毕赤酵母常用培养基与载体
酵母表达培养基介绍
毕赤酵母表达的培养基配制［5］2.1 LB（Luria－Bertan i）培养基：Trypto n l％YeastExtrac t 0.5％NaCl l％PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌 20min。
可于室温保存。
用于培养pP ICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Ze ocin25ug / ml。
2.2 LLB（Low Salt LB）培养基：Trypto n l％YeastExtrac t 0.5％NaCl 0.5％PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌 20min。
可于室温保存数月。
用于培养pP ICZαA 原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeoc in 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。
2.3 YPD （又称YEPD）YeastExtrac t Pepton e Dextro se Medium，（YeastExtrac t Pepton e Dextro se Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）Trypto n 2%dextro se (glucos e) 2%+agar 2%+Zeocin100μg/ml液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。
加入Zeoc in 100ug/ ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。
2.4 YPDS + Zeocin培养基（YeastExtrac t Pepton e Dextro se Medium）：yeastextrac t 1%pepton e 2%dextro se (glucos e) 2%sorbit ol （山梨醇）1 M+agar 2%+ Zeocin100μg/ml不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。
毕赤酵母表达知识归纳
毕赤酵母表达知识归纳1a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。
b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。
说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。
Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。
过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。
然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。
4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。
该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。
都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。
invitrogen手册上可以灭菌的。
毕赤酵母感受态制作及转化
毕赤酵母感受态细胞制作1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。
2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。
3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。
一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。
将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。
4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。
5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。
6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。
7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。
7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。
8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。
毕赤酵母电击法转化1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。
2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。
3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。
4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。
5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。
6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。
要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。
毕赤酵母的摇瓶发酵方法
毕赤酵母的摇瓶发酵方法：一、摇瓶发酵方法: 毕赤酵母摇瓶发酵方法分为两个阶段，1、酵母菌株生长阶段；2、脂肪酶诱导表达阶段。
1、酵母生长阶段。
准备试剂：1000ml BMGY培养基，1000ml BMM培养基，10X的甲醇，摇瓶1L （灭菌），温控摇床，50ml 离心管（灭菌）。
紫外分光光度计，石英比色皿。
以下所有操作均在超净台内或者无菌条件下完成。
（1）往灭好菌的IL摇瓶中加入100mlBMG培养基，然后加入约1ml脂肪酶菌株（培养基：菌液=100：1），用透气膜封口（透气，但是细菌不能透过）。
置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母生长，OD600=2.0-6.0 ，时间约为15-24 小时。
（2）将发酵液转入50ml离心管，1500g-3000g离心5min。
去掉上清，用BMMY 培养基将菌体浓度稀释至OD0°=1.0，约有500ml左右。
将稀释后的发酵液分别加入到1L的药瓶中，每个摇瓶150ml发酵液（绝不能超过200ml）。
（3）将摇瓶置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母表达脂肪酶，每24小时加入一次5%的甲醇，使甲醇的终浓度为0.5%。
连续诱导表达48 小时。
（4）将发酵液进行12000rpm/min离心5min，取上清（若上清仍混浊，可反复离心）；进行酶活分析和蛋白含量分析。
BMG培养基的配制（1000ml）: 20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物（Yeast Extract）,加水至700ml; 121°C高温灭菌20min。
然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml, 10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X甘油100ml。
BMM培养基的配制方法（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物，加水至700ml；1210C高温灭菌20min。
毕赤酵母手册
毕赤酵母表达实验手册作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
［1］。
同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。
酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。
1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。
干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。
酵母培养基
