微生物几丁质酶研究进展
Ｌ生Ｅ啊 ＲＳ ＩＮ技ＢＩＯＴ术ＥＣＨＮ通ＯＬＯＧ讯Ｙ …Ｖｏ１．１一／一－Ｎｏ．３·Ｍ…ａｙ，２ＵＯ—Ｏ， ＴｒＥ ·ｌ ·ｊ ４３９
文章编号：１００９—０００２（２００６）０３－０４３９－０４
微生物几丁质酶研究进展
王治伟，刘志敏
军事医学科学院生物工程研究所，北京１０００７１ 综 述
［摘要］ 微生物几丁质酶不仅在生物降解几丁质方面起着重要作用，而且可通过水解病原真菌的细胞壁而有效地抑制其
生长。到目前为止，人们已经分离和克隆出了大量的微生物几丁质酶及其基因。尽管这些几丁质酶各不相同，但它们却具有
类同的蛋白质结构域：信号肽、催化结构域和几丁质结合结构域等。本文着重介绍几丁质酶的结构和分子特征、表达和调控
机理，并且分析了该酶的应用前景。
［关ｔ词］几丁质酶；结构域；降解
［中圈分类号］Ｑ５５６．９；Ｑ７１ ［文献标识码］Ａ
Ａｄｖａｎｃｅ ｉｎ Ｓｔｕｄｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ
ＷＡＮＧ Ｚｈｉ—－ｗｅｉ，ＬＩＵ Ｚｈｉ－ｍｉｎ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００７１，Ｃｈｉｎａ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｐｌａｙ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎ，ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｅｈｉｔｉｎａｓｅｓ ｃａｎ
ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ｂｙ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓ． Ａ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ
ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ． Ａｌｔｈｏｕｇｈ ｅｖｅｒｙ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｓ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｅａｃｈ
ｏｔｈｅｒ，ｔｈｅｙ ｈａｖｅ ｓｏｍｅ ｃｏｍｍｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｓｕｃｈ ａｓ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｆｉｄｅ，ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｃｈｉｔｉｎ—ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏ—
ｍａｉｎ ｅｔｃ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ，ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｅｈｉｔｉｎａｓｅ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａ－
ｎｉｓｍ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔ ｏｆ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｗｅｒｅ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ．
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ；ｄｏｍａｉｎ；ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
几丁质酶（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）及其底物几丁质（ｃｈｉｔｉｎ）广泛存在于自
然界中。几丁质又称甲壳质或甲壳素，是一种天然的生物多聚
