流式细胞术在克氏原螯虾血细胞的分类_活性和免疫功能研究中的应用
流式细胞术——原理,操作及应用(一)
流式细胞术——原理,操作及应用(一)流式细胞术——原理,操作及应用1. 原理•流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用于分析和计数悬浮在溶液中的个体细胞的技术。
•通过利用激光器激发细胞或微粒上荧光探针或吸光染料产生的荧光信号或散射光信号进行检测和分析。
2. 操作步骤样本制备•通过细胞培养、组织消化等方法获得需要检测的细胞样品。
•样本可能需要进行染色或标记以便于特定细胞或分子的检测。
流式细胞仪设置•调整激光器和探测器以适应所用标记物的激发和发射波长。
•设置仪器参数，如流速、放大倍数等。
数据采集和分析•将样本注入流式细胞仪，使其以单个细胞的方式流过激光束。
•通过荧光或散射光信号来检测和记录每个细胞的特征。
•利用专业软件对采集到的数据进行分析和解读。
3. 应用免疫表型分析•流式细胞术可以用于检测和分析细胞表面标记物的表达情况。
•可以用于分离和鉴定各种免疫细胞亚群，如T细胞、B细胞和NK 细胞等。
细胞周期分析•通过染色剂标记DNA，流式细胞术可以区分细胞的不同周期阶段。
•可以用于评估细胞增殖能力和细胞周期的营养、药物等因素影响。
细胞凋亡检测•利用荧光探针标记凋亡标记物，流式细胞术可以检测和计数凋亡细胞比例。
•可以用于评估药物对细胞凋亡的影响以及疾病状态的分析。
粒子分析•可以用于分析和鉴定不同大小、不同形状的微粒，如细胞、细胞器、胞外囊泡等。
•可以用于研究细胞的分泌和吞噬过程等。
其他应用•流式细胞术还可用于检测和分析细胞内钙离子浓度、细胞内蛋白、RNA和DNA含量等。
•可以应用于疾病诊断、药物筛选、生命科学研究等领域。
以上是流式细胞术的原理、操作步骤及一些常见应用的介绍。
流式细胞术的广泛应用使其成为现代生命科学研究和临床实践中必不可少的技术之一。
《流式细胞术》课件
利用特异性抗体与细胞表面抗原结合，将荧光染料标记在细胞上。
细胞分选的原理
流体动力学
通过调整液流速度和压力，控制细胞通过喷嘴的速度 。
静电场
在流动室中施加静电场，使带电的荧光微球和细胞偏 转至收集管中。
声波振荡
利用声波振荡器产生振动，使细胞在流动室中分散并 均匀分布。
数据分析与解读
数据获取
荧光染料干扰
荧光染料可能会产生交叉干扰或淬灭现象， 影响实验结果的准确性。
技术展望与未来发展
1 新技术应用
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
2 人工智能辅助数据分析
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
收集流式细胞仪产生的荧光信号和散射光信号 数据。
数据处理
利用软件对数据进行处理，包括去背景、校正 和归一化等操作。
结果解读
根据数据分析结果，解读细胞的表型、功能和活性等信息。
03
实验操作流程
样品制备
样品来源
流式细胞术的样品主要来自各类组织、血液 、培养细胞等。
样品处理
样品需要经过一系列的处理，如离心、洗涤 、细胞分离等，以去除杂质并获得纯净的细 胞样品。
3 个性化医疗应用
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
4 拓展应用领域
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
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流式细胞术在临床分析方面的应用
流式细胞术得到广泛应用和发展，出现了第一代商业化流式细胞仪。
20世纪90年代至今
流式细胞仪不断升级换代，技术不断创新，使得FCM在临床分析方面应用更加广泛。
流式细胞术基本原理
流式细胞术采用液流进样方式，将单个细胞与特异性抗体或 荧光染料结合，通过激光激发荧光信号，同时对细胞进行多 参数检测和分析。
流式细胞术可以检测基因组中的结构 变异，如染色体易位、倒位等，为一 些遗传性疾病的诊断和治疗提供依据 。
03
流式细胞术在临床分析中的优势与局限 性
流式细胞术的优势