一种抗菌肽基因及其制备方法和该基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建2.2.7 酵母表达常用缓冲液10×YNB(13.4%无氨基酸酵母氮源)，13.4gYNB粉末溶于100mL蒸馏水，0.22µm 过虑除菌，4℃保存；500×B(0.02%生物素)，生物素20mg/100mL水，0.22µm过滤灭菌，4℃保存；10×D(20%葡萄糖)，200gD-葡萄糖溶于1L水中，0.22µm过滤灭菌，4℃保存；10×M，5mL甲醇与95mL灭菌水混匀，0.22µm的有机滤膜灭菌，4℃保存；10×GY(10%的甘油)，100mL甘油溶于900mL水，过滤灭菌，4℃保存；1M的磷酸缓冲液(pH6.5)，将132mL 1M的磷酸氢二钾(K2HPO4)和868mL的磷酸二氢钾(KH2PO4)，用磷酸和氢氧化钾pH值到6.5，过滤灭菌，4℃保存；2.2.8 酵母转化常用培养基YPD完全培养基：Yeast Extract 10g/LBacteriological peptone 20g/LGlucose 20g/L(固体培养基1.5%琼脂)115℃ 20min；100mL选择固体培养基MD平板的配制：向80mL水中加入琼脂粉1.5g，121℃灭菌20min然后待温度降至60℃在超净台上加入10mL 10×YNB(134g/L)，10mL 10×D (20g/L)，500×B0.2mL(4×10-4)100mL选择固体培养基MM平板的配制：向80mL水中加入琼脂粉1.5g，121℃灭菌20min然后待温度降至60℃在无菌超净台上加入10mL 10×YNB(134g/L)，10mL 10×M(5%的甲醇)，500×B0.2mL(4×10-4)2.2.9 酵母诱导培养基100mL诱导表达培养基BMGY的配制：70mL水中加入1g Yeast Extract，2g Bacteriological Peptone，高压灭菌20min 后待温度降至60℃在超净台上加入10mL 10×YNB(134g/L)，10mL 1M的磷酸盐缓冲液PH6.5，10mL 10×GY，500×B 0.2mL(4×10-4)；100mL诱导表达培养基BMMY的配制：70mL水中加入1g Yeast Extract，2g Bacteriological peptone，高压灭菌20min 后待温度降至60℃在超净台上加入10mL 10×YNB(134g/L)，10mL 1M的磷酸盐缓冲液PH6.5，10mL 10×M，500×B 0.2mL(4×10-4)；。
毕赤酵母表达(pichia pastoris expression )实验手册(3)
毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册（3）液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。
加入Ze ocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。
2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medi um）：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol 1 M+agar 2%+ Zeocin 100 μg/ml不管是液体 YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。
2.5 MGYMinimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。
将800ml灭菌水、100ml的 10* YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。
2.6 MGYHMinimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸）在1000ml的MGY培养基中加入 10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。
2.7 RDRegeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0. 005%氨基酸）1. 将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；2. 冷却后于45℃水浴；3. 将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2 的山梨醇溶液混合。
4℃保存。
2.8 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸）在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。
毕赤酵母从入门到提高
螺旋讲堂2010年第1期 总第20期w w w .h e l i x n e t .c n 生物人的网上家园毕赤酵母表达从入门到提高爱因思念螺旋网HelixNet本文所涉及的技术要点主要来源于相关文献、网络和书籍，此外，一些操作中的技巧及经验等来自于本人及同学、朋友的总结，仅供大家参考，同时也请下载者不要传播尤其是以商业为目的的复制、传播等等；如有转载、传播请注明来源于“螺旋网”。
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写在前面，因为酵母里用到了很多遗传学的命名方法，所以建议大家首先看一下这个资料，可以让大家理解一些不常见的符号及意义。
下载地址如下： /bbs/thread-19215-1-1.htmL一、 甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。
目前通过毕赤酵母表达了很多种性质不同的蛋白，越来越多的实验室及公司开始搭建毕赤酵母表达系统的平台，相信随着对毕赤酵母表达系统的研究越来越深入，会有更多成功表达并进行商业化应用的案例出现。
1.主要优点1)具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase ，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达； 2)作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性； 3)营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产； 4)可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L 以上； 5)表达量高，许多蛋白可达到g/L 以上水平； 6)在P . pastoris 中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化； 7) 糖基化程度低，与S. cerevisiae 相比，P . pastoris 不产生过度的糖基化。
毕赤酵母表达系统（学习资料）
毕赤酵母表达系统前言：所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。
抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。
毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。
GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。
转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。
培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。
在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。
贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长；2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度2 天；3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于－80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养；2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。
注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。
以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。
载体pPIC9K酶切为点线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。
如果只想得到Muts重组子，使用KM71 菌株。
单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts重组菌（例如：插入A OX1或his4 而不是取代AOX1）。
毕赤酵母菌
——毕赤酵母
（Pichia.pastoris）
by：文慧霖、裴颖
· 毕赤酵母的介绍 · 毕赤酵母的形态特征 · 毕赤酵母的生产过程 · 毕赤酵母的优缺点 · 毕赤酵母的开发利用
毕赤酵母菌
——全称巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养 型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一 碳源和能源的酵母菌。与其它酵母一样， 在无性生长期主要以单倍体形式存在， 当环境营养限制时，常诱导2个生理类 型不同的接合型单倍体 细胞交配，融 合成双倍体。
毕赤酵母结构图
毕赤酵母显微图
优缺点
Pichia.pastoris酵母菌体内无 天然质粒，所以表达载体需与宿 主染色体发生同源重组，将外源 基因表达框架整合于染色体中以 实现外源基因的表达。包括启动 子、外源基因克隆位点、终止序 列、筛选标记等。表达载体都是 穿梭质粒，先在大肠杆菌复制扩 增，然后被导入宿主酵母细胞。 为使产物分泌胞外，表达载体还 需带有信号肽序列。
