大肠杆菌_半乳糖苷酶ED和EA的克隆_表达及活性测定
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。
2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。
可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。
3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。
4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。
5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。
6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。
在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。
大肠杆菌K88ac菌毛操纵子fae全基因的克隆、表达及生物学活性初步研究
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［ ｓｒｃ 】０ ｊｃｉｅ ｏ ｃｏｅ ａｄ ｅｐｅｓ Ａｂｔａｔ ｂｅｔ ：Ｔ ｌｎ ｎ ｘ ｒｓ 血 ｖ
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系 黏 附 和 黏 附 抑制 实验 结 果 表 明重 组 Ｅ Ｐ茵和 野 生菌 株 一 样 具 有 较 强 的黏 附猪 小肠 上 皮 细 胞 系 的 能 力 ， 且 提 纯 重 组 茵 毛 而
制 备 出的 鼠 抗血 清 能有 效 抑 制 上 述 重 组 茵或 野 生 菌株 对 猪 小 肠 上 皮 细 胞 系 的 黏 附 结合 。
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［ 键 词 】 肠产 毒性 大 肠 杆 菌 ； ８ 关 Ｋ ８茵 毛 ｉ 结 构 基 因 ； 隆 ； 达 ； 物 活性 克 表 生
大肠杆菌的检测：大肠菌群测定的操作细则(中英文对照版)
大肠杆菌的检测:大肠菌群测定的操作细则大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1 设备和材料1.1 温箱:36±1℃。
1.2 冰箱:0~4℃。
1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。
1.4 天平。
1.5 显微镜。
1.6 均质器或乳钵。
1.7 平皿:直径为90mm。
1.8 试管。
1.9 吸管。
1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11 玻璃珠:直径约5mm。
1.12 载玻片。
1.13 酒精灯。
1.14 试管架。
2 培养基和试剂2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
2.6 生理盐水。
2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
3.1 检样稀释3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。
固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
β-半乳糖苷酶（LACZ）酶活测定
β-半乳糖苷酶（LACZ）酶活测定警示：在我们的手册中介绍的实验可能具有潜在的危险性，要求操作人员具有相当的安全训练、特殊装备、以及相关安全部门的监督。
作为实验操作员的你承担全部的责任、义务和由于实施安全步骤和措施带来的危险。
麻省理工大学没有责任、义务或承担由于实施本材料中内容所引起的危险。
法律声明β-半乳糖苷酶（LAC Z）酶活测定1. 在冰上解冻样品，同时准备裂解液（见下面关于裂解液样品的收集和准备的注意事项）。
2. 准备若干(至少每个样品3个和空白一支)透明的塑料比色皿，每支装有500μl的碳酸钠终止液。
你可以在比色皿上标明测试样品的名称和使用的时间。
3. 在微量离心试管中加入如下试剂：400μl 磷酸钠盐缓冲液（pH 7.5）133μl ONPG溶液6μl 镁离子溶液4. 把反应混合物放置在37°C的水浴中或者加热垫上预温育。
5. 一旦预热后，加入如下物质：60μl 细胞萃取物比较明智的做法是同时做阴性对照，即用抽提物或不表达β-半乳糖苷酶的细胞抽提物代替前述的细胞抽提物。
6. 留心观察每个反应试管里黄色（o-硝基酚）的出现，在适当的时间点，从每种反应混合物中等量移取100μl的溶液，把它加到装有碳酸钠终止液的比色皿中。
7. 当完成所有时间点测定后，在420 nm处测光密度，记录吸光值，并且计算吸光值与时间的斜率。
