蛋白质芯片的应用进展及其存在问题

蛋白质芯片的应用进展及其存在问题马丽娟，王卓，胡晋红*（第二军医大学长海医院药学部上海 200433）摘要：蛋白质芯片是继基因芯片后发展起来的生物检测技术。

它的出现将从根本上改变生物医学实验和诊断等多方面的现状，并表现了良好的前景。

对蛋白质芯片的应用进展进行了综述，同时对其存在问题进行了分析。

关键词：蛋白质芯片检测技术应用存在问题通过人类基因组计划,研究者已经测定了人类基因组序列,并发现了成千上万的新基因。

但同时人们要面对一个新的问题,仅基因组学的研究并不能得到生物功能的完整信息:我们通过基因组工程得到了蛋白质的基因序列,但仅仅从基因组顺序我们依然无法了解蛋白质的定位、结构、修饰(磷酸化,糖基化,乙酰化和水解等)等信息,更无法确定蛋白质的功能[1]。

因为蛋白质才是生命活动的执行者和体现者。

1994年Wilkin和Williams首次提出了蛋白质组(proteome)的概念。

与经典的蛋白质化学研究相比,它的研究对象不再只是一种或几种蛋白质,而是着眼于全面性和整体性来研究所有蛋白质的性质与功能及蛋白质相互作用。

人们需要一种新的技术来进行大规模的蛋白质分析,蛋白芯片(protein chips)或称蛋白微阵列(protein microarrays)技术于是应运而生。

一、蛋白质芯片的概念及特点蛋白质芯片是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新的方法[2，3]。

它类似于基因芯片，是将蛋白质点到固相物质上，然后与要检测的组织或细胞等进行“杂交”，再通过自动化仪器分析得出结果。

这里所指的“杂交”是指蛋白与蛋白之间如（抗体与抗原）在空间构象上能特异性的相互识别。

将各种蛋白质有序地固定在玻片、凝胶、微孔板等各种载体上形成密集蛋白质芯片,用来高通量地测定蛋白质的生物活性,如酶活性,蛋白质-蛋白质间及蛋白质-其他分子,如蛋白质-DNA,蛋白质-配基间的相互作用[4]。

蛋白质芯片具有以下特点：[5，6]（1）特异性强，这是由抗原抗体之间，蛋白与配体之间的特异性结合决定的；（2）敏感性高，可以检测出样品中微量蛋白的存在，检测水平已达ng级；（3）通量高，在一次实验中对上千种目标蛋白同时进行检测，效率极高；（4）应用性强，样品的前处理简单，只须对少量实际标本进行沉降分离和标记后，即可加于芯片上进行分析和检测。

二、蛋白质芯片的应用1、蛋白质功能研究方面的应用MacBeath 和Schreiber[7]用蛋白质芯片来研究蛋白质-蛋白质，蛋白质-小分子以及酶-底物之间的相互作用，并且讨论了这种方法的可行性。

Zhu等用酵母蛋白质芯片对酵母蛋白*通讯作者：胡晋红（1949-）硕士和博士生导师，长海医院药学部主任。

E-mail:hujh@作者简介：马丽娟，女，硕士生。

E-mail:malijuan190719@质的活性进行全分析，发现了新的钙调蛋白结合蛋白和磷脂结合蛋白，同时发现了许多钙调蛋白结合蛋白共同存在一个潜在的键合域。

