GE蛋白质纯化

AKTA蛋白纯化系统操作

AKTA蛋白纯化系统操作 AKTA蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高。AKTA系统依据不同的配置，可以分为AKTA EXPLORER、AKTA PILOT、AKTA PURIFIER等多种型号的设备。以下以AKTA EXPLORER为例简单介绍AKTA蛋白纯化系统的一般操作。 1、认识AKTA。 AKTA explorer 是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。该色谱系统的分离装置有三个主要组件，在底部平台的左侧整齐堆起（Fig 1）。它们是： FIG 1、AKTA EXPLORER主机 ? Pump-900 为双通道高效梯度泵系列。在AKTAexplorer 100，流速范围0.01-100 ml/min，压力高达10 Mpa（泵名为P-901）。在AKTA explore10，流速范围0.001-10 ml/min，压力高达25 Mpa（泵名为P-903）。 ? Monitor UV-900，同时监控190－700 nm 范围内高达3 个波长的多波长紫外-可见（UV-Vis）监测器。（针对部分AKTA PURIFIER机型，尚有UPC-900监测器可供选择，光源为汞灯光源，一次可以监控一个波长，安装滤光片后，可以在选择的波长范围内进行切换。）? Monitor pH/C-900，在线电导和pH 监测的组合监测器。 Fig 2、AKTA EXPLORER硬件模式图

AKTA EXPLORER系统的主要组成部件可以用模式图表示（Fig 2）。组成部件，如混合器、柱及不同的阀安装在右边部分。打开装阀的门可全部看到。柱被挂在装阀的门的外侧。分离装置由UNICORN 软件控制。软件安装于一独立的电脑主机之中，在电脑与色谱系统之间的通信由数据采集装置CU950进行控制。 2、一般操作 2.1 开机按位于底部平台前左侧的ON/OFF 按钮，打开色谱系统，然后打开电脑电源。待仪器自检完毕（CU950上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁）。双击桌面上UNICORN图标，进入操作界面。UNICORN的操作界面分为四个窗口（Fig 3） Fig 3、Unicorn的操作界面 2.2准备工作溶液和样品所有的工作溶液和样品必须经过0.45μm的滤膜过滤，样品也可高速离心后取上清备用。当缓冲液中含有有机溶剂（如乙腈、甲醇），需在使用前用低频超声脱气10min。 2.3清洗及管道准备首先将A泵的进液管道（A1）放入缓冲液或平衡液中，将B泵的进液管道(B1)放入高盐溶液中，在system control窗口点击工具栏内的manual，选择pump→pump wash explorer，选中A1,B1管道为ON，execute。泵清洗将自动结束。(Fig 4) Fig 4、AKTA Explorer的泵清洗操作 2.4安装层析柱

GE NOVAGEN 镍柱纯化系统流程

蛋白纯化系统操作流程一、蛋白的诱导：蛋白原核表达 1、取菌种接种于含Amp LB固体培养基中（分区划线），37℃培养过夜； 2、挑取单克隆接种于5ml含Amp LB液体培养基中，37℃振摇过夜； 3、从过夜培养物中取2ml接种于100ml Amp LB液体培养基中，振摇2h（留样1ml）； 4、加入一定终浓度IPTG，37℃诱导表达4h（留样1ml），离心，弃上清收集细菌。存入4℃。二、蛋白表达状态分析（可溶性or包涵体表达）取少量（1ml）诱导菌体沉淀，加入不含变性剂（如盐酸胍，尿素等）PBS（150μl），超声裂解。分离上清和沉淀，分别SDS-PAGE电泳。三、蛋白的纯化纯化前准备 1.推荐在中性至弱碱性条件下（pH 7-8）结合重组蛋白。磷酸盐buffer是常用的缓冲液， Tric-Cl在一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度。 2.避免在buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂 3.若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有的buffer中添加6 M 盐酸胍或8 M 尿素注： 1.包含尿素的样品可直接进行SDS-PAGE分析，若样品中包含盐酸胍，在SDS-PAGE前则需先用含有尿素的buffer进行透析 2.除利用咪唑洗脱蛋白，其它方法，如低pH 值法等可被应用，详见说明书 Bingding buffer 中咪唑的浓度在洗涤时所用的Bingding buffer 中咪唑浓度越大，重组蛋白纯度越高。但过高的咪唑浓度将导致蛋白的洗脱。合适的咪唑浓度需要优化。 Buffer 的准备