1 2 3
快速高效
流式细胞术可以同时对多个参数进行检测，且 样本处理速度较快，有利于缩短检测时间和提 高检测效率。
高敏感度
流式细胞术对细胞亚群的检测具有高敏感度， 可以检测到极低浓度的细胞亚群，从而有助于 早期发现疾病。
它通过将单个细胞与特异性抗体或荧光染料结合，实现对细胞表面和内部特征的 定量检测。
FCM最早在20世纪70年代应用于临床医学领域，现已成为一种广泛应用于免疫学 、肿瘤学、血液学等领域的重要工具。
流式细胞术发展历程
20世纪70年代
流式细胞术最早由美国科学家开发，用于检测细胞表面抗原和细胞内DNA、RNA等物质。
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基因突变检测
流式细胞术可以检测基因突变，如抑癌基因突变等，有助于癌症的诊断和治疗。
蛋白质组学研究实例
蛋白质表达谱分析
流式细胞术可以检测不同细胞或组织中蛋白质的表达谱，了 解蛋白质的功能和作用机制。
蛋白质修饰分析
流式细胞术可以检测蛋白质的修饰情况，如磷酸化、糖基化 等，有助于深入了解细胞的信号转导和代谢机制。
拓展应用领域方向
克氏原螯虾免疫防御系统与免疫防控疾病(七)
2019.12康大技术专栏咨询热线：0373-*******、2683057克氏原螯虾免疫防御系统与免疫防控疾病(七)张喜贵1孟长明1陈昌福2(1.新乡市康大消毒剂有限公司，河南新乡453700；2.华中农业大学，湖北武汉430070)关于免疫调节剂投喂的时间与期间，以做到在水产动物传染性疾病的多发季节里连续投喂为好。
其理由主要是在免疫调节剂的实际使用中，当连续投喂免疫调节剂一段时间后，一旦停用时，养殖动物就可能开始发病。
这可能是因为在使用免疫调节剂期间，即使有细菌性或病毒性病原进入了水产动物机体，但是，由于机体的免疫机能在免疫调节剂的作用下，表现出较高的免疫活性，抑制了病原体增殖而并未将其消灭或排出体外的缘故。
采用免疫多糖(酵母细胞壁)作为水产养殖动物的免疫调节剂时，在各种传染性疾病的流行高峰时期，可以采用连续投喂的方式，而在一般养殖时期则可以采用连续投喂两周、间隔两周后再进行第2个投喂周期的方式进行。
需要特别注意的是免疫调节剂是通过激活水产动物的免疫系统而发挥抗传染病的功能，如果水产动物的免疫系统已经衰弱至不能激活的状态，免疫调节剂也就难以发挥其作用了。
所以，从改善水产动物的饲养环境、加强营养和饲养管理入手，尽量减少抑制水产动物免疫系统的环境因素，是提高免疫调节剂使用效果的重要途径。
2.免疫疫苗的应用为了预防水产甲壳动物的传染性疾病而研制的死菌或者活菌疫苗，由于不能如用于脊椎动物的疫苗一样，能诱导受免动物产生特异性的抗体，所以将其称为“疫苗”可能不太合适。
在这里提到的将灭活菌体作为“疫苗”使用时，不一定都是采用致病菌制备的，而且通过接种这类疫苗的受免甲壳动物产生的主要是非特异性防御反应。
所以，有人认为将这种“疫苗”称作免疫调节剂可能更恰当一些。
预防人工养殖虾类细菌性传染病的疫苗，最早是为了预防美洲螯龙虾的高夫败血症而研制的，试验结果表明，用引起高夫败血症致病菌浅绿气球菌制备的灭活菌苗注射或者浸泡美洲螯龙虾后，受免虾都能对高夫败血症产生免疫力。
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞术的操作、原理与应用
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
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分选时间表(机器流速10000个/s时)
分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。
分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比，一般能达 99%以上。
光电倍增管(photomultiplier, PMT) 光灵敏度高，测定弱信号（SSC, FL1, FL2, FL3,
FL4)。
PMT
前向散射光 光电二极管
（二）电信号两种放大方式