物，每年自然界中产生的几丁质数量极其巨大，超过１００亿吨ｌｌ】。
在天然聚合物中，几丁质的储量仅次于纤维素，位列第二，同时
它还是自然界中存在最多的含氮聚合物田。几丁质是多数真菌细
胞壁的主要成分之一，也广泛存在于原生生物、节肢动物和甲壳
类生物之中。人们对于微生物几丁质及其酶类的研究已经有近
百年的历史。１９０５年，Ｂｅｎｅｃｋｅ首次发现Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｉｔｉｎｏｖｒｏｕｓ（现
分类为蚀几丁质贝内克氏菌。Ｂｅｎｅｃｋｅａ ｃｈｉｔｉｎｏｖｏｒａ）能利用几丁
质作为营养物 。Ｆｏｌｐｍｅｒｓ发现利用几丁质的细菌和真菌在几丁
质平板上形成水解环。并以此来证明几丁质酶的存在。随着对微
生物几丁质酶研究的深入，现已在许多微生物、植物、动物中发
现了几丁质酶 。其主要作用在于微生物的形态发生、抗真菌感
染以及对几丁质类物质的水解等。目前微生物几丁质酶的应用
已涉及工业、农业、医药、生物技术等多个领域。为了更好地认识
和利用微生物几丁质酶。人们已经对微生物几丁质酶的分布、定
位、结构、性质、基因克隆、诱导表达以及调控机制等进行了多方
面的研究，本文主要对微生物几丁质酶及其应用进展作一综述。
１ 已被分离的微生物几丁质酶及其性质 氏菌、液化沙雷氏菌、嗜水气单胞菌、交替单胞菌属０—７株、蚀几
丁质贝内克氏菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、
成团肠杆菌、蓝黑紫色杆菌、铜绿假单胞、嗜麦芽假单胞菌、创伤
弧菌、弗氏弧菌、哈氏弧菌、黄单胞菌属、类腐败梭菌、产气荚膜
梭菌、热纤维梭菌等。放线菌类有褶皱链霉菌、浅青紫链霉菌、橄
榄绿链霉菌、淡紫灰链霉菌、灰色链霉菌、浅天青链霉菌、天蓝色
链霉菌、热紫链霉菌、葱绿毛链霉菌等。真菌类有木霉属（ －
ｃｈｏｄｅｒ７Ｍ ｈａｒｚｉａｎｕｍ、ＴｒｉｃｈｏｄｅｔＪＴｔａ ｖｉｒｅ 、Ｔｒｉｃｈｏｄｅ，７ｍ ｈａｍａｔｕｍ）、
酿酒酵母、白色扁丝霉、白色念珠菌、构巢曲霉、白僵菌、少孢根
霉等。病毒类有小球藻病毒ＰＢＣＶ一１、苹果蠹蛾颗粒体病毒
（ＣｐＧＶ）、棉铃虫单核衣壳核多角体病毒（ＨａＳＮＰＶ）、苜蓿银纹夜
蛾多核型多角体病毒（ＡｃＭＮＰＶ）、杆状病毒等。很多微生物都能
够产生几丁质酶，而且即便是同一种微生物有时也能产生几种
不同的几丁质酶。如酿酒酵母就能产生２种内切几丁质酶ｃｔｓｌ
和ｃｔｓ２；粘质沙雷氏菌产生相对分子质量为２１ ０００－５７ ０００不等
的５种几丁质酶 ；交替单胞菌属０—７株可产生ＣｈｉＡ、ＣｈｉＢ、
ＣｈｉＣ和ＣｈｉＤ等共４种不同的几丁质酶 。在同一种微生物中存
在的几丁质酶也可能性质不同。如在拟诺卡氏菌Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ
ｐｒａｓｉｎａ ０ＰＣ一１３１株产生的３种几丁质酶ＣｈｉＡ、ＣｈｉＢ和ＣｈｉＢＡ
中，ＣｈｉＡ属于１８家族几丁质酶，而ＣｈｉＢ和ＣｈｉＢＡ则属于１９家
近年来人们已经分离出了许多微生物几丁质酶，这些微生 ｊ ２王００治５－伟ＩＯ（－ｌ９１７３８一），男，硕士研究生
物涵盖了细菌、放线菌、真菌和病毒等门类。细菌类有粘质沙雷 ［通讯作者】刘志敏，（Ｅ—ｍａｉｌ）ｌｌｕｚｈｍ＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ
维普资讯 http://www.cqvip.com ４４０ Ｌ生Ｅ ， ＲＳ ＩＮ技ＢＩＯ ＣＨＮ通ＯＬＯＧ讯Ｙ…Ｖｏ１．一１７一Ｎｏ．３一－－Ｍａｙ，２…０ＯＯ— ＴＴＥ ＴＥ ．，． ，
族几丁质酶Ｉｓ］。这说明微生物几丁质酶具有多样性的特点。而且
即便是来自同一家族的几丁质酶，其催化机制也有所不同。如来
自气单胞菌１０Ｓ一２４株的１９家族几丁质酶对几丁质的裂解位点
分别为（一２、一１、＋１、＋２、＋３、＋４），而植物源性的１９家族几丁质酶
对几丁质的裂解位点却为（一３、一２、一１、＋１、＋２、＋３），且水解的产物
也不尽相同１９］。微生物几丁质酶的分子大小差异也很大，一般为
１０ ０００～１００ ０００，目前研究的相对分子质量最大的是Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂ．
ｒ ｄｅｇｒａｄａｎｓ ２—４０株的几丁质酶，达到了１４０ ０ｏ０【 。微生物几
丁质酶反应的最适ｐＨ值的变动范围也很大，一般认为是３－１ １，