生产过程
（1）细胞增殖繁衍；
（2）分批流加的过渡阶段（甘油或葡萄糖）； （3）诱导表达阶段（甲醇）；
各阶段碳源都为限制 性基质,其补加速率的 动力学模型是高效表 达的基础。
甲型优点
(1)具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调
控机理最严格的启动子之一；
(2)表达效率高,其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的 90%以上,有利于目的蛋白的分离纯化； (3)在简单合成培养基中可实现高密度培养； (4)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝 的形式稳定整合； (5)由于该酵母可以以甲醇为唯一碳源和能源,而绝大多 数微生物并不能以甲醇为碳源,可以减少污染。Fra bibliotek甲型不足
(1)发酵周期长；
(2)甲醇易燃易爆有毒，存在一 定的危险性； (3)筛选高产菌株需用的药物价 格比较昂贵； (4)培养基和培养条件不成熟。
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毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
得到产量高的表达菌株。
另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。
表达蛋白纯化方法：酵母系统表达的蛋白一般都具有活性，所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白，分泌型表达的蛋白有利于纯化，可用硫酸铵沉淀，然后用离子交换，凝胶过滤层析，疏水层析等方法进一步纯化。
具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。
二．毕赤酵母表达的培养基配制和用途2.1 LB（Luria－Bertani）培养基：Trypton l％Yeast Extract 0.5％NaCl l％PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存。
用于培养pPICZ αA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。
2.2 LLB（Low Salt LB）培养基：Trypton l％Yeast Extract 0.5％NaCl 0.5％PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存数月。
用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周.2.3 YPD （又称YEPD）Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）Trypton 2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeocin 100 µg/ml液体YPD培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。
加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。
2.4 BMGY培养基Yeast extract 1%Peptone 2%磷酸钾缓冲液（pH6.0）100mmol/LYNB 1.34%Biotin （4×10 -5 ）%Glycerol 1%毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。
培养24小时后，一般静置过夜，待酵母沉淀后倒掉BMGY培养基，改换BMMY培养基，进入诱导表达阶段。
2.5 BMMY培养基Yeast extract 1%Peptone 2%磷酸钾缓冲液（pH6.0）100mmol/LYNB 1.34%Biotin （4×10 -5 ）%methanol 3%毕赤酵母诱导表达培养基，YNB和Biotion过滤除菌。
摇瓶培养时每24小时之后加入3%的甲醇诱导，一般诱导72小时。
2.6YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol 1 M+agar 2%+ Zeocin 100 µg/ml不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。
2.7 MGYMinimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。
将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。
2.8 MGYHMinimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基+ 0.004%组氨酸）在1000ml的MGY培养基中加入10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。
2.9 RDRegeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）1.将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；2.冷却后于45℃水浴；3.将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml 无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2的山梨醇溶液混合。
4℃保存。
2.10 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基+ 0.004%组氨酸）在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。
4℃保存。
2.11 RD及RDH平板的制备1.将186g的山梨醇和15~20g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml 的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3. 迅速制备平板。
4℃可保存数月。
2.12 RD及RDH 的TOP 琼脂的制备（常用于酵母菌的包被）1.将186g的山梨醇和7.5~10g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml 的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3.将该TOP琼脂置于45℃水浴冷却、保温，备用。
2.13 MD与MDHMinimal Dextrose Medium +（Histidine）最小葡萄糖培养基+（0.004 %组氨酸）（含有：1.34%YNB；；4*10-5% 生物素；2%葡萄糖）1.100ml的10*YNB；2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的无菌水定容至1000ml即可；2.如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可；3.如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入15~20g的琼脂。
4℃可保存数月。
2.14 SOC培养基：Trypton l％Yeast Extract 0.5％NaCl 0.05％Glucose (1mol / L) 2%121℃高压灭菌20min，冷却后，4℃保存。
母液的配置注：10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）4℃保存。
34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。
500*B （0.02%生物素Biotin）4℃保存保存期为1年。
20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌。
100*H （0.4%Histidine 组氨酸）4℃保存保存期为1年。
400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50℃以促进溶解），过滤除菌。
10*D （20%Dextrose 葡萄糖）保存期为1年。
200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌。
10*M （5%Methanol 甲醇）保存期为2个月。
将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。
10*GY（10%Glycerol 甘油）保存期为1年以上。
将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。
100*AA（0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）4℃保存保存期为1年。
分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。
1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。