脐血单个核细胞分离方法的比较及形态学改变

脐血单个核细胞分离方法的比较及形态学改变
作者：李敏,张季红,徐佩茹作者单位：新疆医科大学第一附属医院，新疆乌鲁木齐830011
【摘要】目的:探索一种简便、高效的脐血单个核细胞分离方法。方法:以Ficoll密度
梯度离心法与羟乙基淀粉(HES)分离法进行对比,比较两种分离方法分离脐血所得的单个核
细胞(MNC)细胞数，并观察两组单个核细胞不同培养时间下形态学变化。结果:两种分离
方法在分离脐血MNC方面存在着显著性差异,其中以HES法效果较好,但HES法所得细胞
培养后生长状态欠佳。结论：HES法是一种高效的脐血单个核细胞分离方法,但该法所得细
胞的生长状态欠佳，需进一步实验证实。

【关键词】脐血/胎血;单个核细胞;分离
Comparisonthedifferencesoftwoisolationmethodsofmononuclearcellsderived
fromhumancordbloodandobservationofmorphologychanges

LIMin，ZHANGJi-hong,XUPei-ru
(DepartmentofPediatrics,FirstAffiliatedHospital,XinjiangMedical
University,Urumqi830011,China)

Abstract:Objective:Toexploreanconvenientandhigh-performanceisolationmethod
ofmononuclearcellsderivedfromhumancordblood.Methods:Theisolationmethods
includingthehespanisolationandFicollisolationwereanalyzedbymononuclearcells
amount.Themorphologychangesofcellsindifferentisolationmethodswereobserved.
Results:ThehespanisolationwasbetterthanFicollisolationinisolationofmononuclear
cellsderivedfromhumancordblood.Butmononuclearcellsgrowthconditionwasbelow
themarkfromthehespanisolation.Conclusion:Thehespanisolationwasa
high-performanceisolationmethodofmononuclearcellsderivedfromhumancordblood.
Butmononuclearcellsgrowthconditionwasbelowthemarkandneedfurtherconfirmby
experiment.

Keywords:Humancordblood;mononuclearcell;isolation
近年来,脐血（umbilicalcordblood,UCB）已成为除骨髓以外的重要间充质干细胞
(mesenchymalstemcells,MSCs)来源,具有来源更为充足、免疫原性更弱、供者无痛苦、
不涉及伦理问题、传播疾病的几率低、含有的干细胞丰富等优点。大量的实验证实,脐血中
的MSCs可在体外培养,诱导分化后能成为神经细胞(神经元和神经胶质细胞)、心肌细胞［1～
3］等，故而UCB-MSCs有广阔的应用前景。但现有的细胞分离方法以及扩增、分化技
术还远远难以满足生物学领域对UCB-MSCs的需求,因此寻找更加简便、高效的UCB-MSCs
分离、培养方法是十分必要的。UCB-MSCs是从脐血分离的单个核细胞培养生成，我们拟
对此作一些有益的研究，比较脐血的单个核细胞分离方法及培养前后的细胞形态学改变。

1材料与方法
1.1标本来源选择新疆医科大学第一附属医院产科足月或早产妊娠健康产妇的脐血
用于实验,产妇年龄24～35岁,无肝炎、梅毒、结核及其他妊娠并发症。实验于2007年5～
10月在新疆医科大学第一附属医院细胞室完成。用于实验的脐血20份随机分为2组处理:
淋巴细胞分层液法处理组、羟乙基淀粉沉淀法处理组。

1.2主要试剂低糖DMEM(GIBCO)、胎牛血清(杭州四季青)、淋巴细胞分离液(上
海华精)、羟乙基淀粉（贺斯，北京费森尤斯卡比）、传统型血袋（生复）。

1.3方法
1.3.1取血按照脐带血标本采集标准，足月或早产分娩,排除传染性疾病及各种家族
遗传疾病,标本采集严格无菌操作。使用复方枸橼酸血液保护液抗凝。

1.3.2单个核细胞的分离及计数脐血平均容积为50～100ml，标本在采集后的3h
内进行分离。随机将脐带血分为两组处理：一组为淋巴细胞分离液法，将血袋内的抗凝脐血
导入250mL无菌瓶中,与Hanks液1∶1稀释。取数个无菌离心管,先加入比重为1.077
g/cm3的淋巴细胞分离液5～15ml,无菌吸管吸取稀释后的脐血10～30ml,缓慢加入形成
一明显的界面，2000r/min离心20min，小心吸取中间白膜层,磷酸盐缓冲液洗涤2次,彻
底弃上清。椎虫蓝进行活细胞计数,计算获取的单个核细胞的数量。一组为羟乙基淀粉沉淀
法，将脐血与6%的羟乙基淀粉按照4∶1的比例混匀,4℃下静置1h,取上清,1500r/min
离心10min,磷酸盐缓冲液洗涤1次,椎虫蓝进行活细胞计数,计算获取的单个核细胞的数
量。同时记录实验进行时间。