所用的水及化学物质须是高纯度的。Buffer 在使用前需经0.45 μm滤膜过滤所用高纯度的咪唑需在280nm 处无吸光度或吸光度极低推荐buffer Bingding buffer：20 mM 磷酸盐 0.5 M NaCl 20- 40 mM 咪唑pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）Elution buffer ：20 mM 磷酸盐 0.5 M NaCl 500 mM 咪唑pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）样品准备样品需被充分溶解。过柱前经0.45 μm滤膜过滤。样品以pH 7.4 binding buffer 溶解。勿用强酸强碱调节pH 值，否则将可能导致沉淀。重力纯化法Ni-NTA Column 准备 1. 温和地颠倒瓶中的Ni-NTA Agarose 数次。 2. 吸取2ml的树脂加入15ml离心管中，使树脂在重力(5–10 minutes)或低速离心(5 minute at 500 × g)，轻柔的吸出上清。 3. 加入5ml的无菌蒸馏水，温和的颠倒柱子3min，离心5 minute at 500 × g，轻柔的吸出上清。 4. 用bingding buffer 重复第3步。 5. 在Ni 柱中加入等体积的bingding buffer，制成50%的slurry 样品与Ni 柱结合 1.每1ml 50%的slurry中加入4ml 的样品。1ml 50%的slurry 可结合20mg His-蛋白 2.将混合物室温，低速振荡孵育1h Buffer 洗涤及洗脱 1.离心5 minute at 500 × g，轻柔的吸出上清。上清保存放在4℃for SDS-PAGE

蛋白纯化系统Biologic-LP使用说明

蛋白纯化系统Biologic-LP使用说明 Biologic-LP是蛋白质层析纯化系统, 其原理是利用不同蛋白分子所具有的特性（如等电点、分子量及亲水或疏水性）与层析柱中的介质产生的吸附作用后，再用相应的洗脱液来对吸附在层析柱上的蛋白进行洗脱。根据目标蛋白及不同层析柱介质的特性，设计相应的洗脱程序可以使目标蛋白与其他杂蛋白先后从层析柱上洗脱下来。通过观察紫外光的吸收峰，可分别收集不同时段洗脱下来的蛋白液。蛋白混合物通过这样的程序可被分离至单个蛋白。通常分布在混合物中的目标蛋白需要通过组合而不是单一的层析路线来进行分离操作。常规的分离路线如通过疏水层析—离子交换—疏水层析的技术路线来有效分离目标蛋白。本层析系统使用主要分为三个部分。首先在使用前确认分离的技术路线和使用的层析柱。其次根据层析柱使用的要求配制相关试剂和确定层析过程的参数。最后通过层析操作分离纯化目标蛋白，并清洗层析柱和管道以确保仪器能长期有效使用。一设计蛋白的纯化路线及选择不同的层析柱及层析方法根据目标蛋白的特性及来源，设计纯化的路线并确定每一步操作所需要的层析柱及层析方法。根据不同层析方法的要求，准备蛋白样品及洗脱液及洗脱方式（如线形洗脱或梯度洗脱）。而后确认层析操作中的主要参数。