但绝大多数微生物几丁质酶最适ｐＨ值为４－６的偏酸性环境。酶
在ｐＨ值为３～１１时通常都十分稳定，酶的等电点ｐＩ为３．６－８．６。
微生物几丁质酶往往对热都比较稳定，在４～６０℃时都具有酶活
性，而像激烈热球菌的几丁质酶在９８－１００￣Ｃ时仍然能正常进行
水解反应［２２１，但大多数微生物几丁质酶的最适反应温度为４０－
５０℃，在一２０℃保存２年仍有酶活性。微生物几丁质酶的这种热稳
定性特点，使其在生物技术产业方面具有巨大的应用潜力。微生
物几丁质酶的活性还受到环境中金属离子的影响，如Ｆｅ 、Ｆｅ“、
Ｚｎ 对酶的活性有较大的抑制作用，而Ｍｇ２ 和Ｍｎ ＋贝０有一定的激
活作用『】２１。微生物几丁质酶还具有可诱导性，譬如微生物几丁质
酶的产生往往需要几丁质和壳聚糖及其水解产物作为底物存
在；而葡萄糖和几丁质等的降解产物则对微生物的几丁质酶的
表达起抑制作用。但也有例外，如拟诺卡氏菌Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ
ｐｒａｓｉｎａ ＯＰＣ一１３１株表达几丁质酶的过程并不受葡萄糖的抑制。
在自然状态下，绝大多数微生物几丁质酶是分泌表达的，主要是
因为这些微生几丁质酶在微生物体内的表达往往都伴随着微生
物的增殖和形态变化的发生。
２微生物几丁质酶的分类
人们在研究微生物几丁质酶的过程中，根据其结构和性质
将微生物几丁质酶进行了相应的分类。根据反应的最适ｐＨ值的
不同，可将其分为酸性、中性和碱性几丁质酶。微生物中的几丁
质酶多为酸性酶；而植物中的几丁质酶大多为碱性酶，也有酸性
酶。并且可能出现在同一植株中。一般认为，植物中的碱性几丁
质酶与植物对真菌的抗性有关。另一方面，根据同底物的作用部
位和产物的不同可分为外切和内切几丁质酶，其中外切几丁质
酶同底物寡糖链的非还原端结合，切下几丁质二糖，同时沿寡糖
链前移准备进行下一次水解；而内切几丁质酶则随机地同底物
寡糖链结合并切开相应的糖苷键，然后再进行随机的结合和水
解。按照糖苷酶的分类标准，根据其氨基酸序列的同源性，可将
几丁质酶分为１８和１９两个家族 ，其中１８家族几丁质酶广泛
存在于病毒、微生物、植物和动物中；而目前发现的１９家族几丁
质酶除了在植物中广泛存在外，还存在于链霉菌属和一些拟诺 卡氏菌属的放线菌中，在气单胞菌１０Ｓ一２４株和唐菖蒲伯克霍尔
德氏菌中也发现了１９家族几丁质酶。绝大多数的微生物１９家
族几丁质酶和植物的１９家族几丁质酶在催化区有很高的同源
性㈣。对于目前研究过的所有１８家族几丁质酶来说，在其催化区
都含有２个Ａｓｐ和１个Ｇｌｕ，即ＤＸＤＸＥ基序，这可能是保证１８
家族几丁质酶活性的必需关键氨基酸。１８家族几丁质酶具有相
似的蛋白质三级结构，即都具有由ｄ螺旋和Ｂ折叠构成的圆桶
形结构，中心是由平行的Ｂ折叠结构组成的内桶，依次为Ｂ ～Ｂｓ，
由ｄ螺旋结构将它们逐个连接起来，在ｄ螺旋和Ｂ折叠之间有
段无规卷曲连接。１８家族几丁质酶有２段分别位于Ｂ，和Ｂ
链上的氨基酸序列是高度保守的，且它们具有相似的结构，与底
物结合的部位就位于由Ｂ３和Ｂ 链形成的环状缝隙中。而１９家
族几丁质酶的结构和溶菌酶的三级结构相似，由一个双叶的（ｄ＋
Ｂ）模体构成。到目前为止，所有研究过的１８家族几丁质酶的水
解产物都是Ｂ异构体，而１９家族几丁质酶的水解产物都是ｄ异
构体，而且它们催化水解的机理也有很大差异（表１）１９， 。另有
人将几丁质酶分为５种类型（Ｉ～Ｖ），１８家族几丁质酶中细菌、
真菌、病毒和动物源性的为Ⅲ型，植物来源的为Ｖ型；来自植物、
真菌和其他微生物的１９家族几丁质酶为Ｉ、Ⅱ和Ⅳ型。Ｉ型和
Ⅳ型在Ｎ端都有一段与底物结合有关的富含半胱氨酸的区域，
但由于Ⅳ型比Ｉ型少１个半胱氨酸富含区和１个催化区，因而
抗稻瘟病几丁质酶产生菌的筛选及产酶条件的研究
第２１卷第１期 ２０１１年３月 湖南工程学院学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏ１．２１．Ｎｏ．１ Ｍａｒ．２Ｏｌｌ
抗稻瘟病几丁质酶产生菌的筛选及产酶条件的研究
唐勇军 ，卢向阳 ，邹 俊 ，田 云
（１．湖南工程学院化学化工学院，湘潭４１ｉｉ０４￣２．湖南农业大学生化与发酵工程室，长沙４１０１２８；）
摘要：稻瘟病具有传染快、危害大等特点，其微生物防治具有良好的发展前景．本实验采用以稻瘟病