由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分 析处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。
线性(linear; lin) log)
电子系统
光电转换器 数据处理系统
细胞分选系统
喷嘴 电偏转板 样本收集器
1.3.1 液流系统
鞘流技术：根据层流原理 发展起来的技术，可以实 现两种液体的同轴流动， 样本细胞流位于轴心稳定 流动，外面包裹有鞘液 (sheath)。
流体动力学聚焦：稳定的 液流从截面积较大的部分 流入截面积较小的部分后， 有一个聚焦收缩作用，细 胞流直径被约束在1020um，避免了多个细胞重 叠进入检测区。
流式细胞术在临床中的应用
淋巴细胞 （CD45high）
T淋巴细胞 （CD3+）
B淋巴细胞 (CD19+)
NK淋巴细胞 (CD16+CD56+)
第十八页
临床意义 • B细胞减少见于原发及继发性免疫功能低下、严重的
病毒感染等情况。 B细胞增高，提示机体体液免疫功能被增强，见于临 床各种细菌性感染。及B细胞白血病。
• NK细胞数量是肿瘤临床病情判断、疗效监测的指标。
√
真菌
√
病毒感染-丙肝
√
病毒感染-HIV
√
细菌感染-结核
√
细菌感染-麻风
√
自身免疫病 克隆氏病、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、自身免疫性 √ 甲状腺炎、多发性硬化
系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性淋巴细胞增殖综
√
合征(ALPS)、自身免疫性心脏病
过敏性疾病（嗜酸性粒细胞炎症反应-哮喘）
√
妇科-流产 GVHD
• 21、JY多发性骨髓瘤流式检测
• 22、JY微小残留病流式检测
第三十九页
CD45
SS/CD45
SS
第四十页
APL
第四十一页
• 用于贫血的鉴别。再障属于干细胞受累，其静脉血中 的干细胞数量明显减少。而缺铁性等贫血干细胞数量 正常。
第三十六页
流式在阵发性睡眠性血红蛋白尿症中的应用
• 16、JY阵发性睡眠性血红蛋白尿症单克隆检测 标本类型：静脉血（2~3ml） 原理：阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）是一种补体介导
的以血管内溶血为主要特征的获得性造血干细胞克隆性 疾病。主要特征是血细胞膜上的锚蛋白减少甚至消失。 通过测定红细胞表面标志物CD235a、锚蛋白CD59和能 与中性粒细胞膜表面锚蛋白结合的FLAER，发现百分之 一的PNH细胞克隆，是一种非常灵敏、特异的方法。 临床意义： • 用于PNH的诊断与鉴别诊断
流式细胞术——原理,操作及应用(二)
流式细胞术——原理,操作及应用(二)流式细胞术原理流式细胞术（Flow Cytometry）是一种通过流式细胞仪对细胞进行高速连续检测和分析的技术。
它利用细胞与荧光标记的抗体等特异性反应，通过流式细胞仪的高速流体流动和多通道探测系统来实现对数千个细胞的快速检测和分析。
操作1.细胞准备：首先需要从样品中获得待检测的细胞，并进行细胞的染色。
常用的染色方法包括直接染色和间接染色，可以利用荧光标记的抗体或荧光染料对细胞进行染色。
2.样品处理：将染色后的细胞悬浮液注入流式细胞仪的进样室中，通过机械或压力的方式使细胞以单细胞的形式通过流式细胞仪。
3.流式细胞仪操作：设置流式细胞仪的相关参数，包括激光光源的波长、光学滤波系统、探测器的选择等。
4.数据获取和分析：流式细胞仪会记录每个细胞的各项参数，包括细胞形态、大小、荧光强度等。
可以利用专门的数据分析软件对获取的数据进行分析和图表的制作。
应用流式细胞术在生命科学研究中有广泛的应用，以下是一些常见的应用：1.免疫学研究：利用流式细胞术可以对免疫细胞进行表面标记，例如CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B细胞等的检测和分析，以研究免疫应答、免疫细胞的亚群分布等。
2.血液学研究：流式细胞术可以用于血液中不同细胞类型的检测和分类，例如红细胞、白细胞以及不同亚群的白细胞等，有助于了解血液疾病的发生机制。