他们还应用该蛋白质芯片观察了蛋白与药物之间的相互作用，并测定了后转录修饰。

和酵母双杂交技术相比，蛋白质芯片克服了它的许多局限性，它将成为研究蛋白质功能的有力工具。

2、临床方面的应用蛋白质芯片技术在临床方面有着广泛的应用，尤其是在疾病的诊断和疗效判定，即生物学标志物的检测上，蛋白质芯片技术具有很大的应用价值和前景。

Rosty[8]等同样利用蛋白质芯片和SELDI技术对胰腺癌患者（15例）的胰液和其他胰腺疾病（7例）的胰液进行了比较。

结果在10例（67%）胰腺癌患者和1例（17%）其他胰腺疾病患者的胰液中发现一个大约为16。

57kD的蛋白质峰。

经过蛋白质芯片免疫测定，确定该蛋白质为肝癌-小肠-胰腺/胰腺炎相关蛋白I（HIP/PAP-I）。

HIP/I在胰腺癌患者的胰液及血清中的表达量上的差异较血清更为显著。

这提示我们，通过对胰液中HIP/PAP-I的检测将有助于胰腺癌的诊断。

蛋白质芯片还可应用于自身性免疫疾病的诊断[9]。

蛋白质芯片的应用,给肿瘤诊断和预后提供了一种高效,高通量的方法,适合肿瘤的普查。

一般是先从抗体库中挑出对肿瘤诊断或预后有潜在意义的抗体,制成抗体芯片。

然后提取正常组织和肿瘤组织的蛋白质用不同的荧光染料进行标记,后与芯片反应,通过计算机分析得出结论。

Englert等[9]将抗体点在基片上制成抗体芯片，用来检测正常组织和肿瘤组织中差异表达的蛋白质，发现如明胶酶A等在肿瘤的发生中起着重要作用。

3、蛋白质芯片在分子药理学研究中的应用分子药理学研究的基本理论是受体学说。

受体的本质是蛋白质，对于受体的研究可以阐明药物，激素及神经递质的作用原理和生物信号转导急智，为药物设计，靶点的选择和用药方案的确定提供理论的依据。

孤儿受体缺乏配体无法利用传统受体/配体方法研究其药理学作用。

蛋白质芯片将成为解决这一难题的有力工具，可将孤儿受体固定于载体表面，利用非标记技术找到其相应的配体。

根据Schwartz等提出的受体别构模型及Pejman Ghanouni等研究成果[10]，直接以荧光标记孤儿受体，检测在受体配体诱导下，随受体构象的改变的标记孤儿受体荧光值。

这一新方法一旦成熟，将会为药理学的研究开辟一片新天地。

4、新药研制方面的应用低耗，快速，高效地筛选出新药或待选化合物是目前新药开发工作急需解决的问题[11]。

蛋白质芯片高通量，并行性的特点，为新药的研制提供了一条新的思路，大大加快了化合物筛选的速度。

蛋白质芯片有助于了解药物与其效应蛋白的相互作用,并可以在对化学药物作用机制不甚了解的情况下直接研究蛋白质谱。

目前，国内已有人利用基因芯片对中药复方-黄连解毒汤进行了尝试性研究[12。

Reilly等[13]应用高密度芯片研究了给予中毒量醋氨酚的大鼠肝脏中基因表达的调节，发现编码细胞周期调节蛋白，转录因子LRG-21，细胞因子信号转导（SOCS）-2-蛋白，血浆酶原活化抑制分子-1（PAI-1）等多种蛋白的基因表达增多了两倍多，提示它们在增加或阻止进一步的肝脏毒性作用中具有潜在的重要性。

蛋白质芯片突破了酵母双杂交系统技术的局限性，通过两类基本蛋白质芯片研究技术[14]——蛋白质功能芯片和蛋白质检测芯片，对蛋白质进行直接体外研究，以获得新型药物靶标。

在药物研发中，区分和确定蛋白质的作用是发现新的诊断和治疗药物的第一步。

Zhu等[15]克隆了5800个酵母细胞的开放阅读框架（ORF），过表达且纯化其相应的蛋白质，可用于研究不同蛋白质之间的相互作用，也可以用于研究蛋白质与药物之间的相互作用和蛋白质翻译后的修饰。

Lueking等[16]从人胎儿脑cDNA表达库（hExl）中克隆出92个cDNA，将反转录的蛋白阵列用以检测来自噬菌体表面(phage display)的单抗或scFV片段，目的是找出共同抗原决定簇及进行质量控制。

5、其他方面应用蛋白质芯片研究药物作用的机理及细胞对药物所作出的反应[17]。

在临床试验中,利用蛋白质芯片跟踪药物所引起的蛋白质的表达就可以确定被检药物对人体是否有毒副作用,或达到多大剂量才会引起毒副作用。

此外,蛋白质芯片还能运用于环境监测及食品工业中,用来检测环境或食品由微量的有毒化学物质或病原菌。

Grow等[18]利用表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering,SERS)芯片技术,根据各生物体(革兰氏阳性李斯特菌,革兰氏阴性军团菌,芽孢杆菌的芽孢和隐孢子虫卵囊)拉曼散射指纹图谱,检测病原体与所含毒素。