细胞壁为筛选培养基来筛选抗稻瘟病的几丁质酶产生茵，并对筛选到的优良菌株进行产酶条件优化．实 验结果表明，从不同来源的土壤和植物器官中分离得到１６株能检测到几丁质酶活性的几丁质酶产生
茵，其中以Ｈ３和Ｈ９的产酶能力最强，具有良好的开发价值． 关键词：几丁质酶产生茵；筛选；产酶条件；稻瘟病 中图分类号：Ｑ９３９．９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１—１１９Ｘ（２０１１）Ｏ１一Ｏ０７４一Ｏ４
稻瘟病是水稻三大病害之一，被称为水稻”癌 症”，有传染快、危害大及防治难的特点，可以引起水
稻大幅减产，严重时可以达到４０％～５Ｏ％，甚至绝 收．虽然部分化学农药对稻瘟病的防治有一定的效 果，但是由于环境污染严重不宜过量施用，而且化学
农药容易引起病菌的抗药性而导致病菌失控，因此 生物农药和生物防治是未来发展的主要方向．几丁 质（ｃｈｉｔｉｎ），也称为甲壳素、甲壳质等．它在自然界中
分布广泛，储量非常丰富．几丁质酶（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ， ＥＣ３．４．１．１４）可催化水解几丁质的 一１，４糖苷键 生成几丁聚糖和几丁寡糖［１］．由于许多的病原微生
物和有害昆虫体内含有几丁质，因此几丁质酶作为
几丁质的降解酶，它在植物病虫害防治，尤其在真菌 病害的防治中有很重要的应用价值．研究证明，几丁 质的降解产物一几丁寡糖能诱导启动植物的防御系
统，刺激植物生长发育Ｌ２］．几丁质酶产生菌是一类能
几丁质脱乙酰酶的研究进展
几丁质脱乙酰酶的研究进展
杨倩;刘建辉;蒋彤;董莉莉;段宏玉;孙纪录
【摘 要】Chitin deacetylase(CDA) is an enzyme which can catalyze
deacetylase reaction in chitin generating chitosan. Chitosan has several
excellent properties, such as antibacterial, anticancer, and antiviral, with
wide application prospect in the medicine, chemical, and food industries.
The research situation of CDA was re-viewed, including enzymatic
properties, catalytic mechanism, the method of separation and purification,
etc. Furthermore, the screening methods and process of CDA producing
strains were briefly introduced, and the fu-ture research direction of CDA
was prospected.%几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)是可以催化几丁质脱乙酰基反应生成壳聚糖的酶类.壳聚糖因其具有抗菌、抗癌、抗病毒等特性,在医药、化工、食品等行业具有广阔的应用前景.对CDA的研究概况进行了综述,包括酶学性质、催化机理、分离纯化的方法等,同时对CDA产生菌的筛选方法及过程做了简要的阐述,并对CDA今后的重点研究方向进行了展望.
【期刊名称】《食品研究与开发》
几丁质酶在农业方面的应用研究概况
几丁质酶在农业方面的应用研究概况
唐梦君，有利利，倪 红※
（湖北大学生命科学学院，湖北武汉 430062）
摘 要 目前，合成类杀虫剂和杀真菌剂的滥用造成了严重的环境污染。而几丁质酶有潜在的抗含几
丁质的病原体的特性，因此在农业方面应用前景广泛。综述了在几丁质酶抗植物病原真菌、杀虫、抗
细菌和果蔬采后病害的防治等方面的应用研究情况。在此基础上，对几丁质酶在生物农业上的应用前
景进行了展望。
关键词 几丁质酶；生物防治；农业；应用研究
中图分类号：Q814.9；S476 文献标志码：A DOI：10.19415/ki.1673-890x.2017.1.014
知网出版网址：/kcms/detail/50.1186.s.20170123.1758.023.html 网络出版时间：2017-1-23 17:58:00