斜率和β-半乳糖苷酶的活性成正比。
注意：若在420nm处吸光值高于1.0，则不能采信。
8. 在计算其实际活性时，先制作o-硝基酚标准曲线图，然后根据样品的吸光值在曲线上找出对应的浓度。
一个酶活力单位是指酶在37oC每分钟可催化产生1 μmol的o-硝基酚。
收集和裂解细胞的注意事项细胞培养物的收集1. 在适当的培养时间，取出1.6 ml的培养物放入微量离心管中，并把它置于冰上。
2. 迅速将1.6 ml样品在涡旋混匀器上振荡，然后移出100μl放入已装有900 μL新鲜培养基的比色皿中。
凝结芽孢杆菌中β-半乳糖苷酶基因的克隆及表达
第３９卷㊀第６期２０１５年１１月南京林业大学学报（自然科学版）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．６Ｎｏｖ．，２０１５ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２００６．２０１５．０６．００７㊀收稿日期：２０１５－０３－２５㊀㊀㊀㊀修回日期：２０１５－０８－２５㊀基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（３１３００４８７，３１２００４４３）；江苏省自然科学基金青年项目（ＢＫ２０１３０９７０）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（ＰＡＰＤ）㊀第一作者：郑兆娟，讲师，博士㊂∗通信作者：欧阳嘉，教授㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｇｏｕｙｊ＠ｎｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ㊂㊀引文格式：郑兆娟，徐颖，石磊，等．凝结芽孢杆菌中β－半乳糖苷酶基因的克隆及表达［Ｊ］．南京林业大学学报：自然科学版，２０１５，３９（６）：３５－３９．凝结芽孢杆菌中β－半乳糖苷酶基因的克隆及表达郑兆娟，徐㊀颖，石㊀磊，欧阳嘉∗（南京林业大学化学工程学院，江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室，江苏㊀南京㊀２１００３７）摘要：从１株快速水解乳糖发酵产酸的凝结芽孢杆菌ＮＬ０１的基因组上克隆获得了１个新的β－半乳糖苷酶基因，该基因长度为１９９８ｂｐ，其编码的氨基酸序列与已经报道的β－半乳糖苷酶相似度低于４０％㊂将该β－半乳糖苷酶基因整合到表达载体ｐＥＴＤｕｅｔ－１上，并在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行重组表达，β－半乳糖苷酶粗酶酶活为１１９ ０μｍｏｌ／（ｍｉｎ㊃ｍｇ），经镍柱纯化获得的重组β－半乳糖苷酶酶活为６６６ ４μｍｏｌ／（ｍｉｎ㊃ｍｇ）㊂利用该重组β－半乳糖苷酶水解乳糖，经ＴＬＣ和ＨＰＬＣ分析显示该酶具有将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖的活力，是一种新型的β－半乳糖苷酶㊂关键词：凝结芽孢杆菌；β－半乳糖苷酶；表达纯化；乳糖水解中图分类号：Ｑ８１５；ＴＱ９３㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文献标志码：Ａ文章编号：１０００－２００６（２０１５）０６－００３５－０５Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＺＨＥＮＧＺｈａｏｊｕａｎ，ＸＵＹｉｎｇ，ＳＨＩＬｅｉ，ＯＵＹＡＮＧＪｉａ∗（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＪｉａｎｇｓｕＫｅｙＬａｂｏｆＢｉｏｍａｓｓ－ＢａｓｅｄＧｒｅｅｎＦｕｅｌｓａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００３７，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎｏｖｅｌβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＮＬ０１ｗｈｉｃｈｈａｄａｂｉｌｉｔｙｔｏｈｙｄｒｏｌｙｚｅｌａｃｔｏｓｅｉｎｔｏｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｇａｌａｃｔｏｓｅｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｇｅｎｅｗａｓ１９９８ｂｐ，ａｎｄｉｔｓｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓｈｏｗｅｄｖｅｒｙｌｏｗｉｄｅｎｔｉｔｙｗｉｔｈｏｔｈｅｒｒｅｐｏｒｔｅｄβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ．ＴｈｅｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＥＴＤｕｅｔ－１ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）．Ｔｈｅｃｒｕｄｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓ１１９．０μｍｏｌ／（ｍｉｎ㊃ｍｇ），ａｎｄｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓ６６６．４μｍｏｌ／（ｍｉｎ㊃ｍｇ）ａｆｔｅｒＮｉ－ＮＴＡｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｔｗａｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｐｒｏｄ⁃ｕｃｔｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｔｈａｔｔｈｉｓｎｏｖｅｌβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄｈｉｇｈａｃｔｉｖｉｔｙｔｏｗａｒｄｌａｃｔｏｓｅｃｏｎ⁃ｖｅｒｓｉｏｎｉｎｔｏｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｇａｌａｃｔｏｓｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ；β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｌａｃｔｏｓｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ㊀㊀β－半乳糖苷酶（ＥＣ３．２．１．２３８），学名为β－Ｄ－半乳糖苷半乳糖水解酶，常用名为乳糖酶，广泛存在于微生物㊁植物及哺乳动物的肠道中，能水解乳糖中的β－１，４－糖苷键，使其生成葡萄糖和半乳糖［１－３］㊂β－半乳糖苷酶广泛应用于乳制品行业，在液态奶类和乳制品加工过程中，加入β－半乳糖苷酶，使其消化为葡萄糖和半乳糖，相应的产品被称作低乳糖液态奶和低乳糖乳制品㊂低乳糖奶不仅可以满足正常消费者的需要，更可以满足乳糖不耐症者和先天性β－半乳糖苷酶缺乏者对乳制品中营养充分吸收的需要㊂β－半乳糖苷酶来源广泛，目前已经商品化的β－半乳糖苷酶主要来源于微生物，包括大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）㊁黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）㊁米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）㊁克鲁维酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）㊁脆壁酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ）等［４］，这些微生物的最适生长温度在３０ħ左右，其活性大多由常温β－半乳糖苷酶表征㊂目前市场上耐热β－半乳糖苷酶产品较少，耐热的β－半乳糖苷酶不仅能够有效降低生产工艺中微生物污染的风险，也能够提高反应速度，在乳品生产工艺中有显著优势，因此研究者们将对β－半乳糖苷酶的来源研究转向高温微生物［３，５］㊂凝结芽孢杆菌（Ｂａ⁃ｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）是经美国ＦＤＡ批准的一种 普遍南京林业大学学报（自然科学版）第３９卷认为安全（ＧｅｎｅｒａｌｌｙＲｅｃｏｇｎｉｚｅｄａｓＳａｆｅ） 的乳酸菌，其最适生长温度在５０ ５５ħ［６－８］㊂乳糖发酵实验表明，凝结芽孢杆菌具有快速水解乳糖发酵产酸的特性，但目前还没有来自凝结芽孢杆菌的β－半乳糖苷酶基因被克隆表达的报道㊂笔者参照Ｇｅｎ⁃Ｂａｎｋ中凝结芽孢杆菌基因组上假定的β－半乳糖苷酶基因信息，设计引物，通过ＰＣＲ技术从江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室保存的１株能以乳糖为唯一碳源的凝结芽孢杆菌ＮＬ０１中克隆获得了β－半乳糖苷酶基因，构建到原核表达载体ｐＥＴＤｕｅｔ－１上，在大肠杆菌表达宿主中高效诱导表达，并对重组蛋白的乳糖水解和转糖基活性进行了进一步的分析㊂１㊀材料与方法１．