二层析系统的操作以下是对所有层析操作中共同的步骤进行的描述。特别注意的是不同的分离方式如离子交换和疏水层析它们的原理和参数设置完全不同。这里仅就相同的操作进行描述，具体的参数设置见使用说明书并咨询负责本仪器的老师，切不可擅自操作，以免破坏仪器。 1、确定目标蛋白层析柱的选择，不同的分离方式选择不同的层析柱。 2、样品制备。根据层析柱介质对蛋白样品的要求，制备样品和洗脱液。所有用于层析的溶液及样品均要通过0.45μm膜过滤，以免堵塞层析柱。 3、打开层析仪电源，按照显示屏的提示，分别设置好A液、B液、流速、时间等相关参数，并将接样管插入接样仪。 4、打开电脑及Biologic-LP Data View软件，观察层析过程是否正常或是否需要调整，做好接样前的准备。三、层析系统的维护操作结束后，按仪器使用说明，清洗层析柱及管道，将层析柱保存好，备用。特别注意不同的层析柱要求的清洗方式不同，对管道的清洗也不同，层析柱的保存方式也不同。清洗和保存时一定要按照使用说明书的要求进行操作，不能出现错误以免对层析系统造成破坏。

蛋白纯化系统技术指标

技术标部分仪器名称：蛋白纯化系统数量：1套原装进口设备用途：适用于实验室从分析、小规模制备，到中试规模的工艺摸索和制备，可通过凝胶过滤、离子交换、亲和层析、羟基磷灰石、疏水层析等层析谱技术，进行蛋白质、肽类、多糖、核酸等生物大分子和中草药与天然产物活性成分的分离、纯化和制备。技术指标： 1.原装进口产品 2. 系统泵 *全自动柱塞泵，双泵四泵头，每个泵头都有独立除气阀 *单泵流速：0.001-10 ml/min 最大流速：20 ml/min 流速准确度：±2%，流速精度：RSD＜0.5% 梯度精度: ±＜0.8%，流速范围：0. 25-10 ml/min 具备恒压调速功能 3. 紫外检测器 *检测范围：0 - 3AU *线性：±2% 光源和流动池分开设计，避免光源过热对样品的影响 4. 电导检测 *检测范围：0.01 mS/cm－999 mS/cm 电导精确度：±0.01 mS/cm，实时自动检测 5. 温度检测 *温度范围：0 - 99 C 温度准确度：±1.5°C 6. 阀门自动进样阀：1个，自动切换上样、进样和冲洗三个状态出口阀组件：1个自动柱位选择阀：1个，无需改变管路连接即可实现旁路及正反向洗脱功能 7. 组分收集器收集方式：可根据体积、峰或时间自动收集收集数目：≥100个收集范围：0.1ml-50ml 具有滴感应器，防滴漏功能

流路：PEEK惰性材料（以保持蛋白活性）耐受有机溶剂 8. 软件流路实时在现，实时监控和控制内置层析柱和凝胶信息具有自动积分、一键积分功能，操作简单，可打印结果报告 9. 配件上样环：500um，1ml，5ml各一个预装柱，包含His标签亲和介质等 PH计 10. 配套电脑参数 4核处理器、内存8 GB，独立显卡4G显存、硬盘1 TB，可刻录光驱，24寸的高清显示器 11. 技术支持技术人员和甲方人员一起设计教学实验，并定期参与相关实验课程

蛋白纯化AKTA操作说明#(优选.)

