变性梯度凝胶电泳 Southern Blot原理及实验方法 凝胶迁移实验(EMSA)
EMSA实验详情
EMSA实验详情Electrophoretic Mobility Shift Assay--电泳迁移率检测点击次数：137 发表于：2008-06-18 14:53转载请注明来⾃丁⾹园来源：互联⽹凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是⼀种检测蛋⽩质和DNA序列相互结合的技术，最初⽤于研究DNA结合蛋⽩和其相关的DNA结合序列相互作⽤，可⽤于定性和定量分析。
这⼀技术⽬前已⽤于研究RNA结合蛋⽩和特定的RNA序列的相互作⽤，已经成为转录因⼦研究的经典⽅法。
其基本原理是蛋⽩质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物⽐⽆蛋⽩结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。
该⽅法可⽤于检测DNA结合蛋⽩、RNA结合蛋⽩，并可通过加⼊特异性的抗体（supershift）来检测特定的蛋⽩质，并可进⾏未知蛋⽩的鉴定。
⽣物体内DNA转录成RNA是基因表达的关键过程，基因表达调控主要发⽣在转录⽔平。
近年来，基因分⼦⽣物学研究领域的趋势之⼀是逐渐从基因结构和功能分析转到基因顺式作⽤元件和转录因⼦及其转录调控机理上，对基因转录调控的研究将是今后相当长⼀段时期内功能基因组学研究的热点之⼀。
在转录⽔平，基因的转录⾏为是由顺式作⽤元件（cis-acting elements）和反式作⽤因⼦（trans-acting factors）（即转录因⼦）相互作⽤调控的，因此要探讨基因的表达调控规律，分离、鉴定基因的位点控制区（loci control region，LCR）中顺式作⽤元件和相应转录因⼦⾄关重要。
但仅仅如此还不够，对于基因表达调控，必须从三个层次展开：⼀是分离和鉴定基因5＇端核⼼启动⼦等顺式作⽤元件，⼆是分离和鉴定与各顺式作⽤元件相对应的转录因⼦，三是检测各顺式作⽤元件与对应转录因⼦的相互作⽤。
鉴定顺式调控元件和转录因⼦是研究得⽐较多的内容，⽽对于顺式作⽤元件与对应转录因⼦的相互作⽤这个层次的研究相对较为薄弱。
emsa实验
emsa实验
EMSA实验是基于DNA结合蛋白与DNA的特异性结合，依据实验需要，设计标记探针、非标记探针、蛋白特异性抗体等参照物。
通过电泳迁移率的变化来进行定性和定量分析，钟鼎生物提供的EMSA实验（凝胶/电泳迁移率实验）基于生物素标记探针与对应的DNA结合蛋白的特异性结合，设计合理、科学的实验方案，为客户提供验证性的EMSA，竞争性的EMSA以及超迁移EMSA(Super-shift EMSA）实验服务。
1、细胞核蛋白或纯化的转录因子，部分实验亦可使用重组表达的蛋白，依据实验设计每张膜至少提供50ul，浓度大于0.5mg/ml。
2、探针序列，如无探针序列，请提供DNA结合蛋白相关信息或相关文献，便于钟鼎生物技术人员设计探针。
3、结合蛋白特异性抗体50ul以上，浓度大于0.5mg/ml。
凝胶电泳迁移率实验
凝胶电泳迁移率实验
凝胶电泳迁移率实验是一种常见的生物分子分离和分析技术。
该技术利用电场作用下生物大分子（如DNA、RNA、蛋白质等）在凝胶电泳板中的迁移速率不同，从而实现对不同分子的分离和检测。
实验步骤如下：
1. 制备凝胶电泳板：将琼脂糖、缓冲液和样品混合后倒入凝胶板中，待凝固后将电极插入凝胶板两端。
2. 加载样品：将待测生物分子样品加至凝胶板的孔洞中。
3. 进行电泳：开启电源，施加恒定电场，使生物分子在凝胶板中迁移。
4. 染色：将凝胶板浸泡于染色液中，使生物分子能够被可视化。
5. 检测：使用紫外线或螢光扫描仪等设备检测样品在凝胶板中的迁移距离和分子大小。
通过凝胶电泳迁移率实验，可以快速、准确地分离和检测生物分子，为生物医学、生物工程等领域的研究提供了重要的实验手段和依据。
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EMSA原理简介
EMSA实验技术及方法简介实验简介凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA 结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。
这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。
DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。
同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。
当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。
在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。
在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，最初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。
这一技术目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。
由于很多研究的TF不具有结合的特异性，所以即使发现TF和被研究的寡核苷酸探针结合，也不表示在体内该TF不能和其它寡核苷酸结合，运用一些生物信息学软件，可以模拟表示TF与基因启动子区寡核苷酸结合的具体情况，发现TF可以和启动子区PUTATIVE 结合。
同时，由于EMSA在体外不能模拟细胞内众多生物分子的相互作用，比如，某一TF 在细胞内由于受到其它TF的协同或者修饰后才能与寡核苷酸结合的话，那么在体外是不能重现这一结果的。
EMSA技术的原理
EMSA技术的原理EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）技术是一种常用的生物学实验方法，用于研究蛋白质与核酸相互作用的原理。
该技术可以测定核酸结合蛋白的结合亲和性和特异性。
