【CN109666745A】染色体1p19q联合杂合性缺失的检测方法及试剂盒【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日
(21)申请号 201910117207.X
(22)申请日 2019.02.15
(71)申请人 领星生物科技（上海）有限公司地址 201203 上海市浦东新区中国（上海）自由贸易试验区祥科路111号腾飞科技楼2号楼5楼 申请人 上海领安生物科技有限公司 启东领星医学检验所有限公司
(72)发明人 魏金旺 张敖 王晨 戴春 许强
(74)专利代理机构 上海市汇业律师事务所 31325代理人 陆红杰
(51)Int.Cl.C12Q 1/6886(2018.01)C12Q 1/6806(2018.01)C12Q 1/6869(2018.01)
(54)发明名称染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法及试剂盒(57)摘要本发明公开了一种染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法，步骤包括：1）在1p和19q上选择相同数量的SNP位点；2）设计原始引物，将每条原始引物最靠近3’端但非末尾的T修改为U，若3’端末尾为T，则将往5’方向的第2个T修改为U，获得多重扩增引物序列；3）合成多重扩增引物并溶解混合；4）多重PCR扩增；5）处理扩增产物，使U的单链形成一AP位点，再暴露出AP位点的5’磷酸和3’磷酸末端；6）测序，根据SNP等位型频率判断该染色体是否发生1p/19q联合杂合性缺失。本发明基于多重扩增子的NGS方法检测Chr1p/19q co-LOH，不仅检测灵敏度、特异性和效率高，而且对
样本限制小。权利要求书2页 说明书10页
序列表13页 附图2页CN 109666745 A2019.04.23
CN 109666745
A1.染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法，其特征在于，步骤包括：
1）在1号染色体短臂1p和19号染色体长臂19q上分别选择相同数量的SNP位点；
2）根据步骤1）选择的位点，设计适用于多重扩增的原始引物，然后将每条原始引物最
靠近3’端但不是末尾的T修改为U，如果3’端末尾为T，则将往5’方向的第2个T修改为U，获得
多重扩增引物序列；
3）合成步骤2）所得多重扩增引物，并进行溶解混合；
4）进行多重PCR扩增反应；
5）用尿嘧啶DNA糖基化酶处理步骤4）所得扩增产物，使U的单链形成一个AP位点；再用
核酸内切酶Ⅷ分别在AP位点的3’和5’端切割磷酸二酯键，产生5’磷酸末端和3’磷酸末端；
6）构建测序文库，进行高通量二代测序，根据SNP等位型频率判断该染色体是否发生
1p/19q联合杂合性缺失。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1），一部分SNP选自1p36.3区段和
19q13.3区段；另一部分SNP的选择标准为：该SNP为杂合型的概率在人群中接近50%，且该
SNP在基因组中的距离大于300kb。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1），1p和19q上各选择10个SNP位点，其
中，1p 上5个SNP位于1p36.3区段，19q上5个SNP 位于19q13.3区段。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述原始引物的序列如SEQ ID NO:
1～SEQ ID NO:40所示；所述多重扩增引物序列如SEQ ID NO:41～SEQ ID NO:80所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4），PCR反应体系包括：2×Platinum
Multiplex PCR Master Mix 15µl，80µM多重扩增混合引物 10µl，1ng/µl样本DNA 5µl，总
体积30µl；PCR反应条件：95℃ 2min；95℃ 30s，60℃ 90s，72℃ 20s，30个循环；72℃
10min；4℃保持。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5），在产生5’磷酸末端和3’磷酸末端
后，还包括有如下步骤：使用T7核酸内切酶Ⅰ切断暴露的单核苷酸单链，将原始U往5’方向的
序列全部切掉。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤5），反应体系包括：无核酸酶超纯水
4.3µl，部分消化反应缓冲液2.2µl，尿嘧啶DNA糖基化酶0.5µl，核酸内切酶Ⅷ 0.5µl，T7核
酸内切酶Ⅰ0.5µl，多重扩增产物14µl，总体积22µl；反应条件：37℃ 20分钟，10℃ ≤1小时。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤5），所述部分消化反应缓冲液的组成
成分为：500mM乙酸钾，150mM Tris-乙酸，100mM 乙酸镁，1g/ml BSA，用乙酸调至pH 7.9，25
℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6），判断方法包括如下步骤：
61）将测序结果与hg19序列比对，获得所有SNP的等位型频率；
62）识别杂合型SNP；
63）如果杂合型SNP两个基因型的比例在45%～55%之间，则判定该SNP未发生联合杂合
性缺失，否则认为该位置发生了联合杂合性缺失；
64）如果染色体臂上任意一个杂合型SNP被判断为发生了联合杂合性缺失，则判定该位
点所处染色体臂发生了联合杂合性缺失；
65）当1p和19q均发生了联合杂合性缺失时，
判断为该染色体发生了1p/19q联合杂合性权 利 要 求 书1/2页
2CN 109666745 A
【CN109988820A】一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日
(21)申请号 201910317012.X
(22)申请日 2019.04.19
(71)申请人 奥明（杭州）基因科技有限公司地址 310018 浙江省杭州市江干区杭州经济技术开发区白杨街道6号大街452号2幢A1711-A1712号房
(72)发明人 童云广 王瓯晨 徐鹭芹
(74)专利代理机构 杭州知见专利代理有限公司 33295代理人 赵越剑
(51)Int.Cl.C12Q 1/6806(2018.01)C12Q 1/6886(2018.01)C40B 50/06(2006.01)C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒(57)摘要本发明公开了一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒，包括(1)样品采集与提取；(2)末端修复/磷酸化/加A；(3)添加含标签的接头序列；(4)捕获前扩增；(5)目的基因杂交捕获；(6)富集；(7)捕获后扩增。本发明基于二代数字分子标识符(DMI)和双链双标签双重纠错(DSDC)技术，可有效降低深度测序PCR扩增或测序中发生的错误，提高检测灵敏度，同时针对反应体系和杂交洗涤液进行了优化，能对目标基因进行有效富集，降低样本量的要求。可用于乳腺癌的靶向治疗、临床试验以及疗效评估涉及基因
检测的技术领域。权利要求书3页 说明书14页
序列表6页 附图2页CN 109988820 A2019.07.09
CN 109988820
A1.一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品采集与提取：收集外周血，分离血浆，并提取游离核酸DNA；
(2)末端修复/磷酸化/加A：对提取到的游离核酸DNA进行末端修复、磷酸化及加A；
(3)添加含标签的接头序列：将步骤(2)处理后的游离核酸DNA与含标签的接头序列混
杂合性缺失纯合性缺失点突变的原理与检测方法
杂合性缺失纯合性缺失点突变的原理与检测方法
1.杂合性缺失：
原理：杂合性缺失可由几种原因引起，包括染色体脆性、许多突变体不稳定、环境因素、染色体遗传学机制的损坏等。
检测方法：常用的检测方法包括：
-FISH（荧光原位杂交）：通过用特定荧光标记探针与染色体杂交，可以检测出具体缺失区域的有无。
-基因测序：通过对基因组进行测序，可以找出有没有缺失的部分。
2.纯合性缺失：
纯合性缺失是指基因染色体上其中一部分或全部的缺失，且所有个体体细胞中均存在，即每个细胞都有相同的缺失染色体区域。
原理：纯合性缺失可以由染色体发生结构变化，如染色体损害、环境诱导和遗传突变等引起。
检测方法：常用的检测方法包括：
-配对末端连接PCR：通过分析PCR扩增所得的DNA片段，确定是否存在缺失。
-染色体带分析：通过对染色体进行缺失区域的显带进行观察，确定是否存在缺失。
-比色图法：通过比较样品和对照基因的比色图，确定是否存在缺失。
3.点突变： 点突变是指基因序列中发生的单个碱基替代、插入或缺失引起的突变。
原理：点突变可以由突变原因如DNA复制错误、DNA损伤和环境诱导等引起。
检测方法：常用的检测方法包括：
- Sanger测序：通过测定基因序列，确定是否存在点突变。
-基因芯片：通过用特定探针和扩增反应检测点突变，确定是否存在点突变。
-实时定量PCR：通过测定PCR扩增曲线，确定是否存在点突变。
总结来说，杂合性缺失、纯合性缺失和点突变都是遗传突变类型，它们的原理和检测方法都不尽相同。对于这些突变的准确检测可以为疾病的预防、诊断和治疗提供重要参考。
【CN109666746A】用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日
(21)申请号 201910122381.3
(22)申请日 2019.02.19
(71)申请人 合肥欧创基因生物科技有限公司地址 230000 安徽省合肥市蜀山区高新区创新大道106号明珠产业园3#5层D区
(72)发明人 杨芳梅 吴萍 徐红梅 张慧贤
(74)专利代理机构 杭州裕阳联合专利代理有限公司 33289代理人 姚宇吉