AKTA pure操作说明分子筛层析操作步骤： 1. 开机：打开AKTA pure开关，看指示灯，泵同步（泵内有注入液体的声音）。 2. 打开系统：打开电脑：双击Unicorn 7.0打开系统，进入log on 界面，用户名默认为Default，输入密码：default，点ok键，出现提示对话框，继续点确定，进入系统。注意：进入系统时会弹出三个界面：System Control界面，Evaluation界面和Administration界面。其中system Control界面为主操作窗口，所有的设置选项都是在该界面下完成：Manual---Execute Manual instructions---......；Evaluation界面为结果数据查看及处理窗口；Administration界面为Unicorn 7.0系统设置界面。 3. 洗泵：把A1泵头从20%乙醇中取出，用去离子水冲洗，放入分子筛缓冲液中，在System Control界面下，点击manual---Execute Manual instructions---Pumps---Pump A wash---点开inlet，选择A1---Excuse。 4. 设置系统参数：设柱压：Alams---alam systerm pressure---high alam---设置柱压---Execute；设流速：Pumps---System flow ---设置system flow（1mL/min）---Execute。注意：流速和柱压设置参照“GE蛋白纯化柱表”，不要超出最高限制。 5. 装柱子(先上后下)：接柱子的上面：拧下连接进样阀和检测器之间的线，等进样阀出口有液体流出时，拧开柱上面线头的螺帽，将它连到进样阀出口；接柱子的下面：去掉柱下端连接的注射器，连上接头，连上一段线，待液体滴出滴出液体滴到检测器上的连接口的洞里，滴满，将接头连到检测器的连接口里。 6.平衡柱子：分子筛buffer平衡柱子，一般要两个小时左右，盐离子浓度达到5.5%左右。 7.设置系统及收集参数：命名：先end---Manual instructions，点击browse，弹出select result name&location 界面，点开文件夹“defaultHome”，找到文件夹“labdata”，点开，选择自己名字首字母缩写文件夹(已创建)，在界面下方“name”指令框进行命名。注意：命名时要标明日期，柱子型号，样品名称。设流速：Pumps---System flow---设流速（1 mL/min）---Execute；设柱压：Alams--- alam systerm pressure---high alam---设置柱压---点击Execute；洗A泵：Pumps---Pump A wash---点开inlet，选择A1---Excuse；紫外调零：Monitors---Auto zero UV---Execute；

AKTAavant25全自动工艺开发蛋白纯化系统参数(精)

AKTAavant25全自动工艺开发蛋白纯化系统 1. 工作条件 1电力供应:单相220V±10%,50 Hz (±1 2工作温度:4?C - 35?C 3相对湿度:20 - 95%,没有冷凝水 4仪器运行的持久性:仪器可连续正常运行。 5工作条件及安全性要求符合中国及国际有关标准或规定。 2. 设备用途及功能快速纯化多种生物分子,如蛋白质、多糖、肽类、寡核苷酸、核苷酸疫苗及病毒等,适合分离纯化活性物质。其自动化的配置尤其适合方法优化和工艺开发。 1简单迅速启动:预编应用工艺,编程模板,自动缓冲液制备。 2全自动操作:从进样、编程、分离、峰收集、准确结果比较、数据处理以至打印报告皆自动化。 3标配多种自动化配置:自动选择缓冲液、自动选择样品、自动选择柱位、自动选择收集位置和收集方式,便于方法优化和工艺开发。 4人工智能:多种缓冲液配方(内置26种配方,可自行添加,一百多根层析柱数据库,多种纯化方案,内置层析专家。 5整合专业的Design of Experiment 实验设计理念,推荐实验方案,进行数据分析,模型建立,为条件优化提供系统的建议。

6高效率功能:蛋白纯化量微克级以至百毫克级。 3. 技术规格 I. 系统泵及样品泵 1.1 系统泵 1.1.1 精确的全自动微量柱塞泵,双泵四泵头,每个泵头都有独立除气阀。*1.1.2 流速:0.001–25ml/min 1.1.3 压力范围:0–20 MPa (200bar,2900psi *1.1.4 流速重复性:条件:0.25–25 ml/min, < 3 MPa, 0.8–2 cP 流速准确度:±1.2%,流速精度:RSD<0.5% 1.1.5 增量:1ul/min 1.1.6 粘度:0.35–10 cP *1.1.7 具备恒压调速功能,自动根据压力调节流速输出,使压力保持稳定。 1.2 样品泵 1.2.1 精确的全自动微量柱塞泵,单泵两泵头,每个泵头都有独立除气阀。 1.2.2 流速:0.01-25ml/min 1.2.3 压力范围:0-10Ma (100bar,1450psi *1.2.4 流速重复性:条件:0.25–25 ml/min, < 3 MPa, 0.8–2 cP 流速准确度:±2%,流速精度:RSD<0.5% 1.2.5 粘度:0.7–10 cP