Stokes等[19]采用配备微流体传输系统的二维感光芯片,利用集成电路原理与免疫诊断技术检测大肠杆菌O157:H7,这可以杜绝大规模肠道感染的发生。

三、存在问题蛋白质芯片的研究尽管在很多方面取得了许多进展，但是该项目毕竟是刚刚起步，仍有许多关键技术，特别是涉及应用领域的关键技术有待研究和突破。

由于蛋白质本身的变化太多，且空间构象在很大程度上决定其活性与功能，相对于目前基因芯片研究的进展速度而言，蛋白质芯片的研究显然相对滞后。

首先是成本问题，蛋白质芯片的制作工艺相当繁琐、复杂，特别是涉及大量不同种类的蛋白的高效表达与纯化，而且仪器也需要有专门的，一般的实验室都承受不起，但随着经济的进一步改善，从根本上会满足需要的.其次是此技术要求有专门的技术人员去操作，如何提高蛋白质芯片的各个操作环节集中到一个或几个仪器里边，使即使对芯片技术不熟悉的人也可以操作，这将是把技术推广到临床未来发展的一个重要发展方向.再者，蛋白质芯片在制作过程中实验条件发生微小的变化便可能引起最后结果的不同，实验条件不宜控制，使得实验结果的可重复性相对不足.第四，制备全面、高通量分析的蛋白质芯片仍需大量的蛋白和高特异性，高选择性的抗体，而cDNA库表达，纯化的蛋白由于没有合适的表达系统，缺乏有效的转录后修饰系统而影响表达蛋白的活性，尽管采用了原核表达系统，可以大大量产生外源蛋白，但对于某些外源蛋白来说，却能在包涵体中聚集和积累，而且宿主细菌对某些蛋白不能正确的折叠以及进行磷酸化或糖基化等修饰，这将影响芯片的检测效率.第五，细胞中存在许多膜结合蛋白，如酵母中膜结合蛋白和分泌蛋白就占了总蛋白的28.2%，许多膜结合蛋白只有和膜脂结合在一起才有活性，所以提取或重建时要将蛋白和相应的膜脂一起，这对于蛋白质芯片的制作是困难的；第六，对于肝炎病毒感染所引起的免疫反应，蛋白质芯片的准确受限于所选择的抗原或抗体的来源、纯度与特异性，并且蛋白质类抗体的生产与应用存在着抗原性、免疫原性的强弱，异源抗体的类风湿因子和自身抗体的干扰、罕见抗体的高工作量筛选、克隆株（细胞）的不易保存、无法标准化生产、体内外的识别特异性差异、对温度敏感所发生的不可逆变性等因素的限制，蛋白质芯片的广泛使用还需要一定的技术支持；最后是目前，对于实验的许多结果还不能做出完美的解释，这将依赖于生物学的整体发展，这也促进了人们对生物学进行更深层次的研究。

四、展望作为一种新兴的蛋白质组学研究手段，蛋白质芯片技术具有的高通量、快速、平行、自动化等无法比拟的优点，将极大地推动人类揭示疾病发生发展的分子机制及寻找更合适有效治疗的进程[20]。

虽然它还存在很多有待解决的问题，但随着微加工技术、纳米技术[21]和其他技术的发展，改进技术细节，降低成本，蛋白质芯片存在的问题将逐步得到解决。

将逐步实现它对人类蛋白质组学、医学研究、药物开发和临床诊断的巨大推动作用。

特别是随着人类基因组计划的完成，以研究蛋白质功能为重点的后基因组时代已拉开序幕，蛋白质芯片技术将从根本上改变生物学和生物技术的观点和效率，为生命科学的发展做出卓越贡献[22-24]。

参考文献1Gygi．S．P．，Rochon Y，Franza BR et a1．Correlation between protein and mRNA abundance in yeast．Mo1．Cell Biol．1999,19(3)：1720—1730.2Albala JS．Array-based proteomics：the latest chip challenge[J]．Expert Rev Mol Diagn，2001，1(2)：145-152．3Mouradian S．Lab-on-a-chip：applications in proteomics[J]．Curt Opin Chem Biol，2002，6(1)：51-56．4 李瑶．基因芯片与功能基因组[M]．北京：化学工业出版社，2004:32-34.5 Stoll D，et a1．Protein microarray technology．Front Biosci，2002，7: l3-32．6 Wilson DS，Nock S， Recent developments in protein microarray technology ．Angew Chem lnt Ed Engl，2003，42(5)：494-500.7 MacBeach G，Schreiber S L．Printing protein as microarray for high-throughput function determination [J]．Science，2000，289：176O-1763．8Rosty C,Christa I,Kuzdzal S,et al.Identification of hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancreatitis-associated protein I as a biomarker for pancreatic ductal adenocarcinoma by protein biochip technology。