下面将详细介绍EMSA技术的原理。
EMSA技术的原理基于核酸与蛋白质相互作用的电泳迁移差异。
在该实验中，核酸分子（DNA或RNA）与特定的蛋白质结合形成复合物，从而改变了核酸分子的电泳迁移性。
这种差异可以通过电泳分离和检测来观察和分析。
EMSA技术的主要步骤包括以下几个方面：第一步是制备探针。
通常使用核酸探针来进行EMSA实验。
探针可以是标记有荧光染料或放射性同位素的DNA或RNA分子。
这些探针通常具有与目标蛋白质结合的特定序列。
第二步是制备样品。
样品通常包括目标蛋白质和核酸探针。
目标蛋白质可以是从细胞提取的总蛋白质，也可以是经过纯化的特定蛋白质。
核酸探针和目标蛋白质在适当的缓冲液中混合，形成复合物。
第三步是电泳分离。
样品中的复合物和未结合的核酸探针通过电泳在聚丙烯酰胺凝胶中分离。
由于复合物的存在，复合物的电泳迁移速度较慢，而未结合的核酸探针的电泳迁移速度较快。
第四步是转移和固定。
在电泳分离之后，核酸分子被转移到固定在膜上的凝胶上。
这一步可以通过将凝胶与膜进行转移来完成。
第五步是探针的探测。
转移后的凝胶上的核酸探针可以使用适当的方法进行探测。
常用的方法包括荧光染色、放射性探测和化学发光等。
EMSA技术的原理基于核酸与蛋白质相互作用的电泳迁移差异，通过核酸探针与目标蛋白质结合形成复合物，从而改变了核酸分子的电泳迁移性。
这种差异可以通过电泳分离和探测来观察和分析。
EMSA技术在研究蛋白质-DNA或蛋白质-RNA相互作用、转录调控、信号传导等方面具有广泛的应用。
它可以帮助科学家们更好地理解生物学过程以及相关疾病的发生机制，为新药的开发和治疗提供有力的依据。
EMSA原理简介
EMSA实验技术及方法简介实验简介凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA 结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。
这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。
DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。
同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。
当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。
在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。
在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，最初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。
这一技术目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。
由于很多研究的TF不具有结合的特异性，所以即使发现TF和被研究的寡核苷酸探针结合，也不表示在体内该TF不能和其它寡核苷酸结合，运用一些生物信息学软件，可以模拟表示TF与基因启动子区寡核苷酸结合的具体情况，发现TF可以和启动子区PUTATIVE 结合。
同时，由于EMSA在体外不能模拟细胞内众多生物分子的相互作用，比如，某一TF 在细胞内由于受到其它TF的协同或者修饰后才能与寡核苷酸结合的话，那么在体外是不能重现这一结果的。
EMSA原理和方法
凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，最初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。
这一技术目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
由于很多研究的TF不具有结合的特异性，所以即使发现TF和被研究的寡核苷酸探针结合，也不表示在体内该TF不能和其它寡核苷酸结合，运用一些生物信息学软件，可以模拟表示TF与基因启动子区寡核苷酸结合的具体情况，发现TF可以和启动子区PUTATIVE 结合。
同时，由于EMSA在体外不能模拟细胞内众多生物分子的相互作用，比如，某一TF在细胞内由于受到其它TF的协同或者修饰后才能与寡核苷酸结合的话，那么在体外是不能重现这一结果的。
03 年上一篇关于ChIP方法的介绍文献攻击EMSA 没有考虑细胞内完整自然的染色质结构和调节的影响而受到很大的限制！下面是在一个PROTOCAL1.探针的标记：(1) 如下设置探针标记的反应体系：待标记探针(1.75pmol/微升) 2微升T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1微升Nuclease-Free Water 5微升[γ-32P]A TP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1微升T4 Polynucleotide Kinase (5-10u/微升) 1微升总体积10微升按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，V ortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。
(2) 使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。
(3) 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。
(4) 再加入89微升TE，混匀。
此时可以取少量探针用于检测标记的效率。
通常标记的效率在30％以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。
southern bloting
Southern blot实验方法与步骤用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。
用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。
