啤酒发酵成熟度评价的研究_李红_闫素娟_康黎东_褚洁洁_金玮鋆

啤酒发酵成熟度评价的研究 李 红*，闫素娟，康黎东，褚洁洁，金玮鋆 （中国食品发酵工业研究院，北京 100015） 摘 要：双乙酰是啤酒发酵过程中酵母自身代谢产生的一种副产物，其含量是衡量啤酒成熟的主要指标。双乙酰含量的传统检测方法（VDK检测方法）存在一定的缺陷，而总双乙酰（TVDK）是双乙酰及其前驱体的总和，用TVDK来评价啤酒的成熟度具有正确的指导价值。本试验通过验证VDK检测方法中存在的缺陷，得出TVDK方法的可行性，并且研究了不同浓度啤酒发酵过程中TVDK的变化规律，通过阈值试验得出TVDK在啤酒发酵成熟评价中的控制标准为0.10 mg/L。试验提出了测定啤酒中总双乙酰的可行性方法，对保证啤酒的正常发酵起到了一定作用。 关键词：啤酒；总双乙酰；双乙酰；发酵成熟度

VDK，联二酮，系2，3-丁二酮（双乙酰）和2，3-戊二酮的总称，通常两者合称为双乙酰[1]，是啤酒发酵过程中酵母自身代谢产生的一种副产物。两者化学性质相似，但2，3-戊二酮在啤酒中的含量较少，对啤酒的风味影响不甚明显；而双乙酰对啤酒的风味影响较明显，其含量超过0.15 mg/L时，就会使啤酒出现一种令人不愉快的馊饭味，严重影响啤酒的风味和口感质量[2]，双乙酰的含量是衡量啤酒成熟、质量水平及风味的主要指标。研究结果表明：以双乙酰为代表的联二酮类化合物的生物合成是酵母缬氨酸（异亮氨酸）生物合成途径上的一个分支途径[3]，而形成双乙酰的直接前驱体物质是酵母合成缬氨酸的过程中所形成的α-乙酰乳酸以及合成异亮氨酸的过程中所形成的α-乙酰羟基丁酸[4,5]。 目前啤酒中双乙酰含量的测定方法有多种，但各有利弊。其中蒸馏浓缩法（即丁二酮肟法），可增加敏感性，但费时；用微量法（即气相色谱法或高相液相色谱法），省时，但需特殊的设备。具有一定的技术[6,7]；广谱法，敏感性强且简单，但这种方法受乙偶姻的影响。就目前研究测定方法来看，紫外分光光度法和EBC法是双乙酰测定最敏感、最简单的方法[8]，但这种方法也有不足之处。

随着现代生产工艺的进步，仅仅凭借检测发酵液的双乙酰含量来判断发酵过程是否正常，已远远不能满足生产工艺要求。这是由于啤酒中α-乙酰乳酸的氧化脱羧速度明显低于双乙酰还原为2，3-丁二醇的速度，在成熟发酵液中，往往会积累大量的双乙酰前体物质——α-乙酰乳酸和α-乙酰羟基丁酸，因此在灌装后成品酒中的双乙酰含量容易反弹，影响啤酒风味。因此，如何通过标准方法检测发酵过程中双乙酰以及双乙酰前体物质α-乙酰乳酸和α-乙酰羟基丁酸的含量（即总双乙酰，TVDK）来判断发酵过程是否正常，成为行业内的难题之一。发酵液（或啤酒）中双乙酰的前驱物（α-乙酰乳酸和α-乙酰羟基丁酸）在60 ℃下转换成双乙酰，然后，双乙酰从啤酒中被蒸馏出来，蒸馏物和邻苯二胺反应生成喹喔啉的衍生物，在酸化之后，反应物的含量通过分光光度计可测量，总双乙酰含量通过标准系数换算可得。 本实验分析了传统的检测发酵液中双乙酰（VDK）方法中存在的弊端，验证了发酵液中总双乙酰（TVDK）检测方法的可行性，分析不同浓度啤酒发酵液中TVDK含量的变化趋势，得出发酵液中TVDK的控制标准，丰富了啤酒发酵成熟度的评价体系。 1 材料与方法 1.1 材料、试剂与仪器 1.1.1 材料与试剂 样品：国内某啤酒集团原浓为18°P的啤酒大生产的发酵液；国内某啤酒集团原浓分

