植物组织培养中的褐变问题

植物组织培养中的褐变问题
褐化是指在组培过程中，培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也随之慢慢变褐而死亡的现象。

一、材料为什么会褐化？
（一）、酶促褐化
酶促褐化是在有氧条件下，酚酶催化酚类物质形成醌及其聚合物的反应过程。

组培材料之所以会褐化是因为有些植物（特别是木本植物）体内含有较多的酚类化合物和多酚氧化酶。

在正常结构完整的细胞中，酚类化合物与多酚氧化酶是分隔存在的，因此比较稳定。

当外植体被切割后，切口附近细胞结构的完整性受到破坏。

酚类化合物和多酚氧化酶的分隔效应被打破，酚类化合物和多酚氧化酶便流出，多酚氧化酶氧化酚类化合物而成为褐色的醌类物质和水。

醌类又会在酪氨酸酶等酶的作用下，使外植体的蛋白质聚合，生长停顿，最终导致死亡。

（二）、非酶促反应
非酶促褐化是指酚类等物质在非酶促条件下被氧化而发生显著颜色变化、趋向加深的现象。

其主要是受到环境胁迫所致。

二、引起褐化的主要因素
（一）基因型
木本植物一般比草本植物容易发生褐变，因为木本植物的单宁或色素含量较高，而酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体，所以木本植物易褐变。

例如核桃单宁含量很高，组培难度大，即使形成愈伤组织还会因褐变而死亡。

另外同一植物的不同品系褐变程度也不一样，例如在进行苹果茎尖培养时，不同品种之间褐化的程度不一样，品种“金冠”较轻，而“舞美”则很高。

对葡萄等其他作物的研究也发现类似情况。

此外本身色素含量高的植物组培时也容易褐化。

（二）外植体生理状态
一般来讲，随着年龄和组织木质化程度增加而褐变加强。

如在欧洲栗的培养中，幼年型的外植体培养含醌类物质少，而用成年型材料培养时含醌类物质多。

在卡德利亚兰的培养中，较短的新生茎致褐物质含量高，而较长的新生茎致褐物质含量低。

另外，不同生长季节取材的培养成功率也不同。

王续衍等（1988）对24个苹果品种进行茎尖培养时，发现冬春季取材褐变死亡率低，其他季节取材较重。

外植体大小会影响褐变，例如，用油棕幼嫩外植体（胚）培养较少褐变，而用高度分化的叶片接种后，则褐变。

受伤程度大小也影响褐变。

为了减轻褐变，切取外植体尽可能减少伤口面积，切口尽可能平整些。

外植体的老化程度越高，其木质素的含量也越高，也就越容易褐变，成龄材料一般均比幼龄材料褐化严重。

平吉成用小金海棠、八楞海棠、山定子刚长成的实生苗切取茎尖培养，接种后褐变很轻，随着苗龄的增长，褐变逐步加重，取自成龄树上的茎尖褐变就更加严重。

幼龄材料褐变轻与其酚类化合物含量少有关，Chever分析欧洲粟的酚类含量变化也发现，幼嫩材料酚类化合物含量少，而成
龄材料比较多。

外植体大小对褐变的影响，表现为小的材料更容易发生褐化，相对较大的材料则褐变较轻，在多个苹果品种上进行试验表明：用5～l0mm的茎尖培养效果较好。

另外，切口越大，酚类物质的被氧化面也越大，褐化程度就会更严重。

因此外植体的受伤程度对褐化的产生具有明显的影响，伤口加剧褐化的发生。

仙客来小叶诱导时，整片叶子接种较分成多块褐化要轻，除机械损伤外，各种消毒用的化学试剂对外植体的伤害也会引起褐化，酒精消毒对外植体的伤害比较重，较易引起材料死亡；对于不易褐化的种类，用氯化汞消毒后，一般不会引起褐化，若用次氯酸钠进行消毒，则很容易引起褐化的发生，而且消毒效果不如氯化汞。

（三）取材时间和部位
由于植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶的活性在不同的生长季节并不相同，一般在生长季节含有较多的酚类化合物。

有人在苹果、核桃上试验证明：冬春季取材褐变死亡率最低，在夏季时取材更容易被氧化褐变。

在取材部位上存在幼嫩茎尖较其他部位褐化程度低的现象，木质化程度高的节段在进行药剂消毒处后褐化现象更严重。

另一些种类如蝴蝶兰、香蕉等随着培养时间的延长，褐化程度会加剧，甚至在超过一定时间不进行转瓶继代，褐化物的积累还会引起培养材料的死亡。

（四）外植体培养条件
如从田间自然光照下植株取苹果、桃、葡萄等的茎尖，接种后容易褐变；如事先
对母株或枝条遮光处理，之后再切取外植体，则减少褐变，因为酚类化合物合成和氧化过程中，有一部分酶系统的活性是受光诱导的。