１㊀供试材料基因来源菌株Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓＮＬ０１㊁克隆宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉＭａｃｈ１－Ｔ１㊁表达宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）由江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室保存㊂克隆载体ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ㊁ＰＦＵＤＮＡ聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；表达载体ｐＥＴＤｕｅｔ－１购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司；限制性内切酶㊁Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；胰蛋白胨㊁酵母浸粉购自Ｏｘｏｉｄ公司；基因组提取试剂盒㊁质粒提取试剂盒和ＤＮＡ胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；乳糖㊁葡萄糖㊁半乳糖和邻硝基苯β－Ｄ－半乳吡喃糖苷（ｏＮＰＧ）购自Ｓｉｇｍａ公司；其他生化试剂为进口产品或国产分析纯产品㊂１．２㊀引物设计参考ＧｅｎＢａｎｋ中已完成全基因组注释的凝结芽孢杆菌３６Ｄ１（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＮＣ＿０１６０２３．１）和２－６（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＮＣ＿０１５６３４．１）的全基因组ＤＮＡ序列，应用Ｏｌｉｇｏ６引物设计软件设计上下游引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成㊂上游引物：５ᶄ－ＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＴＴＡＡＡＡＡＡＡ⁃ＣＡＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＡＴＴＡＴＧ－３ᶄ（斜体表示ＥｃｏＲＩ酶切位点，下划线部分表示起始密码子）㊂下游引物：５ᶄ－ＧＴＣＧＡＣＣＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＴＴＣＡ－３ᶄ（斜体表示ＳａｌＩ酶切位点，下划线部分表示终止密码子）㊂１．３㊀培养基及培养条件ＬＢ培养基包含胰蛋白胨１０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ，酵母浸粉５ｇ／Ｌ㊂必要时添加终质量浓度为１００μｇ／ｍＬ的氨苄青霉素，在３７ħ㊁２００ｒ／ｍｉｎ条件下振荡培养㊂凝结芽孢杆菌液体培养基为葡萄糖２０ｇ／Ｌ，酵母浸粉１０ｇ／Ｌ，在５０ħ㊁１００ｒ／ｍｉｎ条件下振荡培养㊂１．４㊀目的基因ＰＣＲ扩增、克隆及测序将培养至对数中期的凝结芽孢杆菌ＮＬ０１离心收集菌体，利用基因组提取试剂盒提取其全基因组，作为ＰＣＲ反应的模板㊂ＰＣＲ扩增体系为：５ˑＢｕｆｆｅｒ２０μＬ㊁ｄＮＴＰｓ１０μＬ㊁上下游引物各２μＬ㊁模板ＤＮＡ０．５μＬ㊁ＰＦＵＤＮＡ聚合酶２μＬ，用去离子水补充至总体积为１００μＬ㊂ＰＣＲ反应条件为：预变性９５ħ２ｍｉｎ；变性９５ħ２０ｓ㊁退火６０ħ２０ｓ㊁７２ħ１ｍｉｎ，３５个循环；７２ħ延伸１０ｍｉｎ㊂扩增产物经１％琼脂糖凝结电泳鉴定后，连接至ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ载体，转化Ｅ．ｃｏｌｉＭａｃｈ１－Ｔ１，在抗生素平板上挑选阳性克隆并提取重组质粒㊂将重组质粒命名为Ｂｌｕｎｔ－ｇａｌ，经双酶切验证后送上海华大基因科技有限公司测序㊂１．５㊀重组β－半乳糖苷酶的表达与纯化利用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ同时双酶切重组质粒Ｂｌｕｎｔ－ｇａｌ和表达载体ｐＥＴＤｕｅｔ－１，利用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接后转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３），在抗生素平板上挑选阳性克隆并提取重组质粒进行双酶切验证，将验证正确的重组菌株命名为Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＥＴＤｕｅｔ－ｇａｌ）㊂培养Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＥＴ⁃Ｄｕｅｔ－ｇａｌ）至ＯＤ６００ｎｍ值达到０．６时加入ＩＰＴＧ诱导表达剂，继续培养５ｈ㊂收集诱导表达的菌体，用生理盐水洗涤后重悬于结合缓冲液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠㊁５００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钠㊁２０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑，ｐＨ７．