3.肿瘤学研究：利用流式细胞术可以检测肿瘤细胞的特定标记，例如细胞表面抗原、细胞周期相关蛋白等，帮助进一步了解肿瘤细胞的类型、分化程度、增殖活性等。
4.微生物学研究：流式细胞术可以用于微生物的检测和计数，例如细菌、酵母菌等，有助于研究微生物的生长特性、代谢活性等。
5.细胞生物学研究：流式细胞术可以用于对细胞周期的分析、细胞凋亡的检测、细胞增殖速度的测定等，有助于了解细胞生物学的基本过程和调控机制。
总结：流式细胞术是一种非常强大和多功能的技术，在生命科学研究中得到广泛应用。
流式细胞术的基本原理
流式细胞术的基本原理流式细胞术（Flow cytometry）是一种被广泛用于生物学和医学领域的细胞分析和排序技术。
该技术采用激光离子流和散射光学的原理，快速测定单个细胞的生物学和物理特性。
该技术不仅可以进行细胞计数、大小、形态特征、表面结构、细胞周期、代谢活性、细胞分化和生长状态等分析，还可以进行单细胞分选和纯化以及细胞染色体分析等研究。
基本原理流式细胞术的原理是通过射流将单个细胞迅速送入激光束中，该激光束激发细胞中的荧光染料和标记物或散射光学特性，进而检测细胞的光学信号，并进行信号转换和数字化处理，最终得到单个细胞的特异性指标。
流式细胞术的主要组成部分包括样品处理系统、流式细胞分析系统和数据分析系统。
样品处理系统：将细胞样品经过预处理、染色或标记，使其适用于流式细胞分析。
常用的样品预处理方法包括：细胞分离、染色、去除细胞碎片和去除红细胞等。
对于需要分选的细胞，还需要使用细胞排序技术分离目标细胞。
流式细胞分析系统：该系统包括激光、光电倍增管、光学透镜、光学滤波器、样品输送系统和电子系统等。
通过激光激发样品中的荧光染料或标记物，分析细胞的光学特性。
常用的荧光染料包括：FITC、PE、APC、PerCP、Cy5等。
常用的标记物包括：抗体、细胞因子、小分子荧光探针、DNA荧光探针等。
通过修改流式细胞分析仪的配置，可实现不同荧光染料和标记物的测定。
数据分析系统：流式细胞仪测定数据的处理和分析是采用计算机系统完成的。
数据分析的常用指标包括：细胞计数、细胞孔径（大小）、荧光强度（比例和强度）、散射特性等。
一般情况下，在细胞的某个特定荧光标记物上测定的强度与其他群体相比，该指标被用来区分并描述细胞。
流式细胞术的应用流式细胞术被广泛应用于生物医学研究和诊断中。
以下是一些常见的应用领域：1. 分析细胞表面和胞内蛋白表达：通过荧光共轭的抗体和标记物来测定单个细胞膜和胞内蛋白的表达量和分布，从而确定细胞分化状态和生理状态。
医学免疫学实验：流式细胞术(Flow Cytometry)的原理及应用
光谱重叠（Spectral overlap）
补偿模型图
FL2
补偿调节前后对比
FL1
数据收集和分析
1 画图（直方图，散点图） 2 寻找目标细胞 3 调整仪器设置到合适的状态 4 我们可以得到怎样的结果？
它们意味着什么？
数据分析
• 设门 • 设定阴性与阳性群体的界限 • 确定阳性与阴性细胞群体 • 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，
流式细胞仪的临床应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病
Part IV
流式细胞术实验操作 流程及数据分析
流式细胞术操作流程
流式细胞术
✓ 调整仪器设置 ✓ 收集数据 ✓ 分析结果
课堂目标
• 了解流式细胞仪的构造、原理及应用，掌 握“门”，“补偿”两个基本概念。
• 学会简单分析流式数据：小鼠脾脏分离的 单个核细胞中CD3+、CD4+ 、CD8+细胞 的比例。
Content
✓流式细胞仪的简介 ✓流式细胞仪的组成及原理 ✓流式细胞术的应用 ✓流式细胞术实验操作流程
不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上万个细胞的速率进行测量。
可检测的样本种类多样各种细胞（如外周血，骨髓，实体组织，悬浮或
贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球。
样本类型
可检测颗粒大小
0.2μm
50μm
流式细胞仪能检测哪些信息?