将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA 转移至一固相支持滤膜。
利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA 发生同源性杂交，利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测。
（一）器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪或80℃烤箱，摇床，X线胶片。
（二）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl，变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl），中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）, 转印迹液20╳SSC（3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0），标记探针，2╳SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于1×马来酸溶液（0.1M 马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5）]，1×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5），抗－地高辛－碱性磷酸酶。
（三）步骤：1、酶切（以单一酶为例）设置反应体系（反应体系30μl）ddH2O 5μl 基因组DNA（0.5μg/μl）2μl短暂离心，消除离心管内气泡，于37℃消化过夜注意：若基因组DNA过低，要以较大体积进行限制酶消化，消化完毕后，可以通过乙醇沉淀、浓缩DNA片段，加少量DNA加样缓冲液点样。
EMSA原理简介
EMSA实验技术及方法简介实验简介凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA 结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。
这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。
DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。
同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。
当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。
在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。
在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，最初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。
这一技术目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。
由于很多研究的TF不具有结合的特异性，所以即使发现TF和被研究的寡核苷酸探针结合，也不表示在体内该TF不能和其它寡核苷酸结合，运用一些生物信息学软件，可以模拟表示TF与基因启动子区寡核苷酸结合的具体情况，发现TF可以和启动子区PUTATIVE 结合。
同时，由于EMSA在体外不能模拟细胞内众多生物分子的相互作用，比如，某一TF 在细胞内由于受到其它TF的协同或者修饰后才能与寡核苷酸结合的话，那么在体外是不能重现这一结果的。
EMSA实验指导
凝胶迁移实验(EMSA)凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术，这项技术是基于DNA 蛋白质或RNA 蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有不同迁移率的原理。
本实验是将提取到的蛋白粗提液，与生物素标记的DNA一同保温，在非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。
DNA复合物比非结合的探针移动得慢。
EMSA中结合滞后条带的有无，以及量的多少可反映出DNA结合蛋白与DNA探针的结合活性，DNA结合蛋白的表达及活化水平。
近年来，EMSA已发展成为体外研究核酸，尤其是DNA与蛋白质相互作用的一种简单，迅速，而灵敏的方法，已成为了转录因子与核酸体外相互作用的经典方法。
实验前准备在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂盒和相关常规试剂，所需的试剂盒包括：核蛋白提取试剂盒，EMSA检测试剂盒等，需从冰箱里拿出室温解冻或冰上解冻待用。
本次实验所需的耗材和仪器有：赛默飞公司提供的的Thermo Scientific全波长扫描式多功能读数仪、QSP盒装吸头及Nunc冰盒，芬兰百得的各个量程单通道移液器，离心机，恒温水浴锅摇床等。
下面进入实验部分，首先介绍本实验基本操作流程为，先进行核蛋白的提取以及定量，探针标记，随后进行凝胶的配置及预电泳，根据得到的核蛋白与探针，进行样品的制备，上样进行电泳，经过电泳分离后，转移到尼龙膜上，最后进行显色。
核蛋白提取本步骤是参照NE-PER Nuclear and cytoplasmic Extraction Reagents展开的实验。
首先将现用现配的Buffer A和Buffer C配置好，Buffer A是1ml CER I加入10μl蛋白酶抑制剂，Buffer C是1ml ER Buffer加入10μl蛋白酶抑制剂.配置好，混匀后放置于冰盒中。
取数量约为5×10^6-10^7/ml的待用细胞，用预冷PBS洗涤两遍，尽可能除去上清，勿留残液，估计离心后的压积细胞体积，每10μl体积，加入100μl的Buffer A，混匀后涡旋剧烈振荡，冰上放置10-15min。