４）中，在冰水浴中用超声波破碎菌体，将破碎后的菌体离心，所得上清即为粗酶液㊂粗酶液通过Ｎｉ２＋亲和柱进行纯化，用不同梯度的洗脱缓冲液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠㊁５００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钠㊁５００ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑，ｐＨ７ ４）洗脱，收集目的蛋白组分，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测纯化效果㊂１．６㊀酶活及酶解产物分析方法１）β－半乳糖苷酶酶活测定方法：反应体系总体积为１ｍＬ，依次加入７００μＬ去离子水，１００μＬ５００ｍｍｏｌ／ＬｐＨ７．０的磷酸钾缓冲液，１００μＬ２０ｍｍｏｌ／Ｌ的ｏＮＰＧ，先３７ħ水浴５ｍｉｎ后，再加入１００μＬ经适当稀释的酶液，混匀后３７ħ温水浴１０ｍｉｎ，立即加入２ｍＬ０．５ｍｏｌ／Ｌ的Ｎａ２ＣＯ３终止反应㊂用分光光度计测量４１０ｎｍ处的吸光值，由测得的吸光值根据ｏＮＰＧ标准曲线确定ｏＮＰＧ的生成量，定义１ｍｉｎ水解生成１μｍｏｌｏＮＰＧ所需酶量为１个活力单位［９］㊂采用Ｂｒａｎｄｆｏｒｄ法以牛血清蛋６３㊀第６期郑兆娟，等：凝结芽孢杆菌中β－半乳糖苷酶基因的克隆及表达白作为标准品测定蛋白浓度［１０］㊂２）ＴＬＣ法分析酶解产物：将反应混合物点样于硅胶薄板，用正丁醇㊁乙醇㊁水以体积比为５ʒ３ʒ２作为展层剂，置于层析缸中展开㊂配置０．５％（ｗ／ｖ）的３，５－二羟基甲苯溶于２０％的浓硫酸中作为显色剂，１０５ħ加热１０ｍｉｎ显色［１１］㊂３）ＨＰＬＣ法分析酶解产物：采用Ａｇｉｌｅｎｔ１２００型高效液相色谱仪，ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ－８７液相色谱柱，以５ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸为流动相，流速为０．６ｍＬ／ｍｉｎ，柱温５５ħ，示差折光检测㊂２㊀结果与分析２．１㊀β－半乳糖苷酶基因的ＰＣＲ扩增、克隆与测序结果㊀㊀提取凝结芽孢杆菌ＮＬ０１的基因组ＤＮＡ，经琼脂糖凝胶电泳检测显示其条带单一，基因组没有降解，可以作为后续ＰＣＲ实验的模板㊂以凝结芽孢杆菌ＮＬ０１基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增得到β－半乳糖苷酶全基因，约２０００ｂｐ㊂将该扩增条带连接至ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ后转化Ｅ．ｃｏｌｉＭａｃｈ１－Ｔ１，从抗性筛选平板上选取６个转化子，进一步提取重组质粒Ｂｌｕｎｔ－ｇａｌ并双酶切（ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ）验证，结果如图１所示，其中５号转化子在３９００ｂｐ和２０００ｂｐ附近出现条带，说明此转化子含有正确质粒，送样测定核苷酸序列㊂图１㊀重组质粒Ｂｌｕｎｔ－ｇａｌ的双酶切验证Ｆｉｇ．１㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄＢｌｕｎｔ⁃ｇａｌｂｙｄｉｇｅｓｔｉｏｎ㊀㊀注：泳道１ ６的重组质粒来自６个不同转化子㊂Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｐｌａｓｍｉｄｓｆｏｒｌａｎｅ１ｔｏ６ａｒｅｆｒｏｍｓｉｘｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｃｏｍｂｉ⁃ｎａｎｔｓｔｒａｉｎｓ．２．２㊀β－半乳糖苷酶序列分析来源于凝结芽孢杆菌ＮＬ０１的β－半乳糖苷酶基因序列全长１９９８ｂｐ，ＧｅｎＢａｎｋ，登录号为ＫＭ２１６７５１，编码６６５个氨基酸，分子质量为７６ｋｕ，等电点为６．