➢ 相对大小: Forward Scatter (FSC)
• 2.染色：小心用枪去除上清，再加入50ul预混抗体的PBS（由助 教准备），将细胞吹打混匀，避光， 4℃或冰上，染色1520min
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第42卷第1期Vol.42No.1淡水渔业FreshwaterFisheries2012年1月Jan.2012
收稿日期：2011－09－30；修订日期：2011－12－08资助项目：国家自然科学基金资助项目（30671628）；广东省教育部产学研结合资助项目（2006D90204005）；国家科技支撑计划项目（2007BAD29B06）；广东省科技计划项目（2007B020708013）；广东省重点科技项目（2009A020101006）；广东省自然科学基金项目
（5005909和021098）；广州市科技支撑计划项目（2009Z1－E681）。第一作者简介：冼健安（1983-），男，博士后，主要从事水生动物营养免疫学和养殖环境生态学研究。E-mail：xian-ja@qq.com通讯作者：王安利。E-mail：wanganl@scnu.edu.cn
流式细胞术在克氏原螯虾血细胞的分类、活性和免疫功能研究中的应用冼健安，王安利，苗玉涛（华南师范大学生命科学学院，广东省水产健康安全养殖重点实验室，高等学校生态与
环境科学广东省重点实验室，广州510631）
摘要：应用流式细胞术（FCM）对克氏原螯虾（Procambarusclarkii）血细胞的分类、活性和免疫功能进行了研究。结果显示：血细胞可分为透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞三个亚群，组成比例分别为（26.25±5.29）%、（51.44±7.02）%和（11.20±1.82）%；螯虾血细胞的平均总凋亡率约为3.12%；血细胞对荧光大肠杆菌的吞噬
活力显著（P＜0.05）高于荧光微球，吞噬率分别为17.04%和14.57%；血细胞在自然生理状态下含有一定量的活性氧，其在两类颗粒细胞的含量显著（P＜0.05）高于透明细胞，在大颗粒细胞中最高。结果表明，FCM能较好地应用于虾类的血细胞分类和功能研究。关键词：流式细胞术；克氏原螯虾（Procambarusclarkii）；血细胞中图分类号：S917文献标识码：A文章编号：1000-6907-（2012）01-0009-06
Applicationofflowcytometryinstudiesofclassification，viabilityandimmuneparametersofProcambarusclarkiiHaemocytes
XIANJian-an，WANGAn-li，MIAOYu-tao（KeyLaboratoryofEcologyandEnvironmentScienceinGuangdongHigherEducation，GuangdongProvincialKeyLaboratoryforHealthyandSafeAquaculture，CollegeofLifeScience，SouthChinaNormalUniversity，Guangzhou510631，China）
Abstract：Classification，viabilityandimmunefunctionofcrayfish（Procambarusclarkii）haemocyteswere.studiedusingflowcytometry.Resultsshowedthathaemocytesweredividedintothreesubpopulations，includinghyalinecells，semigran-ularcellsandgranularcells，withtheproportionsof（26.25±5.29）%，（51.44±7.02）%and（11.20±1.82）%，re-spectively.Theaverageapoptoticratiowas3.12%inthetotalhaemocytes.PhagocyticactivityagainstfluorescentE.coliwassignificantlyhigherthanthatoffluorescentmicrosphere（P＜0.05）.Thephagocyticratioswere17.04and14.57%，re-spectively.Haemocytesalsoproducedreactiveoxygenspeciesatthenaturalphysiologicalstate.Thereactiveoxygenproduc-tionwassignificantlyhigherinthetwogranularcellsthanhyalinecells（P＜0.05），andhighestingranularcells.ThepresentstudyshowedthesuperiorityofFCMonstudyofcellularclassificationandfunctionsofshrimphaemocytes.Keywords：Flowcytometry；Procambarusclarkii；Haemocyte
