【CN109666745A】染色体1p19q联合杂合性缺失的检测方法及试剂盒【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号
(43)申请公布日
(21)申请号 201910117207.X(22)申请日 2019.02.15(71)申请人 领星生物科技（上海）有限公司地址 201203 上海市浦东新区中国（上海）自由贸易试验区祥科路111号腾飞科技楼2号楼5楼 申请人 上海领安生物科技有限公司　启东领星医学检验所有限公司(72)发明人 魏金旺　张敖　王晨　戴春　许强　(74)专利代理机构 上海市汇业律师事务所 31325代理人 陆红杰(51)Int.Cl.C12Q 1/6886(2018.01)C12Q 1/6806(2018.01)C12Q 1/6869(2018.01)

(54)发明名称
染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法
及试剂盒
(57)摘要
本发明公开了一种染色体1p/19q联合杂合
性缺失的检测方法，步骤包括：1）在1p和19q上选
择相同数量的SNP位点；2）设计原始引物，将每条
原始引物最靠近3’端但非末尾的T修改为U，若3’
端末尾为T，则将往5’方向的第2个T修改为U，获
得多重扩增引物序列；3）合成多重扩增引物并溶
解混合；4）多重PCR扩增；5）处理扩增产物，使U的
单链形成一AP位点，再暴露出AP位点的5’磷酸和
3’磷酸末端；6）测序，根据SNP等位型频率判断该
染色体是否发生1p/19q联合杂合性缺失。本发明
基于多重扩增子的NGS方法检测Chr1p/19q co-
LOH，不仅检测灵敏度、特异性和效率高，而且对
样本限制小。

权利要求书2页 说明书10页
序列表13页 附图2页

CN 109666745 A
2019.04.23

C
N
1
0
9
6
6
6
7
4
5
A
1.染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法，其特征在于，步骤包括：
1）在1号染色体短臂1p和19号染色体长臂19q上分别选择相同数量的SNP位点；
2）根据步骤1）选择的位点，设计适用于多重扩增的原始引物，然后将每条原始引物最
靠近3’端但不是末尾的T修改为U，如果3’端末尾为T，则将往5’方向的第2个T修改为U，获得
多重扩增引物序列；
3）合成步骤2）所得多重扩增引物，并进行溶解混合；
4）进行多重PCR扩增反应；
5）用尿嘧啶DNA糖基化酶处理步骤4）所得扩增产物，使U的单链形成一个AP位点；再用
核酸内切酶Ⅷ分别在AP位点的3’和5’端切割磷酸二酯键，产生5’磷酸末端和3’磷酸末端；
6）构建测序文库，进行高通量二代测序，根据SNP等位型频率判断该染色体是否发生
1p/19q联合杂合性缺失。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1），一部分SNP选自1p36.3区段和
19q13.3区段；另一部分SNP的选择标准为：该SNP为杂合型的概率在人群中接近50%，且该
SNP在基因组中的距离大于300kb。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1），1p和19q上各选择10个SNP位点，其
中，1p 上5个SNP位于1p36.3区段，19q上5个SNP 位于19q13.3区段。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述原始引物的序列如SEQ ID NO:
1～SEQ ID NO:40所示；所述多重扩增引物序列如SEQ ID NO:41～SEQ ID NO:80所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4），PCR反应体系包括：2×Platinum 
Multiplex PCR Master Mix 15µl，80µM多重扩增混合引物 10µl，1ng/µl样本DNA 5µl，总
体积30µl；PCR反应条件：95℃ 2min；95℃ 30s，60℃ 90s，72℃ 20s，30个循环；72℃ 
10min；4℃保持。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5），在产生5’磷酸末端和3’磷酸末端
后，还包括有如下步骤：使用T7核酸内切酶Ⅰ切断暴露的单核苷酸单链，将原始U往5’方向的
序列全部切掉。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤5），反应体系包括：无核酸酶超纯水
4.3µl，部分消化反应缓冲液2.2µl，尿嘧啶DNA糖基化酶0.5µl，核酸内切酶Ⅷ 0.5µl，T7核
酸内切酶Ⅰ0.5µl，多重扩增产物14µl，总体积22µl；反应条件：37℃ 20分钟，10℃ ≤1小时。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤5），所述部分消化反应缓冲液的组成
成分为：500mM乙酸钾，150mM Tris-乙酸，100mM 乙酸镁，1g/ml BSA，用乙酸调至pH 7.9，25
℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6），判断方法包括如下步骤：
61）将测序结果与hg19序列比对，获得所有SNP的等位型频率；
62）识别杂合型SNP；
63）如果杂合型SNP两个基因型的比例在45%～55%之间，则判定该SNP未发生联合杂合
性缺失，否则认为该位置发生了联合杂合性缺失；
64）如果染色体臂上任意一个杂合型SNP被判断为发生了联合杂合性缺失，则判定该位
点所处染色体臂发生了联合杂合性缺失；
65）当1p和19q均发生了联合杂合性缺失时，判断为该染色体发生了1p/19q联合杂合性

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