蛋白纯化系统学习资料

亲和层析谱柱一、定义亲和层析：利用共价连接有特异配体的层析介质，分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白质或其他分子的层析技术二、原理分析将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。步骤：1、固定吸附剂放置在层析柱 2、与吸附剂具有亲和能力的蛋白质滞留在层析柱 3、用洗脱液将结合的蛋白质洗脱下来亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。此法具有高效、快速、简便等优点。种类：（1）抗原和相应的抗体发生特异性结合（2）酶与底物的识别结合（3）受体与配体的识别结合三、载体要求理想的载体应具有下列基本条件： ①不溶于水，但高度亲水； ②惰性物质，非特异性吸附少； ③具有相当量的化学基团可供活化； ④理化性质稳定； ⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速； ⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过； ⑦能抵抗微生物和醇的作用。可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙烯酰胺凝胶是优良载体。

蛋白质分离纯化的一般程序解析

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。（四）样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品纯化方案是由几种纯化方法组成的，一般选择的依据是从抽提液中有效成分和

AKTA蛋白纯化系统操作

AKＴA蛋白纯化系统操作 AKＴA蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高。AKTＡ系统依据不同的配置,可以分为AKTＡEＸPＬOＲER、?ＡKTA PILOT、AＫＴA ＰURIFIER等多种型号的设备。以下以AKＴA EXPLORER为例简单介绍?AKTA蛋白纯化系统的一般操作。１、认识AKTA。 AKTA explorer是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。该色谱系统的分离装置有三个主要组件，在底部平台的左侧整齐堆起（Fig 1）。它们是： FＩG 1、AKTA EＸＰLORER主机 ? Pumｐ-900 为双通道高效梯度泵系列。在ＡKTAexｐloｒer１００,流速范围０．01－100mｌ/min，压力高达10 Mpa(泵名为P-90１）。在AＫＴA exｐｌｏｒｅ10,流速范围０.０01－10 mｌ/ｍｉn，压力高达25 Mpａ(泵名为P-903)。 ?ＭonitoｒUV-900,同时监控190－700 nｍ范围内高达3 个波长的多波长紫外-可见(UV－Vis）监测器。（针对部分AKTA PURIＦIER机型,尚有UＰＣ-９00监测器可供选择，光源为汞灯光源，一次可以监控一个波长，安装滤光片后，可以在选择的波长范围内进行切换。) ? MｏniｔoｒpＨ／C-900，在线电导和pＨ监测的组合监测器。 Fｉg ２、ＡKＴA EXPＬORER硬件模式图

AKTAＥXＰLOＲEＲ系统的主要组成部件可以用模式图表示(Fig2)。组成部件,如混合器、柱及不同的阀安装在右边部分。打开装阀的门可全部看到。柱被挂在装阀的门的外侧。分离装置由UNICOＲN 软件控制。软件安装于一独立的电脑主机之中，在电脑与色谱系统之间的通信由数据采集装置CＵ950进行控制。 2、一般操作２.1 开机按位于底部平台前左侧的ON/OFＦ按钮，打开色谱系统,然后打开电脑电源。待仪器自检完毕（CU９50上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁）。双击桌面上ＵNＩCORＮ图标，进入操作界面。UNICORN的操作界面分为四个窗口(Fig 3）Ｆｉg 3、Unicoｒn的操作界面 2.2准备工作溶液和样品所有的工作溶液和样品必须经过０.45μm的滤膜过滤,样品也可高速离心后取上清备用。当缓冲液中含有有机溶剂(如乙腈、甲醇),需在使用前用低频超声脱气10ｍin。 2.3清洗及管道准备首先将Ａ泵的进液管道（A１)放入缓冲液或平衡液中，将Ｂ泵的进液管道(Ｂ1)放入高盐溶液中,在systｅm controｌ窗口点击工具栏内的manual，选择pump→pumｐwash ｅxｐlorer，选中Ａ１，B1管道为ON，eｘｅcute。泵清洗将自动结束。(Fiｇ4) Fｉg 4、AKTA Explｏｒer的泵清洗操作 2.4安装层析柱