克氏原螯虾（Procambarusclarkii）具有繁殖力强、抗病力强、生长快、适应性强等优点，现已是国内淡水养殖的主要对象之一。虾病的暴发是造成虾类养殖业经济损失的主要原因之一，进行虾类免疫学研究是解决此难题的重要途径。血细胞是虾类免疫系统的重要组成部分，在体液免疫和细胞免疫中均起着至关重要的作用。但由于技术手段限制等原因，以往的研究一般只关注到免疫酶活性等体液免疫指标［1－2］，对细胞免疫的研究甚少。流式细胞术（Flowcytometry，FCM）是一种快速、敏感、准确的研究方法，它能从单个细胞的水平去分析各类细胞的特性。近年来，已应用到多种贝类［3－6］和虾类［7－12］血细胞的免疫研究中。本研究利用FCM研究克氏原螯虾血细胞的分类、活性和免疫功能，为建立一种快捷、准确的虾类血细胞免疫的FCM检测方法打下基础。1材料与方法1.1材料克氏原螯虾购于广州市黄沙水产品交易市场，体长8～10cm，实验室暂养1周后，选取附肢完整、无病患、活力强、处于蜕皮间期的个体作为实验用螯虾。黄绿色人工荧光微球（直径1μm）、2'，7'－二氢二氯荧光黄双乙酸钠（DCFH－DA）、叠氮钠（NaN3）均购自Sigma公司。AnnexinV－FITC/PI凋亡检测试剂盒、荧光大肠杆菌购自Invitrogen公司。其它试剂为国产分析纯。1.2方法1.2.1血细胞悬液的制备用2.5mL一次性注射器吸取400μL预冷的抗凝剂（0.14MNaCl，0.1M葡萄糖，30mM柠檬酸三钠，26mM柠檬酸，10mMEDTA，pH4.6）［13］，从螯虾围心腔取等量血淋巴，离心后用预冷抗凝剂调整细胞浓度约为1×106个/mL。每只虾的稀释血淋巴液作一单独样品进行检测，所有指标均检测15尾螯虾。1.2.2血细胞组成和比例流式细胞仪为美国BD（BectonDickinson）公司FACSCalibur，应用CellQuest软件进行实验数据的获取和分析。主要测试参数为前向角散射光（For-wardlightscatter，FSC）、侧向角散射光（Sidelightscatter，SSC）、第一荧光通道（FL1）和第二荧光通道（FL2）。每个样品的细胞获取数为10000个。稀释血淋巴用200目筛网过滤后直接上机进行血细胞分群检测。以FSC为横坐标、SSC为纵坐标作散点图和等高图，在散点图上设门划分各个细胞亚群，分析各亚群比例。1.2.3血细胞凋亡率的测定
以AnnexinV－FITC/PI凋亡检测试剂盒（Invitrogen）检测血细胞的自然凋亡率。实验操作
按照试剂盒说明书的步骤进行。血细胞先离心重悬于1xAnnexinV结合缓冲液中，调整细胞浓度约3×106个/mL，每100μL血细胞悬液加入
5μLAnnexinV－FITC和10μLPI工作液，避光染
色15min，再加入400μL1xAnnexinV结合缓冲液，200目筛网过滤后立即上机检测。以FL1荧光强度为横坐标，FL2荧光强度为纵坐标作散点图，用十字Marker划分各类细胞的区域，分析其比例。1.2.4吞噬活力的测定
取血细胞悬液300μL，加入黄绿色人工荧光微球或荧光大肠杆菌，使细胞与人工荧光微球或荧光大肠杆菌的比例约为1：100，避光孵育2h，200目筛网过滤后上机检测；以0.1%NaN3预处理30min的血细胞作为阴性对照组。结果以细胞的荧
光强度（FL1）为横坐标，细胞数量为纵坐标的直方图表示。吞噬三个或以上的荧光微球或荧光大肠杆菌的细胞认为是吞噬阳性，通过Marker划定阳性区域计算阳性细胞所占的比例，即为吞噬率。1.2.5活性氧含量的测定
取血细胞悬液200μL，加入10μMDCFH－DA避光孵育30min，200目筛网过滤后上机检测。结果以DCF荧光量（FL1）为横坐标，细胞数量为纵坐标的单参数直方图表示。根据细胞散点图分析不同细胞亚群的活性氧含量。1.2.6统计分析
实验数据利用SPSS13.0进行统计分析，结果显示为平均值±标准差（Mean±SD），P＜0.05确认为差异性显著。
2结果
2.1血细胞分群和组成比例
如图1所示，根据血细胞FSC和SSC特征的不同，可把血细胞划分为三个亚群：R1，R2和R3。亚群R1的FSC和SSC值都相对最小，表明该
亚群的细胞最小，颗粒度也最低，为透明细胞。R3亚群细胞的FSC和SSC值都相对最大，表明该
亚群的细胞最大，颗粒程度也最复杂，为大颗粒细胞。R2亚群的细胞大小和颗粒度处于R1和R3亚群之间，为小颗粒细胞。其组成比例如表1所示，
01淡水渔业2012年