收稿日期：2016-09-22基金项目：湖北省科技厅计划项目（2014BCB031）。作者简介：唐梦君（1993—），女，湖北襄阳人，湖北大学生命科学学院生物化学与分子生物学专业2014级在读硕士研究生，研究方向为农作物病虫害防治。※为通信作者，E-mail: nh64@
。如今，控制害虫和植物疾病最常用的方法是使
用化学试剂，但是这给环境造成了巨大影响。几丁
质是一种天然多聚物，是寡聚体N-乙酰葡糖胺由
β-1,4-糖苷键连接而成的，几丁质广泛存在于昆虫
等甲壳类动物的外壳、软体动物器官以及多数真菌
的胞壁中。几丁质酶是一种能够将几丁质水解成N-
乙酰葡糖胺的糖苷酶[1]，它作为一种天然溶菌酶类，
在抗植物病原真菌、杀线虫作用、抗细菌以及果蔬
采后病害等的生物防治方面都有应用，再加上它具
有可诱导性、安全无毒副作用[2]等特点，在农业上的
应用范围正在不断扩大。
1 在抗植物病原真菌方面的应用
由真菌病原体引起的植物疾病使全球重要的农作
物损失巨大。传统的合成杀菌剂对人体健康和环境有
1293462556几丁质酶
几丁质酶(chitinase)是以几丁质(chitin)为作用底物的水解酶。几丁质又称甲壳素或甲壳质,存在于节肢动物、线虫和软体动物的体壁、真菌细胞壁(除卵菌)和一些藻类等生物的细胞壁中。在昆虫中,几丁质是围食膜及体壁的主要组成成分之一,通过几丁质酶对其有规律地降解以保证昆虫正常生长发育。如果编码该酶的基因在不适当的时候表达或该表达时未表达,都会对昆虫造成伤害。由于植物中不含几丁质,因此在植物害虫防治中,昆虫几丁质是几丁质酶的一个极具吸引力的作用靶标。
一、昆虫几丁质酶生物化学与生理作用
昆虫几丁质酶存在于中肠、蜕皮腺及某些昆虫的毒腺中,是一种糖蛋白,可以水解昆虫体壁和中肠中的几丁质,酶切位点通常随机发生在链中间的任何一个部位,其最终产物是可溶低分子量的GlcNAC寡聚物。昆虫蜕皮时约有90%的几丁质被降解,几丁质酶和几丁质之间的作用是一种动态过程,包括经过几丁质结合区(CBD)的吸附过程、水解过程、解吸附作用及活性催化区在作用底物表面的配置过程。昆虫几丁质酶除能降解几丁质外,还担负许多重要生理功能,如昆虫肠道组织中的几丁质酶具有分解肠内和围食膜的几丁质和消化作用。昆虫几丁质酶分泌到肠道中,以无活性酶原形式存在,在需要时被胰蛋白酶激活而降解围食膜。蜕皮腺中的几丁质酶可以调节昆虫在生长发育中周期性蜕皮并合成新表皮。毒腺中的几丁质酶有助于毒腺物质在取食对象的组织中扩散渗透。
二、昆虫几丁质酶分子特征
1993年,编码昆虫几丁质酶的cDNA序列首次从烟草天蛾Manduca sexta中克隆出来。目前已克隆得到烟草天蛾、家蚕Bombyx mori和美国白蛾Hyphantria cunea等十几种昆虫的几丁质酶cDNA序列。这些克隆的基因主要集中在鳞翅目昆虫中,双翅目、鞘翅目和膜翅目仅有少数几丁质酶基因被克隆的报道。昆虫几丁质酶分子量在40~85kDa之间,比植物几丁质
酶(25~40kDa)和细菌几丁质酶(20~60kDa)大。酶活性范围为pH4~8,等电点在5~7之间,大都属于18家族几丁质酶。昆虫几丁质酶为多结构域蛋白,一般都包含信号肽区、一个或多个N-端催化区、富含丝氨酸和苏氨酸(S/T)的糖基化位点区(linker区)、一个或多个fibronectin-like区和C-端富含半胱氨酸(Cys)的几丁质结合区(CBD)。但不同昆虫的几丁质酶,其多区结构有所不同,如一种寄生蜂Chelonus sp.的几丁质酶大小为52kDa,有一个富含丝氨酸和苏氨酸的区域,但缺少C-端富含半胱氨酸的区域。这些结构域构成上的变化以及氨基酸序列的不同导致了昆虫几丁质酶在最适pH、催化活性、对几丁质的亲合力及稳定性方面的差异。昆虫几丁质酶的多个结构区独自发挥功能,互不影响,其中N-端催化区序列具有保守性,决定酶的催化活性。连接N-端催化区和几丁质结合区的linker区,是经过O-位高度糖基化修饰,而催化区只是适度的N-位糖基化修饰,linker区使几丁质酶易于分泌到细胞外,并且在有蛋白水解酶存在的情况下,保持几丁质酶的稳定性。几丁质结合区(CBD)基本功能是使几丁质酶结合不溶性的底物并提高降解效率。具有多个CDB区时,能增强昆虫几丁质酶对大分子不溶底物的结合能力及作用活性,提高催化区在水解不溶性底物时的催化效率,linker区也可能影响碳水化合物结合区的功能。昆虫几丁质酶的CBD约为65个氨基酸,且不同的昆虫几丁质酶CBD序列有高度的相似性,其中6个Cys最为保守,存在于所有昆虫几丁质酶的CBD中。研究表明, 几丁质酶的活性仅与活性催化区有关,而昆虫几丁质酶与体壁和中肠几丁质的相互作用依赖于几丁质结合区和活性催化区同等、共同的作用。昆虫几丁质酶中有几个重要的氨基酸残基保守位点:W145,D144,E146和D142。W145维持几丁质酶催化区域结构,对酶的催化活性产生重要影响。如以甘氨酸替代则活性完全丧失,但是W145对几丁质酶与几丁质之间的结合并不是必需的。E146在水解中起酸碱催化剂的作用,D144维持一种电离平衡,D142影响几丁质酶最适pH值,该位点的突变可使几丁质酶最适PH由碱性变为酸性。