蛋白质纯化仪的使用 (1)资料

蛋白质纯化仪使用说明 1.认识机器本机器常规流程图：使用机器前所有端口请按如图所示连接，将“A 泵溶液进口线”“B 泵溶液进口线”放进超纯水中。按如图所示先不要连接柱子。建议一般使用A 泵进液，如需梯度洗脱时才用B 泵。 ***除上样样品（14000 rpm/12000 rpm 离心30min ）外，所有在此机器上要用的溶液必须要经过0.22 μm 滤膜过滤。*** 样品泵 A 泵 B 泵多波长检测器 pH 计混合池层析柱切换阀进样环溶液由A/B 泵进入仪器进样阀层析柱切换阀多波长检测处自动收集器废液出口 A 泵溶液进口线 B 泵溶液进口线整合电导检测

2.开机打开计算机、蛋白质纯化仪（电源在右侧下角）、自动收集器（电源在后面右侧）。此时蛋白质纯化仪上部分指示灯会亮，有黄色的、有蓝色的，开机较慢，请稍等，当蛋白质纯化仪上所有指示灯不亮时，才可进行操作。 3.启动电脑“ChromLab”软件双击电脑“ChromLab”应用程序，进入如下界面： 4.洗泵单击“Manual Run”进入：我们主要看右下方这块（图中所示模块均可双击设置参数）：双击“样品泵”模块出现如图所示对话框：

双击“层析柱切换阀”模块如下图所示：此步骤主要是洗泵工作，请确保层析柱不在程序中，点击“Bypass ” 点击此处可让可更改溶液的流动方向。点击1-5可设置连接不同的层析柱端口设置流速设置压力，小于选择的柱子承受最大压力。在下面“控制流速以防止超压”前面打对勾，以保护柱子。不特殊设置，默认A 泵工作此处可控制机器的运行与停止。

蛋白纯化的基本思路

蛋白质的提取和纯化--选择分离材料及预处理蛋白质的提取和纯化--选择分离材料及预处理以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。细胞的破碎 1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物脏组织、植物肉质种子等。 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。 4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

AK蛋白纯化系统操作精选文档

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AKTA蛋白纯化系统操作 AKTA蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高。AKTA系统依据不同的配置，可以分为AKTA EXPLORER、AKTA PILOT、AKTA PURIFIER等多种型号的设备。以下以AKTA EXPLORER为例简单介绍AKTA蛋白纯化系统的一般操作。 1、认识AKTA。 AKTA explorer 是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。该色谱系统的分离装置有三个主要组件，在底部平台的左侧整齐堆起（Fig 1）。它们是： FIG 1、AKTA EXPLORER主机 Pump-900 为双通道高效梯度泵系列。在AKTAexplorer 100，流速范围0.01-100 ml/min，压力高达10 Mpa（泵名为P-901）。在AKTA explore10，流速范围0.001-10 ml/min，压力高达25 Mpa（泵名为P-903）。 Monitor UV-900，同时监控190－700 nm 范围内高达3 个波长的多波长紫外-可见（UV-Vis）监测器。（针对部分AKTA PURIFIER机型，尚有UPC-900监测器可供选择，光源为汞灯光源，一次可以监控一个波长，安装滤光片后，可以在选择的波长范围内进行切换。） Monitor pH/C-900，在线电导和pH 监测的组合监测器。 Fig 2、AKTA EXPLORER硬件模式图