此外，光照促进组培中酚的氧化，光照条件对巨桉叶片渗出物形成的影响从低到高为：黑暗、漫射光、短日照、长日照。

因此，在黑暗或低光照培养一段时间能减轻褐变。

在采取外植体前，如果将材料或母株枝条进行遮光处理，然后再切取外植体培养，能够有效地抑制褐化的发生。

将接种后的初代培养材料在黑暗条件下培养，对抑制褐化发生也有一定的效果，但不如在接种前处理有效。

无光抑制褐化的原因是由于在氧化过程中，许多反应受酶系统控制，而酶系统活性受光照影响。

应该注意，暗培养时间过长会降低外植体的生活能力，甚至引起死亡，应该通过试验摸索出适宜的时间。

温度对褐变有很大的影响，卡特兰在15-25℃培养比在25℃以上褐变轻；苹果和桃的茎尖培养也是低温抑制褐变。

Ishii等发现在15～25℃下培养卡特兰比在25℃以上时褐化要轻，Hildebrandt和Hamey在培养天竺葵茎尖的过程中，不仅发现7℃以下培养比在17℃和27℃下褐化变轻，而且还证明了高温能促进酚氧化，而低温可抑制酚类化台物氧化，降低多酚氧化酶的活性，从而碱轻褐化。

王明华等在褐化严重的苹果品种上也证明了低温有抑制褐化的作用。

（五）培养基
许多试验表明，液体培养基有效地克服外植体褐变，液体培养基再加上滤纸桥，效果就更好。

因为外植体溢出的有毒物质很快扩散到液体培养基中，对外植体危害较轻。

在初代培养时，培养基中无机盐浓度过高，会引起酚类物质大量产生，导致褐变；降低盐浓度可减少酚类外溢，减轻褐变。

生长调节剂是影响褐变的主要原因，6－苄氨基腺嘌呤或激动素不仅促进酚类化合物合成，而且刺激多酚氧化酶的活性，增加褐变；而生长素类如2，4-D和NAA 可延缓多酚合成，减轻褐变。

在培养基中加入抗氧化剂可改变外植体周围的氧化还原电势，从而抑制酚类氧化，减轻褐变。

目前应用的抗氧化剂有硫代硫酸钠、苏糖二硫醇、抗坏血酸、间苯二酚等。

同一种药剂在不同培养基中效果不一样，抗氧化剂在液体培养中比在固体培养基中效果更好。

活性炭和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是吸附剂，可以吸附外植体周围的有毒物质；活性炭还可一定程度的降低光照强度，减轻褐变。

三、预防褐化的措施
（一）选择适宜的外植体和培养条件
大量研究表明，选择适当的外植体和培养条件是克服褐变的最主要手段。

通常外植体应有较强的分生能力，在最适宜的细胞脱分化和再分化培养条件下，使外植体处于旺盛的生长状态，便可大大减轻褐变。

适宜的温度和在全黑暗条件下进行培养也可显著减小外植体的褐变。

据报道，如在芽初始培养的1-6周内，用黑暗培养或光强度在150Lx可抑制外植体的酚类氧化。

对于易褐变的材料，接种后转瓶时间长，伤口周围积累的醌类物质增多，则褐变加重；而缩短转瓶周期常常可减轻褐变。

如在山月桂树的茎尖培养中，接种后12-24h，便转入液体培养基中，在此之后的一周内，每天转一次瓶，外植体褐变可得到完全控制。

（二）加入抗氧化剂
在组织培养中，加入一些氧化剂或用抗氧化剂进行材料（外植体）的预处理或预培养，可大大减轻醌类物质的毒害。

这些抗氧化剂包括：VC、柠檬酸、硫代硫酸钠（Na2S2O3）等。

在倒挂金钟茎尖培养中加入0.01％PVP对褐变有抑制作用，而用0.7％PVP，0.28mol·L－1抗坏血酸，双氧水（5％）一起加入到0.58 mol·L －1蔗糖溶液中振荡45min，对褐变有明显抑制作用。

而在卡特利亚兰茎尖培养中，将5mmol·L－1氰化钾、抗坏血酸、半胱氨酸和硫脲加入到液体培养基中，对多酚氧化酶的活性有明显的抑制作用。

在静止的液体培养中加入抗氧化剂比在固体培养基中加入的效果要明显的多。

此外，0.1％-0.5％活性炭对吸附酚类氧化物的效果也很明显。