(51)Int.Cl.C12Q 1/6886(2018.01)C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法(57)摘要本发明公开了一种用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法，引物、探针，包括：在如下ROS1基因融合突变位点的上游基因外显子：SLC34A2-exon4/13、CD74-exon5/6/7、SDC4-exon2/4、EZR-exon10、LRIG3-exon16、TPM3-exon5/8、TFG exon5及GOPC-exon4/8上分别设计上游引物；在ROS1exon 32/34/35/36上设计下游共用引物、分子信标探针和TaqMan-MGB探针，5’端标记物标记；以人类HBB基因为内控基因，设计特异性引物和TaqMan检测探针，5’端标记物标记；本发明使用特异引物、TaqMan-MGB和分子信标探针进行检测，使试剂盒灵敏度高，特异性高，
有效避免假阳性。权利要求书7页 说明书19页
序列表5页 附图5页CN 109666746 A2019.04.23
CN 109666746
A1.用于检测人类ROS1基因融合突变的引物、探针，其特征在于，包括：
在如下ROS1基因融合突变位点的上游基因外显子：SLC34A2-exon4/13、CD74-exon5/6/
7、SDC4-exon2/4、EZR-exon10、LRIG3-exon16、TPM3-exon5/8、TFG exon5及GOPC-exon4/8上
染色体微阵列检测报告
染色体微阵列检测报告
姓 名：
性 别：
出生日期：
检验日期：
送检单位：
临床诊断：
样本编号：
检验方法：
本检验采用Affymetrix CytoScan HD芯片进行染色体微阵列检测。
检验结果：
本次检测结果显示患者存在染色体异常，具体如下：
1. 13q31.3-q32.1区域缺失，大小为14.9 Mb，涉及基因296个；
2. Xp22.33-p22.31区域多余，大小为6.2 Mb，涉及基因2063个。
以上异常均已被报道为与智力障碍、发育迟缓等疾病相关的基因区域。
结 论：
根据本次染色体微阵列检测结果，患者存在13q31.3-q32.1区域缺失和Xp22.33-p22.31区域多余，建议结合临床表现综合分析，制定相应的诊疗方案。
附 语：
1. 本报告仅供临床医生参考，不得作为临床诊断的唯一依据；
2. 本报告数据仅供一次使用，未经本公司同意，不得进行复制、转载、传播等行为。
Y染色体微缺失检测指导
Y染色体微缺失分子检测在中国已开展多年，国内专家对AZF缺失模式、检测序列标签位点(sequence–tagged site, STS)的数量、检测方法和内部质量控制等临床问题未达成共识。各实验室的诊断操作方法有很大不同，导致不准确或错误诊断时有发生，迫切需要建立Y染色体微缺失诊断标准和质量控制标准。EAA/EMQN更新的2013版指南对以上问题都给出了明确的专家共识，对我国建立自己的检测指南有重要的指导意义。
一、Y染色体微缺失发生频率
Y染色体微缺失在健康人群中发生率约为1/4 000，但在不育男性中显着升高，微缺失发生频率为2%～10%(甚至更高)。2013版指南指出Y染色体微缺失在中国不育男性中发生频率为11.5%，处于较高水平。2006年朱晓斌等[1]针对中国不育男性染色体的研究表明AZF微缺失在非梗阻性无精子症患者中的发生率为9.94%，严重少精子症患者中发生率为5.82%，与国内外其他学者的研究基本一致。
随着微缺失分子机制的阐明和Y染色体男性特异区域的结构(MSY)测序完成，结合十多年临床数据分析，EAA专家总结沿用Repping等[2]对Y染色体微缺失区域的定义模式，分为：AZFa区缺失、AZFb区缺失、AZFbc区缺失和AZFc区缺失，认为只有该微缺失模式有明确的临床表现。国内外学者对AZFd区缺失是否存在一直存有争议。尽管发现在AZFb与AZFc两区域之间存在新的缺失位点(一些学者认为的AZFd区缺失)，但是该区域缺失没有明确的临床意义，也并非独立存在的缺失模式。所以第四区域AZFd区缺失仍存在较多争议。Müslümanolu等[3]在2005年的一项研究中指出AZFd缺失可能与精子形成有关，但仍缺乏有力的临床证据。2013年，陈科等[4]在精子正常和轻度少精子症患者中都发现了假定的AZFd区缺失。然而，至今为止AZFd区域尚未发现与精子生成相关的候选基因，其缺失所对应的临床表型还需进一步确认。
实时荧光定量PCR微卫星分析技术检测少突胶质细胞肿瘤染色体1p、19q和10q杂合性缺失
中国康复理论与实践 笙 ！鲞笙 塑 』垦！ ！ 塑！ ！ ！ ： ： ： ！！
实时荧光定量ＰＣＲ微卫星分析技术检测少突胶质
细胞肿瘤染色体ｌｐ、１９ｑ和１０ｑ杂合性缺失
苏江 ，江涛 ，孙振荣 ，李桂林 ，袁芳 ・基础研究・
［摘要］ 目的建立检测脑胶质瘤染色体Ｉｐ、１９ｑ和１０ｑ杂合性缺失（Ｌ０Ｈ）的实验室新方法。方法采用Ｔａｑｍａｎ探针法对３８ 例少突胶质细胞肿瘤标本进行染色体ｌｐ、１９ｑ和１０ｑ ＬＯＨ检测。结果３８例少突胶质细胞肿瘤染色体中有２５例（６５．７ ）发生Ｉｐ ＬＯＨ，２６例（６８．４ ）发牛１９ｑ ＬＯＨ，５例（１３．２ ）发生１０ｑ ＬＯＨ。结论实时荧光定量ＰＣＲ微卫星分析技术快速、准确性高，可以
用于脑胶质瘤标本染色体ＬＯＨ的检测。 ［关键词］少突胶质细胞瘤；杂合性缺失；聚合酶链反应