网络出版时间：2015-06-15 10:14网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20150615.1014.009.html 别为7、11、12、14、16、18°P的啤酒大生产的发酵液。 盐酸溶液（4 mol/L）：按照1:2的比例进行配制。取100 mL原盐酸溶液（12 mol/L），加入到已装有200 mL蒸馏水的容器中，混匀，静置片刻直到容器恢复至室温即可。注：必须是盐酸缓缓加入水中。 邻苯二胺：10 g/L，称取邻苯二胺0.1 g，溶于4 mol/L盐酸溶液中，并定容到10 mL，摇匀，放于暗处。此溶液须当天配制和使用；若配制出来的溶液呈红色，应重新更换新的。 双乙酰贮备液，5 g/L。用200 mL容量瓶称取1 g双乙酰原液，用超纯水定容到200 mL。溶液应贮存在棕色容量瓶中冷藏或者用黑袋子将无色容量瓶进行包裹冷藏，有效期：6个月。 双乙酰标准溶液，250 mg/L。移取5 mL双乙酰贮备液用超纯水定容到100 mL，有效期6个月。 1.1.2 仪器与设备 蒸馏装置：带有加热套管的双乙酰蒸馏器，适用于蒸馏100 mL样品；蒸汽发生器：2000 mL（或3000 mL）锥形瓶或平底蒸馏烧瓶；紫外分光光度计：岛津UV-2450 ，备有10 mm石英比色皿；容量瓶：25 mL、200 mL、100 mL；量筒：100 mL；具塞玻璃比色管：25 mL；夹锁瓶：500 mL双乙酰夹子。 1.2 实验方法 1.2.1 VDK蒸馏检测方法 参照国标GB/T 4928-2008中双乙酰的测定方法[9]。 1.2.2 TVDK蒸馏检测方法 （1）取样 取样时废液要排半桶以上才使样品具有代表性，取完样品应尽快放到冰箱里冷藏。 （2）样品前处理 ①过滤后啤酒：把经中速滤纸过滤后的啤酒装入夹锁瓶中，盖紧后，在60 ℃水浴中加热90min，然后放在20 ℃的恒温水浴锅中进行冷却。 ②发酵液：含有酵母的样本须经离心澄清（3000 r/min，10 min） 或过滤，在过滤纸上加入2±0.5 g硅藻土，过滤以清除酵母和二氧化碳。把过滤后的发酵液装入夹锁瓶盖紧后，在60℃的水浴中加热90 min，然后放在20 ℃的恒温水浴锅中进行冷却。 （3）蒸馏前期工作 蒸馏前应确认冷凝水有开，蒸馏瓶中的水不能超过2/3容量，也不能低于指定位置，而且应加入沸石或玻璃球以免暴沸伤人。 （4）预蒸馏 ①将双乙酰蒸馏器安装好，在蒸汽发生器中加入蒸馏水至指定位置，并开启冷凝水装置，加水至蒸馏管，并水封，密封蒸馏装置，加热蒸汽发生瓶至沸腾。 ②待蒸馏管中水沸腾后，将进行水蒸的水溶液排出蒸馏管外，先加1滴～2滴消泡剂于100 mL量筒中，加入100 mL恒温至20℃的熟啤酒溶液，进行预蒸馏，以确定好蒸馏的时间在8~10 min且电炉的火力控制得当。 （5）样品检验 ①用量筒量取100 mL冷却至室温左右的待测啤酒溶液或发酵液，加入到蒸馏管中，蒸馏样品并用量筒收集最初的馏出液25 mL，确保从第一滴馏出液馏出开始，中间过程加热蒸馏的时间至少6 min。 ②确保整个样品蒸馏时间在8~10 min，蒸馏后混匀溜出液。 ③吸取10 mL馏出液到一干燥试管中，加入0.5 mL邻苯二胺到试管中，摇匀，将混合物在暗处放置20 ~30 min。 ④加入2 mL盐酸溶液(4 mol/L)到反应混合液中并摇匀，以超纯水作空白在335 nm下测 吸光度A335。 （6）空白检验 ①在检验测定的同时平行做空白试验,用10 mL蒸馏水代替馏出液。 ②吸取10 mL蒸馏水到一干燥试管中，加入0.5 mL邻苯二胺到试管中，摇匀，将混合物在暗处放置20 ~ 30 min。 ③加入2 mL盐酸溶液(4 mol/L)到反应混合液中并摇匀，以超纯水作空白在335 nm下测吸光度Abl。 （7）校准 ①移液管吸取9.90 mL：蒸馏水到一干燥试管中，加0.10 mL双乙酰标准溶液混匀。 ②加入0.5 mL邻苯二胺到试管中，摇匀，将混合物在暗处放置20~30 min。 ③加入2 mL盐酸溶液(4mol/L)到反应混合液中并摇匀，以超纯水作空白在335 nm下测吸光度Ast。 （8）总联二酮含量(mg/L)计算公式：

（1-1） 式中： TVDK——试样的总双乙酰含量，mg/L； A335——试样在波长335 nm下，用10 mm石英比色皿测得的样品检验的吸光度；

Abl——蒸馏水在波长335 nm下，用10 mm石英比色皿测得的空白检验的吸光度；

Ast——标准溶液在波长335 nm下，用10 mm石英比色皿测得的校准的吸光度；

0.625——标准品中双乙酰含量，mg/L。 所得结果应表示至整数，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。如果分母(Ast - Abl)偏离0.230±0.030,则通过重新制备新的双乙酰蒸馏液来调查原因。 2 结果与分析 2.1 现有啤酒发酵成熟度评价方法 啤酒口味不成熟是由于在主发酵期间，酵母代谢产生影响啤酒风味的某些代谢物质没有排除到人们能够接受的程度。在众多影响啤酒风味成熟的物质中，双乙酰是关键，其被认为是衡量啤酒成熟与否的决定性指标[10]。国标GB/T 4928-2008规定了啤酒中双乙酰的检测方法，即用蒸汽将双乙酰蒸馏出来，与联苯二胺反应，生成2，3-二甲基喹喔啉，在波长335 nm下测其吸光度，双乙酰的含量通过如下公式计算出来：

（2-1） 式中：X5——试样的双乙酰含量，mg/L；

A335——试样在波长335 nm下，用10 mm石英比色皿测得的吸光度；

2.4——用10 mm石英比色皿时，吸光度与双乙酰含量的换算系数。若使用20 mm石英比色皿时，此时换算系数是1.2。 为了了解啤酒的成熟情况，发酵液中的双乙酰含量也是啤酒酿造工业中必要的检测指标。现阶段发酵液中双乙酰的检测依然运用了啤酒中双乙酰检测的方法，即国标GB/T 4928-2008中双乙酰蒸馏比色的检测方法。 国标中对双乙酰控制标准的规定是一级啤酒双乙酰含量≤0.15 mg/L，优级啤酒双乙酰含量≤0.10 mg/L[11]。国内大部分啤酒厂均控制双乙酰含量在0.07 mg/L，以保证啤酒的正常发酵。 2.2 评价啤酒发酵成熟度现有方法存在的问题