温度为0～4℃；离心力10 000～12 500g；时间
15～30min
4.3制备微粒体-超速离心法
取线粒体后上清液8～12mL，置超离心管；离心 100 000g 60min，弃上清
液；微粒体板用0.25mol/L蔗糖液或1.17％KCl液洗1次，以除去污染的血红蛋
白再离心 100 000g 30～60min，弃上清液；微粒体板沉淀物移至离心管，加适
量pH 7.4 Tris-HCl缓冲液重悬，终产物为微粒体悬液制备的肝微粒体每1g含
蛋白一般在20mg左右；最好当天使用。
若保存，应加20％（V/V）甘油分装于
塑料管，置-20~-80℃，可保存数周而酶活性不减。
4.4微粒体蛋白浓度测定
1.微量法制定标准曲线取8个1.5ml离心管，分别编号0-7，按下表配制
浓度梯度标准蛋白溶液。
表1 浓度梯度标准蛋白溶液
样品编号0 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白溶液
0 25 50 100 200 300 400 500
(μL)
Tris-HCl缓冲
1000 975 950 900 800 700 600 500 液(μL)
标准蛋白浓度
0 0.025 0.050 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
（mg/ml）
考马斯亮蓝试
200
剂(μL)
取上述各浓度蛋白标准稀释液20μL 与考马斯亮蓝染色剂200μL至96孔酶标
板内，各设三个重复孔，混匀，室温静置5-10min，以0号试管为空白对照，于
595nm处比色测定各孔OD值。
以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，
在坐标纸上绘制标准曲线。
2.未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上，分别取肝微粒体悬液100倍和
200倍稀释液20μL，测定OD595nm值，平行测定三次。
根据所测定的平均OD595nm
值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓
度(mg/mL)。
4.5细胞色素P-450含量测定
取蛋白含量已知的组织样品用pH7.4 0.1mol/L Tris缓冲液(1.21g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至100ml稀释为每1mL含 10mg微粒体蛋白的悬液；取此液0.3mL，加上述缓冲液5.7mL，混合；分装于2个比色杯（大约3mL），一个作为样品杯，另一个作为参比杯，置双光束紫外分光光度计，扫描400和500nm间的基线；加数mg连二亚硫酸钠，搅拌，样品杯轻轻充CO约1min，再扫描400～500nm的差示光谱。
4.6结果计算
P-450含量＝△OD（450-490）×1000/91×蛋白浓度C × r （mg/ml）×
稀释倍数（ nmol/mgPr）
ΔOD为450nm处光密度值与490nm光密度值之差 91为CYP450的消光系数，单位：cm2／mmol
r为比色杯光径长度，单位：cm
C为微粒体制备物的蛋白浓度，单位：mg／ml
5.实验结果
5.1 标准曲线的绘制
Bradford法测定标准蛋白结果和标准曲线见表2和图1
表2标准蛋白595nm的OD值
标准蛋白浓度
0.025 0.050 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 （mg/mL）
吸光度A0.399 0.477 0.561 0.684 0.763 0.836 0.882 以表2的数据绘制标准曲线如下。
图1标准曲线
5.2．未知样品蛋白质浓度的测定结果
表3 未知样品蛋白质浓度595nm的OD值
溶液测定校正值校正均值稀释100倍0.942 0.951 0.951 0.967
1.013 0.976 0.970
稀释200倍0.807 0.809 0.808 0.814
0.793 0.824 0.841
根据所测定的平均OD595nm校正值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，计算出稀释100倍和200倍的蛋白浓度分别为53.96mg/ml，76.83mg/ml。
因此，未知样品的蛋白浓度: 65.40mg/ml
5.3 细胞色素P-450含量测定
由于实验过程中未充入CO ，因而未能测定细胞色素P-450,但是在420nm 波长下测得细胞色素B5的差值光谱。
图2 双光束紫外分光光度计测得细胞色素B5的差示光谱（0.5mg/ml）
OD值峰值（424nm）：0.0197；谷值（490nm）：0.00547。
6 实验讨论
肝微粒体是肝细胞中内质网的亚细胞组分，含有丰富的药物代谢酶：其中细胞色素P450酶广泛的参与了各种物质的生物合成和代谢；肝S9是肝匀浆液的去线粒体上清液，包含了大量的CYPs等药物代谢酶。
因此，微粒体是非常有价值的研究药物代谢和药物相互作用的工具。
实验注意：操作的全过程及所用器械、人；溶液均应维持在0℃～4℃范围内，匀浆器始终应浸在冰水浴中，以避免肝微粒体酶因热变性而失活。
制备无菌微粒体，需对所使用的全部器材和溶液进行灭菌处理。
细胞色素P-450含量依组织、动物是否诱导、种属、品种等而定，一般未诱
导的大、小鼠肝细胞色素P-450含量为0.4～1.0nmol/mg微粒体蛋白。
为避免血红蛋白破坏，保险粉加入不宜过多。
在缓冲液中加20％甘油可减少转化为无活性的细胞色素P-420，一般测定不需加甘油。
样品与保险粉混合后应尽快充CO，因细胞色素P-450的还原形式不太稳定；充CO时速度宜慢，以免泡沫太多导致蛋白变性。
充CO后如果420nm处吸收峰比较明显，表明有失活的细胞色素P-450，样品不能使用。
本次试验中，在测定蛋白浓度的时候，由于考马斯亮蓝试剂保存时间太长，使得测定的蛋白浓度不准确；在测定P-450含量时，由于外部原因并没有充入CO，因而分光光度计在450nm处并没有出现峰值，而是在424nm处出现峰值，经查是细胞色素B5的峰值。
细胞色素B5也存在于肝微粒体中，还原型b5与氰感受因子的酶一起，参与由氧将饱和酰基辅酶A转变成不饱和酰基辅酶A的脂肪酸不饱和化反应。
通过测定一系列蛋白浓度浓度的差示光谱，确定了当蛋白浓度为0.5mg/ml时的光谱图效果比较好，该谱在紫外区的吸收杂峰不很明显，并且有着很明显的波峰和波谷，效果理想。