病原芽胞杆菌几丁质酶产生菌的筛选与活性鉴定
第２４卷第３期
２０ １ １年０６月 武汉纺织大学学报
Ｊ０ＵＲＮＡＬ ＯＦ ＷＵＨＡＮ ＴＥＸＴＩＬＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｖｂ１．２４ Ｎｏ－３
Ｊｕｎ．２０１１
病原芽胞杆菌几丁质酶产生菌的筛选与活性鉴定
蔡亚君，桂震，李锋，杨小俊
（武汉纺织大学环境工程学院，湖北武汉４３００７３）
摘要：通过特异引物ＰＣＲ方法和水解圈活性法对６２株苏云金芽胞杆菌菌株、２６株蜡状芽胞杆菌菌株及１８株
球形芽胞杆菌菌株进行了几丁质酶产生菌的筛选。所测苏云金芽胞杆菌中除４株野生型菌株外均为阳性结果，蜡
状芽胞杆菌仅１株为阴性结果，球形芽胞杆菌全为阴性结果，且水解圈法观察结果与ＰＣＲ检测结果一致。在此
基础上，通过ＤＮＳ比色法对几丁质酶产生菌株的几丁质酶比活力也进行了测定。对这些具有致病性的病原芽胞
杆菌几丁质酶的研究对于研究其致病机理及对其进行遗传改良具有重要的理论和实际应用价值。
关键词：几丁质酶；苏云金芽胞杆菌；蜡状芽胞杆菌；球形芽胞杆菌；比活力；致病
中图分类号：Ｑ８９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９—５１６０（２０１１）０３—００５８—０４
几丁质（ｃｈｉｔｉｎ）为聚Ｂ一１，４一乙酰葡萄糖胺，是一种广泛存在于自然界的直链状高分子生物多聚体。
自然界每年生成的几丁质数以百亿吨计，是储量仅次于纤维素的天然聚合物。几丁质是许多真菌细胞壁的
主要成分，也大量存在于昆虫或节肢动物的甲壳及昆虫的中肠中。几丁质酶（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）可催化水解几丁
质的ｐ一１，４糖苷键生成Ｎ一乙酰一Ｄ一氨基葡萄糖（ＮＡＧ），广泛存在于微生物、植物、昆虫和脊椎动物中，
在环境保护和农业等方面有着广泛的应用前景。至今，芽胞杆菌属中已有环状芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｅｕｌａｎｓ），
蜡状芽胞杆菌（ ｇｒｃｕｓ，简称Ｂｅ），苏云金芽胞杆菌（ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，简称研）等相继发现产几丁质酶
的菌株。
是目前世界上应用最广泛的生物杀虫剂，在多种害虫的综合防治中发挥了重要的作用。 与 以
黏质沙雷氏菌产几丁质酶的诱变
江苏农业科学２０１２年第４０卷第４期 ．．——３５９．．——
康乐，高园园，张魁，等．黏质沙雷氏菌产几丁质酶的诱变效果［Ｊ］．江苏农业科学，２０１２，４０（４）：３５９—３６１
黏质沙雷氏菌产几丁质酶的诱变
康 乐 ，高园园 ，张魁 ，金 星 ，丁 军 ，杨启银 ＇。
（１．南京师范大学生命科学学院，江苏南京２１００４６；２．南京市微生物工程技术研究中心，江苏南京２１００４６；
３．江苏省微生物资源工程化技术研究中心，江苏南京２１００４６）
摘要：分析了紫外线、ＮａＮＯ 及其复合处理对黏质沙雷氏菌产几丁质酶的诱变效果，经几丁质平板透明圈初筛与
摇瓶复筛，筛选出１株几丁质酶活较高的诱变菌株ＮＵ２，产量为出发菌株的２．７５倍。研究发现，原生质体紫外线诱变
对酶活的提高效果比菌悬液ＮａＮＯ：诱变更明显；复合诱变中，茵悬液经ＮａＮＯ 诱变后再经原生质体紫外线诱变的方
法产酶能力更强，且菌株遗传稳定性较好。
关键词：黏质沙雷氏菌；原生质体；诱变；几丁质酶
中图分类号：Ｑ７８ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—１３０２（２０１２）ｏ４—０３５９—０３
黏质沙雷氏菌（Ｓｅ￣ａｔｉａ ｌｎａｒｃｅｓｃｅｌ２￥）亦称灵杆菌，是革兰
氏阴性兼性厌氧杆菌，属于肠杆菌科克白雷氏菌族中的沙雷
氏菌属，为该属的代表菌种” 。该菌株在培养过程中可产生