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变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。
核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。
核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。
Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。
DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。
当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm 值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。
这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。
Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。
因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。
详细
实验方法
∙变性梯度凝胶电泳(DGGE)
实验材料
∙DNA样品
试剂、试剂盒
∙尿素
∙去离子甲酰胺
∙丙烯酰胺
∙甲叉双丙烯酰胺
∙琼脂糖
仪器、耗材
∙PCR扩增仪
∙变性梯度凝胶电泳仪
∙凝胶成像及分析系统
∙紫外透射仪
∙高速离心机
∙电泳仪
∙电泳槽
∙微量加样器
∙Tip头
∙Tip头盒
∙Eppendorf管
∙Eppendorf管架
一、实验原理
变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。
核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。
核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。
Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。
DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。
当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。
这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。
Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。
因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。
为了提高DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。
GC夹（GC clamp）就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。
因此，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。
作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。
DGGE的突变检出率为99%以上。
（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。
（3）非同位素性。
DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。
（4）操作简便、快速。
DGGE一般在24小时内即可获得结果。
（5）重复性好。
但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。
二、实验用品
1．PCR扩增仪；变性梯度凝胶电泳仪；凝胶成像及分析系统；紫外透射仪；高速离心机；电泳仪；电泳槽。
2．尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖
3．微量加样器（200μl，20μl）；Tip头（200μl，20μl）。
Tip头盒（200μl，20μl）；Eppendorf管（0.5ml，0.2ml），Eppendorf管架。
4．PCR扩增相关试剂
三、实验步骤
1．PCR反应（同前）
其中，上游引物加40bp [GC] Clamp。
2．PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认。
3．垂直变性梯度凝胶电泳
变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。
所使用的胶为6%聚丙烯酰胺凝胶，变性浓度为0～100%。
其中，含7 M尿素和40%去离子甲酰胺的胶为100%变性，不含尿素和去离子甲酰胺的胶为0%变性。
垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的最适解链条件（即变性浓度）。
PCR产物加上样缓冲液后上样，300～400μl/孔，电压150V，温度60℃，时间2～4小时。
4．平行变性梯度凝胶电泳
变性梯度递增的方向与电泳方向平行。
根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓度，制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶，检测各标本是否存在突变。
PCR产物加上样缓冲液后，25μl～30μl/孔，电压150V，温度60℃，时间3～6小时。
5．染色5分钟，凝胶成像仪分析结果。
四、注意事项
1、该实验中提取DNA，以及DGGE操作中接触到得很多药品都有毒，还有致癌、变性等毒害，一定要严格操作，做好防护保护自己。
2、严格按操作步骤。