１㊂根据Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ建立的糖苷水解酶家族分类方法，β－半乳糖苷酶分属于糖苷水解酶家族ＧＨ－１㊁ＧＨ－２㊁ＧＨ－３５和ＧＨ－４２（ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ）［１２－１３］㊂目前已经分离纯化鉴定的β－半乳糖苷酶多来源于ＧＨ－２和ＧＨ－３５家族［１－３，１４－１９］，该研究中的β－半乳糖苷酶属于ＧＨ－４２家族㊂由氨基酸序列的同源性比对发现，该蛋白与目前已经报道的微生物来源的β－半乳糖苷酶（例如来源于Ｌａｃ⁃ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓＡＴＣＣ１１８４２（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＷＰ＿００３６１９６３２）［１４］㊁ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅＢ５（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＡＢＢ７３０３９）［１５］㊁Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｅｘ⁃ｐａｎｓｕｍＦ３（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＡＣＤ７５８２１）［１６］㊁Ｂａ⁃ｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ２－３７－４－１（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＡＢＮ１３６７５）［１７］和两种土壤未培养微生物（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＡＤＤ６９７８５和ＡＦＤ２１８４４）［１８－１９］）的相似性都低于４０％；与凝结芽孢杆菌３６Ｄ１和２－６基因组上注释的假定β－半乳糖苷酶同源性均大于９０％㊂同源性比对数据说明此次研究中来源于凝结芽孢杆菌ＮＬ０１中的β－半乳糖苷酶是一个新型的β－半乳糖苷酶，该酶在不同凝结芽孢杆菌菌株中普遍存在㊂２．３㊀重组表达质粒ｐＥＴＤｕｅｔ－ｇａｌ的构建选择具有强启动子的ｐＥＴＤｕｅｔ－１为表达载体，构建重组表达质粒ｐＥＴＤｕｅｔ－ｇａｌ㊂用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ同时双酶切ｐＥＴＤｕｅｔ－１和Ｂｌｕｎｔ－ｇａｌ，回收相应片段后连接并转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３），从抗性筛选平板上选取５个转化子，进一步提取重组质粒ｐＥＴＤｕｅｔ－ｇａｌ并双酶切（ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ）验证，结果如图２所示，其中４号和５号转化子在５４００ｂｐ和２０００ｂｐ附近出现条带，说明此转化子含有正确质粒㊂图２㊀重组质粒ｐＥＴＤｕｅｔ－ｇａｌ的双酶切验证Ｆｉｇ．２㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＥＴＤｕｅｔ－ｇａｌｂｙｄｉｇｅｓｔｉｏｎ㊀㊀注：泳道１ ５的重组质粒来自于５个不同转化子㊂Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｐｌａｓｍｉｄｓｆｏｒｌａｎｅ１ｔｏ５ａｒｅｆｒｏｍｆｉｖｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｃｏｍ⁃ｂｉｎａｎｔｓｔｒａｉｎｓ．７３南京林业大学学报（自然科学版）第３９卷２．４㊀重组β－半乳糖苷酶的诱导与纯化结果重组目的蛋白的Ｎ端具有Ｈｉｓ标签，便于融合蛋白纯化㊂将诱导表达的重组菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＥＴＤｕｅｔ－ｇａｌ）经超声波破碎后，利用镍柱对重组β－半乳糖苷酶进行纯化，结果如图３所示㊂由图３可知，诱导蛋白分子质量约为７０ｋｕ，与目的蛋白大小相符㊂粗酶比酶活为１１９．０μｍｏｌ／（ｍｉｎ㊃ｍｇ），纯酶比酶活为６６６．４μｍｏｌ／（ｍｉｎ㊃ｍｇ），纯化倍数为５．６倍㊂图３㊀重组β－半乳糖苷酶的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．３㊀ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ㊀㊀注：泳道Ｍ为标准蛋白分子质量，ｋｕ；泳道１为含有质粒ｐＥＴＤｕｅｔ－１的重组大肠杆菌诱导后的破碎液；泳道２为含有质粒ｐＥＴＤｕｅｔ－ｇａｌ的重组大肠杆菌诱导后的破碎液；泳道３为纯化的重组β－半乳糖苷酶㊂Ｎｏｔｅ：Ｍ．ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；ｌａｎｅ１．ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅｅｘｔｒａｃｔｏｆＢＬ２１（ＤＥ３）ｈａｒｂｏｒｉｎｇｐＥＴＤｕｅｔ－１；ｌａｎｅ２．ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅｅｘｔｒａｃｔｏｆＢＬ２１（ＤＥ３）ｈａｒｂｏｒｉｎｇｐＥＴＤｕｅｔ－ｇａｌ；ｌａｎｅ３．ｐｕｒｉｆｉｅｄβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ．２．５㊀重组β－半乳糖苷酶水解产物的ＴＬＣ和ＨＰＬＣ法分析㊀㊀用５０ｍｍｏｌ／Ｌ㊁ｐＨ６．０的磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液配置２０ｇ／Ｌ的乳糖溶液，加入５μｍｏｌ／（ｍｉｎ㊃ｇ）的β－半乳糖苷酶，５５ħ下反应６０ｍｉｎ后，沸水浴加热使其停止反应，对水解液产物进行ＴＬＣ分析，结果见图４㊂从图４可以看出，样品中的乳糖完全被降解为葡萄糖和半乳糖㊂同时，以４０ｇ／Ｌ的乳糖为底物，加入过量β－半乳糖苷酶酶液在５０ħ下反应，２ｈ后以ＨＬＰＣ检测反应结果，ＨＰＬＣ结果显示乳糖剩余量为０．７ｇ／Ｌ，葡萄糖和半乳糖的生成量分别为１９ ７ｇ／Ｌ和１９ ５ｇ／Ｌ㊂ＴＬＣ和ＨＰＬＣ数据都说明该研究中被克隆的基因确为β－半乳糖苷酶基因㊂β－半乳糖苷酶具有两种活性，即水解活性和转糖基活性，不同来源的β－半乳糖苷酶的这两种活性差异较大㊂水解活性高的β－半乳糖苷酶主要用于水解牛奶等乳制品中的乳糖，而转糖基活性高图４㊀酶水解乳糖产物的ＴＬＣ图Ｆｉｇ．４㊀ＴＬＣｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｌａｃｔｏｓｅ㊀㊀注：泳道１ ３分别为乳糖㊁半乳糖㊁葡萄糖标准品；泳道４为乳糖水解后样品㊂Ｎｏｔｅ：ｌａｎｅ１．ｓｔａｎｄａｒｄｌａｃｔｏｓｅ；ｌａｎｅ２．ｓｔａｎｄａｒｄｇａｌａｃｔｏｓｅ；ｌａｎｅ３．ｓｔａｎｄａｒｄｇｌｕｃｏｓｅ；ｌａｎｅ４．ｓａｍｐｌｅｏｆｌａｃｔｏｓｅａｆｔｅｒｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．的β－半乳糖苷酶主要用于低聚半乳糖的合成㊂例如，陆文伟等［２０］分析了来自于发酵乳杆菌的β－半乳糖苷酶，其ＴＬＣ结果除了检测到半乳糖和葡萄糖外，还检测到了相应的低聚半乳糖，在不同条件下该酶都具有较强的转糖基活性㊂Ｎｇｕｙｅｎ等［１４］克隆了来自保加利亚乳杆菌ＤＳＭ２００８１的β－半乳糖苷酶基因并在植物乳杆菌中进行表达分析，其水解和转糖基实验表明该酶也是以转糖基活性为主㊂与上述β－半乳糖苷酶相比，该研究中来源于凝结芽孢杆菌的β－半乳糖苷酶以水解活性为主，同时考虑其耐高温的特性，该酶在乳品生产工艺中具有显著优势㊂３㊀结㊀论１）从凝结芽孢杆菌ＮＬ０１基因组ＤＮＡ上扩增得到β－半乳糖苷酶基因，长１９９８ｂｐ㊂该β－半乳糖苷酶属于糖苷水解酶ＧＨ－４２家族，与已经报道的其他微生物来源的β－半乳糖苷酶相似性低于４０％㊂２）以大肠杆菌为表达宿主，利用表达质粒ｐＥＴＤｕｅｔ－１成功异源表达了具有生物活性的β－半乳糖苷酶，并利用镍柱纯化获得电泳纯的重组蛋白，纯酶比酶活为６６６．４μｍｏｌ／（ｍｉｎ㊃ｍｇ）㊂参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）：［１］ＭｌｉｃｈｏｖａＺ，ＲｏｓｅｎｂｅｒｇＭ．Ｃｕｒｒｅｎｔｔｒｅｎｄｓｏｆβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅａｐ⁃ｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｆｏｏｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄａｎｄＮｕｔｒｉｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ，２００６，４５（２）：４７－５４．［２］ＰａｒｋＡＲ，ＯｈＤＫ．Ｇａｌａｃｔｏ⁃ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｕｓｉｎｇｍｉ⁃ｃｒｏｂｉａｌβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ：ｃｕｒｒｅｎｔｓｔａｔｅａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ［Ｊ］．Ａｐ⁃８３㊀第６期郑兆娟，等：凝结芽孢杆菌中β－半乳糖苷酶基因的克隆及表达ｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，８５（５）：１２７９－１２８６．［３］ＡｎｓａｒｉＳＡ，ＳａｔａｒＲ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｓ⁃Ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔａｎｄｆｕｔｕｒｅ：Ａｍｉｎｉｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＣａ⁃ｔａｌｙｓｉｓＢ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２０１２，８１：１－６．