AKTA蛋白纯化系统操作

AKTA蛋白纯化系统操作ＡKＴA蛋白纯化系统就是当前蛋白纯化工作经常用到得一组设备,自动化程度很高。ＡKＴA 系统依据不同得配置，可以分为AKＴＡEＸPLORER、ＡKTA PILＯT、AＫTA PURIFIER等多种型号得设备。以下以AKTA EＸPLＯRER为例简单介绍AＫＴＡ蛋白纯化系统得一般操作。 1、认识ＡＫTＡ. AＫTA eｘｐlorer 就是为方法开拓及研究应用而设计得全自动液相色谱系统。该色谱系统得分离装置有三个主要组件,在底部平台得左侧整齐堆起(Ｆig 1)。它们就是: ＦIG1、AKTA EXＰLORＥＲ主机 ?Ｐump-900为双通道高效梯度泵系列．在AKＴAexplorｅr 100,流速范围0、０1-100 ｍl/min，压力高达10Mpa(泵名为P-9０１）.在ＡKTA ｅxplore１0,流速范围０、０0１－10 mｌ/mｉn,压力高达2５Mpa(泵名为P－９0３）. ? MoｎiｔｏｒUＶ—９00,同时监控１90－7０0 nm 范围内高达３个波长得多波长紫外-可见(UＶ-Vis)监测器。（针对部分AＫTA ＰＵＲIFIEＲ机型,尚有ＵＰC—900监测器可供选择,光源为汞灯光源,一次可以监控一个波长,安装滤光片后，可以在选择得波长范围内进行切换.) ? Moniｔor ｐH／Ｃ-9００，在线电导与pH 监测得组合监测器.

Fｉg 2、AKTA ＥＸPLORER硬件模式图 AKTA EXPＬORER系统得主要组成部件可以用模式图表示(Fiｇ2）.组成部件,如混合器、柱及不同得阀安装在右边部分。打开装阀得门可全部瞧到．柱被挂在装阀得门得外侧。分离装置由ＵNＩCOＲN 软件控制。软件安装于一独立得电脑主机之中,在电脑与色谱系统之间得通信由数据采集装置CＵ９５0进行控制． 2、一般操作２、1 开机按位于底部平台前左侧得OＮ／ＯFＦ按钮,打开色谱系统，然后打开电脑电源.待仪器自检完毕（CU950上面得３个指示灯完全点亮并不闪烁)。双击桌面上UNICOＲN图标,进入操作界面。UNIＣＯRＮ得操作界面分为四个窗口(Ｆig3) Fig 3、Ｕｎｉｃoｒn得操作界面 2.2准备工作溶液与样品所有得工作溶液与样品必须经过０、45μm得滤膜过滤,样品也可高速离心后取上清备用。当缓冲液中含有有机溶剂(如乙腈、甲醇),需在使用前用低频超声脱气10mｉn。 2.3清洗及管道准备首先将Ａ泵得进液管道（A1)放入缓冲液或平衡液中，将B泵得进液管道(B1）放入高盐溶液中，在syｓtem ｃｏｎtｒｏl窗口点击工具栏内得mａｎuａl,选择pｕmp→ｐump wａsh explorer,选中A１,B1管道为OＮ，executｅ。泵清洗将自动结束.（Fｉg 4） Fig 4、ＡＫTA Explorｅr得泵清洗操作 2、4安装层析柱在ｍanｕal里选择puｍp→ｆlow rate,输入一定得低流速(Ｆig ５),iｎsert;选择Alａ

AKTA蛋白纯化系统操作教学提纲

A K T A蛋白纯化系统操作

? Monitor pH/C-900，在线电导和pH 监测的组合监测器。 Fig 2、AKTA EXPLORER硬件模式图 AKTA EXPLORER系统的主要组成部件可以用模式图表示（Fig 2）。组成部件，如混合器、柱及不同的阀安装在右边部分。打开装阀的门可全部看到。柱被挂在装阀的门的外侧。分离装置由UNICORN 软件控制。软件安装于一独立的电脑主机之中，在电脑与色谱系统之间的通信由数据采集装置CU950进行控制。 2、一般操作 2.1 开机按位于底部平台前左侧的ON/OFF 按钮，打开色谱系统，然后打开电脑电源。待仪器自检完毕（CU950上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁）。双击桌面上UNICORN图标，进入操作界面。UNICORN的操作界面分为四个窗口（Fig 3）