几丁质酶（Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ Ｅ Ｃ．３．２．１４） ，且该菌株的几丁质酶系
统至少包括１种内切和切几丁质酶。这些酶蛋白的基因编码
不同并具有不同的理化性质和酶学性质。当培养基中含有几
丁质成分时可诱导４种外切几丁质酶［ＣｈｉＡ（５８．８ ｋＤａ），
ＣｈｉＢ（５５．４ ｋＤａ），Ｃｈｉｃ（５１．７ ｋＤａ）］和菌体结合蛋白［ＣＢＰ２１
（２１．８ ｋＤａ） 的生物合成。
几丁质酶在食品、医药、农业以及化妆品等行业都具有独
特使用价值 。几丁质酶能催化分解几丁质，产生几丁寡糖
真菌 几丁质酶体
真菌 几丁质酶体
全文共四篇示例，供读者参考
第一篇示例：
真菌是一类具有单细胞或多细胞结构的生物，通常生活在湿润的环境中，以有机物质为营养来源。真菌在自然界中扮演着非常重要的角色，它们能够分解有机物质并循环利用能量，促进土壤肥沃度的提高。在真菌的细胞中，存在着一种重要的细胞器——几丁质酶体，它在真菌的生物代谢中起着重要作用。
几丁质酶体是一种负责分解几丁质的酶体，它存在于真菌的细胞内。几丁质是一种多聚葡萄糖氨基葡聚糖，在真菌的细胞壁中起着支持和保护作用。当真菌生长或进食时，几丁质酶体会释放几丁质酶来分解几丁质，从而提供成长所需的能量和材料。
几丁质酶体在真菌的代谢过程中扮演着重要的角色。几丁质酶体不仅可以分解几丁质，还可以参与到其他生物化学反应中。几丁质酶体内的酶具有高度的催化活性，能够快速地将底物转化为产物，从而促进真菌的生长和繁殖。
除了在真菌的代谢过程中发挥作用外，几丁质酶体还在环境保护和医学领域中有重要应用。由于几丁质酶体能够高效降解几丁质，因此可以被用于生物材料的降解和回收利用。在医学领域，几丁质酶体也可以用于白细胞的研究和药物输送系统的设计，有望成为治疗某些疾病的新型手段。
几丁质酶体是真菌内部的一个重要细胞器，它在真菌的生物代谢中发挥着重要的作用。通过对几丁质酶体的研究和应用，我们可以更好地了解真菌的生长机制，并发掘其在环境和医学领域中的潜在价值。希望未来能够进一步深入研究几丁质酶体，探索其更广泛的应用前景。【文章结束】。
第二篇示例：
真菌几壳质酶体是一种与几壳质降解和代谢有关的细胞器，存在于真菌细胞内。几壳质酶体是一种特殊的溶酶体，包含有多种几壳质酶和酸性水解酶。它的主要功能是通过酶的作用将几壳质分解成小分子，然后再进一步代谢转化为有机物质或者能量。
真菌几壳质酶体在几壳质降解和代谢过程中发挥着至关重要的作用。几壳质酶体中的几壳质酶可以将几壳质分解成较小的单糖分子，如葡萄糖、甘露糖等。这些单糖分子可以进一步被真菌细胞吸收利用，作为能量来源或者有机物合成的原料。几壳质酶体中还含有一些酸性水解酶，可以对几壳质进行水解作用，进一步促进几壳质的分解代谢过程。
几丁质降解酶产生菌的分离及其产酶条件的初步研究
浙江大学学报(农业与生命科学版) 28(6):641～645,2002
JournalofZhejiangUniversity(Agric1&LifeSci1)
收稿日期:2001204209基金项目:浙江省科技厅资助项目(001106132)作者简介:吴根福(1965—),男,浙江余姚人,在职博士研究生,副教授,从事应用微生物及环境微生物方面的研究Λ文章编号:100829209(2002)0620641205
几丁质降解酶产生菌的分离及其产酶条件的初步研究
吴根福,杨志坚
(浙江大学生物科学系,浙江杭州310012)
摘 要:从土壤中分离出两株几丁质降解能力较强的细菌,经初步鉴定,分别归于假单胞菌属和短杆菌
属,命名为Pseudomonassp1ww和Brevibacteriumsp1yyΛ对这两菌株进行的液体摇瓶发酵试验表明,
在肉汤培养基中,yy菌株16h进入稳定期,ww菌株20h进入稳定期,而在几丁质培养基中两菌株要培
养36h才进入稳定期;在几丁质培养基中对酶活力的测定结果表明:yy菌株培养35h酶活达最高,为
813UmL,ww菌株培养30h时酶活最高,达1313UmLΛ用半量肉汤培养基摇瓶培养10h后加入
012%胶体几丁质的补料分批培养方式,可使酶活高峰时间提前5h,且酶活力也有所增加Λyy菌株在30
h酶活达最高,为814UmL,ww菌株在25h酶活达最高,为1516UmL,若加入的是2%的胶体几丁
质,则对菌体,特别是对yy菌株的生长有抑制作用Λ实验还发现两菌株的几丁质培养物对金黄色葡萄球