Ｌｏｓｓ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ ｉｎ Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ ｂｙ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＳＵ ＪｉⅡ＂ｇ，ＪＩＡＮＧ Ｔａｏ，ＳＵＮ Ｚｈｅｎ ｔｏｎｇ，ｅｔ ａ１．Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｐｉｔａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ
ｌ０００５０，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｅｔ ｕｐ ｔｈｅ ｎｅｗ ｌａｂ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ １Ｐ，１９ｑ ａｎｄ １０ｑ ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ（ＬＯＨ）ｉｎ ｇｌｉｏｍａ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｉｒｔｙ－ｅｉｇｈｔ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ ｗｅｒｅ ｅｎｒｏｌｌｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ．Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ １ Ｐ，１ ９ｑ ａｎｄ １０ｑ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ３８ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ，２５ ｃａｓｅｓ（６５．７ ）ｓｈｏｗｅｄ １Ｐ ＬＯＨ，２６ ｃａｓｅｓ（６８．４ ）ｓｈｏｗｅｄ １９ｑ ＬＯＨ，ｗｈｉｌｅ ５ ｃａｓｅｓ （１３．２％）ｓｈｏｗｅｄ ｌ０ｑ ＬＯＨ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ—ｂａｓｅｄ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｓ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｌ０Ｈ ｉｎ ｇｌｉｏｍａ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ；ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇ０ｓｉｔｙ；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ［中图分类号］Ｒ７３；Ｒ４４ ［文献标识码］Ａ ［Ｊｒ章编号］１００６ ９７７ｌ（２０１１）０２ ０１４ｌ ｏ４ ［本文著录格式］苏江，江涛，孙振荣，等．实时荧光定量ＰＣＲ微卫星分析技术检测少突胶质细胞肿瘤染色体１Ｐ、１９ｑ和】０ｑ杂 合性缺失［Ｊ］．中国康复理论与实践，２０１１，１７（２）：１４１ １４４．
【CN109825590A】肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日
(21)申请号 201910256744.2
(22)申请日 2019.04.01
(71)申请人 常州桐树生物科技有限公司地址 213149 江苏省常州市常州西太湖科技产业园长扬路9号B2栋2楼
(72)发明人 蔡微菁 严令华
(74)专利代理机构 上海元好知识产权代理有限公司 31323代理人 贾慧琴 刘琰
(51)Int.Cl.C12Q 1/6886(2018.01)C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物(57)摘要本发明公开了一种肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物，该方法包含：步骤1，设计扩增引物，对目的片段进行PCR扩增，获得含有单碱基突变检测位点的第一PCR产物及含有MSI检测位点的第二PCR产物；步骤2，对PCR产物进行纯化；步骤3，设计用于单碱基延伸反应的第一引物和第二引物；第一引物针对单碱基突变位点进行设计；第二引物3’端的若干个连续碱基与所述第二PCR产物3’端的碱基互补，并且对第二引物的3’端进行修饰，以阻止第二引物的延伸；步骤4，对第一引物及所述第二PCR产物进行单碱基延伸；步骤5，对单碱基延伸反应产物进行纯化；步骤6，对纯化后的单碱基
延伸反应产物进行联合检测。权利要求书2页 说明书14页
序列表7页 附图3页CN 109825590 A2019.05.31
CN 109825590
A1.一种肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法，其特征在于，包含以下
步骤：
步骤1，设计扩增引物，利用该扩增引物对目的片段进行PCR扩增，获得含有单碱基突变
检测位点的第一PCR产物及含有MSI检测位点的第二PCR产物；
步骤2，对步骤1获得的第一PCR产物及第二PCR产物进行纯化；