蛋白纯化系统操作规程

蛋白纯化系统操作规程一、注意事项： 1.保持系统、馏分收集器内外清洁。 2.使用进口过滤器、过滤后的缓冲液，最后脱氧缓冲液。 3.为获得最佳的结果,在运行期间使用缓冲液,系统和柱处于环境温度。 4.上样之前，离心或过滤样品。 5.定期清洗和清洁整个仪器,包括馏分收集器。 6.防止交叉污染和细菌生长, 系统在每次运行后执行系统清洗(CIP)。 7.系统处于强洗涤液中不超过2小时。 8.系统停用之前，用20%乙醇填满系统，以避免滋生细菌。 9.设置UNICORN TM系统通知,提示定期维护时间。例如,定期更换泵清洗液。二、运行必需品：运行前 1.泵清洗液：20%乙醇，混浊时或量少时及时更换。 2.检查所有管道, sure no tubing is nicked. 3.确保所有缓冲液处于相同的温度系统以减少气泡的问题。 4.所有入口用缓冲液填满。 5.排气：从泵头内把气体抽出。 6.开始一个流动相，观察是否有泄漏。 7.调整ph电极。 8.执行系统预运行，使正确的缓冲液填满系统的整个流路。 9.启动一个流程检查信号从显示器看起来稳定,如果不现实，看7-12 10.wipe off the fraction collector sensors(code reader & drop sync sensor) with a tissue and fill the fraction collector with the tubes plates needed. 除去馏分收集器传感器(代码读者&下降同步传感器)组织和填补与管板所需馏分收集器。 11.wipe off the fraction collector sensors(code reader & drop sync sensor) with a tissue and fill the fraction collector with the tubes plates needed. 12.附上需要的柱子，并设置正确的柱压力。运行中：注意事项 1.过压 2.脉动压力 3.紫外信号波动 4.泄漏收紧连接器 5.最后一个管满了，更换管在操作期间声音的来源： 1.空气通风 2.紫外线监控,当使用2个波长时 3.泵的运转 4.混合器 5.改变阀的位置

蛋白纯化仪

蛋白纯化仪 1、采购内容： 2工作条件： (1) 环境条件：低温(4度)-常温(40度)常湿条件 (2) 电源条件：220V±10％，50Hz (3) 相对湿度：20~70% 3性能指标及要求：电脑控制单机可完成质检，小试到中试流速范围宽广：0.001－100ml/min 压力范围宽广：0－3675psi(25MPa)，满足质检和生产不同的压力需求专利模板编程和Scouting快速探索，快速优化纯化条件 Unicorn控制软件，通过FDA验证，符合cGMP12进口高精度缓冲液自动制备功能 UV 检测190-700 nm 同时3 波长电导检测1 μSLcm - 999.9 mSLcm p H 检测2-12 阀门：8 通道缓冲液切换阀 8 通道大组分切换阀 8 通道层析柱切换阀 8 通道样品切换阀液体流动方向切换阀样品泵组分收集器（ 11）配件：

4 提供所投标产品原厂出具的详尽的、可被验证的技术参数中英文说明书。必须附上投标产品所示彩页，支持技术资料，点对点实质应答。（加盖投标单位公章） 5、商务条款： 5.1售后服务：三年免费全包保修，终身免费维护，免收人工费，免费提供技术咨询和软件升级服务。 5.2在接到用户报修通知后，厂家保证12小时内尽快做出响应；需至用户现场维护的，保证响应后3-5日内尽快派工程师至现场；若维修时间超过二十天，厂家需提供样机供用户使用，特殊情况可商议。 5.3 自验收合格之日起半年内，若因质量问题，产品出现三次及以上同样故障的，视为产品不合格，供应商必须在买方下发通知起1个月内，产品退换。 5.4培训：中标方应负责在现场或培训基地培训买方的技术人员、操作和维护人员，在买方认可培训开始的一个月前推荐培训计划提供培训资料，培训后的人员应能熟练操作设备，了解设备结构、工作原理，并能排除一般故障。5.5 备品、备件：投标单位对必须由原厂提供的常用备件和消耗品进行报价，该价格作为考查其售后服务能力的重要指标。液相色谱仪 1、采购内容：

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