菌有明显的抑制作用,对大肠杆菌也有一定的抑制作用,而对黑曲霉和黑根霉几乎没有抑制作用Λ
关 键 词:几丁质降解酶;短杆菌;假单胞菌;筛选
中图分类号:Q936 文献标识码:A
WUGen2fu,YANGZhi2jian(Dept1ofBiosciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310012,China)
几丁质及高附加值产物酶法生产关键技术研究
几丁质及高附加值产物酶法生产关键技术研究
几丁质是自然界产量仅次于纤维素的可再生性多聚物。 自然界在不断产生大 量几丁质的同时，微生物也合成了大量能够降解几丁质的不同性质的酶。
几丁质在自然界的广泛分布， 意味着能够分解利用几丁质及其类似物的微生 物也有着广泛的分布。 环境的多样性、 微生物种类的多样性为人类筛选不同性质 不同要求的几丁质及其衍生物降解酶提供了可能性。
近年来几丁质及其脱乙酰基产物壳聚糖和他们的寡糖，几丁寡糖和壳寡糖， 在诸如食品、制药、材料科学、微生物学、组织工程、纳米材料等很多领域得到 广泛的应用。 因此对几丁质及其相关产物形成巨大的需求， 但是目前无论几丁质 的工业化生产， 还是几丁质脱乙酰基生产壳聚糖或生产几丁寡糖、 壳寡糖， 均以 化学方法为主，几乎都要用到强酸强碱，对环境造成极大的污染。
因此迫切需要开发新的绿色生产工艺。采用生物学或酶学方法制备几丁质、 壳聚糖及其寡糖具有生产条件温和可控， 对环境污染少的优点， 因此是替代化学 方法的理想技术，也是目前的研究重点。
目前几丁质的生产主要是从虾蟹壳中采用盐酸和氢氧化钠分别脱除碳酸钙 和蛋白质的办法，尽管有了一些改进，但是仍需要使用强酸或强碱。另一方面， 科研人员从自然界，特别是海洋环境中已经筛选出很多和几丁质分解有关的酶， 如几丁质酶( EC3.2.1.14 )、几丁质脱乙酰基酶 (CDA; EC3.5.1.41) 和壳聚糖酶 (EC3.2.1.99) 等，但是都普遍都存在酶活力不够高和酶产量低的问题， 因此多处 于实验室阶段，尚未应用于工业生产。
基于此，本研究首先尝试采用蛋白酶和有机酸分别脱除虾壳中蛋白质和碳酸 钙的办法生产几丁质， 然后从与海洋环境差异巨大的秦岭山区不同生境中采集土 样，从中分离新型几丁质酶和几丁质脱乙酰酶高产菌株， 并对其培养基和发酵条 件进行优化。 本研究尝试采用柠檬酸脱钙、 胃蛋白酶去除蛋白质的工艺从虾壳中 提取几丁质。
植物几丁质酶及其应用研究进展
收稿日期：2004-11-28 修回日期：2005-05-18基金项目：福建省自然科学基金资助项目（B0510017）.作者简介：张志忠（1976-），男，博士，讲师.研究方向：植物生物技术.!通讯作者.植物几丁质酶及其应用研究进展
张志忠，吴菁华，吕柳新!，林义章
（福建农林大学园艺学院，福建福州350002）
摘要：几丁质酶是高等植物普遍存在的一种重要的病程相关蛋白，近年来被广泛应用于植物抗病基因工程的研究.本文概
述了国内外有关植物几丁质酶的研究情况，介绍了几丁质酶的特性、结构、分类、细胞学定位和功能及几丁质酶基因的克隆
与其在植物基因工程中的应用.
关键词：几丁质酶；转基因；抗真菌基因工程
中图分类号：@556文献标识码：A文章编号：1671-5470（2005）04-0494-06
Progressofplantchitinaseanditsapplication
ZHANGZhi-zhong，WUJing-hua，LiLiu-xin，LINYi-zhang
（CoiiegeofHorticuiture，FujianAgricuitureandForestryUniversity，Fuzhou，Fujian350002，China）
Abstract：Chitinaseisanimportantpathogenesis-reiatedprotein，whichuniversaiiyexistsinhigherpiants.Studiesonpiantchiti-
nasearebriefiyreviewedinthispaper，whichinciudesthecharacteristics，structure，ciassification，cytoiogicaiorientationandfunc-
tionsofchitinaseasweiiascioningofitsgeneanditsappiicationtopiantgeneengineeringfordiseaseresistance.