1.3.3单个核细胞的培养观察将单个核细胞用含体积分数0.2的胎牛血清的低糖
DMEM培养基,调整细胞密度接种于25cm2培养瓶中,在体积分数0.05的CO2,37℃细
胞培养箱中进行培养,3d后全量换液,以后每隔3～4d半量换液。用倒置显微镜观察生长
状态。主要观察指标:(1)两种分离方法处理的人脐带血所获得的单个核细胞数。(2)两组单个
核细胞不同培养时间下生长状态的比较。

1.4统计学处理采用随机对照实验，计数资料实验结果以±s表示,采用两独立样本均
数比较的t检验，计量资料采用两独立样本率比较的χ2检验，检验水准α=0.05。

2
结果

2.1两种分离方法处理的人脐带血所获得的单个核细胞数淋巴细胞分层液获得的单
个核细胞数量为(3.91±0.63)×106/ml,羟乙基淀粉沉淀法获得的单个核细胞数量为
(12.78±1.69)×106/ml,二者比较差异有统计学意义，见表1。

2.2各组单个核细胞在不同培养时间生长状态的比较两组细胞开始时均为小圆形细
胞，随后为卵圆形、圆形及梭形细胞的混合体,以后可见贴壁生长的梭形细胞增多,与此同
时圆形及卵圆形的细胞逐渐减少,细胞形态较为均一。淋巴细胞分层液组的10份脐血中有
3份培养成功，由小圆形细胞转变为成纤维样细胞时间约为5～7d，此后很快出现较多的成
纤维样细胞，10～12d左右细胞出现50%融合。羟乙基淀粉沉淀法的10份脐血中有2份
标本可观察到小圆形细胞转变为成纤维样细胞，时间约为9～14d，成纤维样细胞数量增长
缓慢，16～18d左右细胞出现50%融合，1份标本的细胞最终成活，另1份细胞污染死亡，
大多数标本细胞悬浮，逐渐崩解死亡。两种分离方法处理的人脐带血细胞出现50%融合时
间差异有统计学意义(表1)。淋巴细胞分层液法的培养成功率为30%(3/10),羟乙基淀粉沉淀
法的培养成功率为10%(1/10),二者比较差异无统计学意义（P>0.05）。

表1两组脐血MNC分离方法比较（略）
注：与淋巴细胞分层液组比较，*P<0.05
3讨论
间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是指一群可向成骨细胞、成脂肪胞、
骨髓基质细胞、肝脏细胞、心肌细胞和神经细胞等多种细胞分化的多潜能组织干细胞［4］,
是在细胞治疗、基因治疗中有效发挥作用的理想工程细胞。MSCs不仅存在于骨髓,也可从
脐血、外周血中［5,6］以及脂肪组织、肌肉、胎儿器官［7］、大脑、牙齿［8］中分离。
UCB-MSCs的分离、筛选、增殖、分化与脐血样本的选择、培养基的差异以及分离、扩增
分化过程中操作技术等多种因素有关。目前用于UCB-MSCs分离的方法有:贴壁筛选法、
密度梯度离心法、流式细胞仪法和免疫磁珠法。由于流式细胞仪法对细胞损伤较大，免疫磁
珠法价格相对较贵，而密度梯度离心法常与贴壁筛选法结合使用,可提高所得UCB-MSCs
的纯度，目前研究多采用此法。国内不少学者采用羟乙基淀粉、明胶、甲基纤维素等沉淀红
细胞，然后再进行离心分离单个核细胞，也取得不错结果［9～11］。本实验采用随机数字
表法，将每份脐血随机分入两个不同处理组，从而将脐血样本的个体差异减小到最小程度。
结果证实，羟乙基淀粉沉淀法获得的有核细胞数量明显多于FICOLL密度梯度离心法。本实
验采用的羟乙基淀粉商品名为贺斯，平均分子量为200000D,克分子渗透压为308mosm
／L，胶体渗透压为68／36mmHg,可影响红细胞集聚性沉降率。红细胞集聚是可递性桥接
结构形成的结果，由大的HES分子处在红细胞之间联接而成。HES同时还阻碍白细胞和内
皮细胞的黏附，并使平均血小板容积呈现微弱地降低，从而有轻度抑制血小板集聚的功能。
脐血经羟乙基淀粉处理后，可使红细胞沉积至瓶底，对其它主要成分包括单个核细胞无影响。
经这样处理后，实验时间相对较短（平均为1.5h），步骤相对较少，细胞污染几率小［12］，
从而使细胞数损失较少。这部分结果与迟作华等［9］的报道相同。两种方法体外培养成功
率则无明显差异，从脐血中分离培养间充质干细胞的成功率本身较低，与脐血中间充质干细
胞含量较少有关。但随着实验的继续进行，淋巴细胞分层液组的细胞呈现较好的生长状态，
无论成纤维样细胞出现的时间，还是细胞达到50%融合的时间均优于羟乙基淀粉沉淀法处
理组的细胞，这与迟作华等［9］的报道不尽相同。可能的原因，一是羟乙基淀粉沉淀法处
理脐血的步骤不完全相同，迟作华等［9］是将脐血与6%的羟乙基淀粉混匀,室温下静置；
本实验则是4℃下静置,可能温度对脐血的分离及生长有一定的影响。另外，分析可能与标
本的个体差异有关，可在以后通过加大样本例数来进一步证实。故而，羟乙基淀粉沉淀法是