［４］ＰａｎｅｓａｒＰＳ，ＰａｎｅｓａｒＲ，ＳｉｎｇｈＲＳ，ｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆβ－Ｄ⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，８１（４）：５３０－５４３．［５］董艺凝，陈海琴，刘小鸣，等．耐热β－半乳糖苷酶的研究进展［Ｊ］．食品工业科技，２０１２，３３（１）：３８４－３８７．ＤｏｎｇＹＮ，ＣｈｅｎＨＱ，ＬｉｕＸＭ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｓ［Ｊ］．ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＦｏｏｄＩｎｄｕｓｔｒｙ，２０１２，３３（１）：３８４－３８７．［６］ＯｕｙａｎｇＪ，ＭａＲ，ＺｈｅｎｇＺＪ，ｅｔａｌ．ＯｐｅｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＬ－ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂｙＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ｓｔｒａｉｎＮＬ０１ｕｓｉｎｇｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｅｓａｓｌｏｗ⁃ｃｏｓｔｒａｗｍａｔｅｒｉａｌ［Ｊ］．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，１３５：４７５－４８０．［７］张刚．乳酸细菌－基础㊁技术和应用［Ｍ］．北京：化学工业出版社，２００７．ＺｈａｎｇＧ．Ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ⁃ｂａｓｉｃ，ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙＰｒｅｓｓ，２００７．［８］凌代文，东秀珠．乳酸细菌分类鉴定及实验方法［Ｍ］．北京：中国轻工业出版社，１９９９．ＬｉｎｇＤＷ，ＤｏｎｇＸＺ．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｅｔｈｏｄ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＣｈｉｎａＬｉｇｈｔＩｎｄｕｓｔｒｙＰｒｅｓｓ，１９９９．［９］ＳｕｎＸＪ，ＤｕａｎＸＧ，ＷｕＤ，ｅｔａｌ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｍｕｔａｎｔＦ４４１ＹｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＳｃｉｅｎｃｅｏｆＦｏｏｄａｎｄＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，２０１４，９４：１３５９－１３６５．［１０］ＢｒａｄｆｏｒｄＭＭ．Ａｒａｐｉｄａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｇｒａｍｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｕｔｉｌｉｚｉｎｇｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎ⁃ｄｙｅｂｉｎｄｉｎｇ［Ｊ］．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７６，７２：２４８－２５４．［１１］ＬｉＺＹ，ＸｉａｏＭ，ＬｕＬＬ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｎｏｎ⁃ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅａｎｄｈｉｇｈ⁃ｐｕｒｉｔｙｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｂｙｉｍｍｏ⁃ｂｉｌｉｚｅｄｅｎｚｙｍｅｃａｔａｌｙｓｉｓａｎｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｙｅａｓｔｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，４３（８）：８９６－８９９．［１２］ＨｅｎｒｉｓｓａｔＢ，ＢａｉｒｏｃｈＡ．Ａｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｌｙｃｏｓｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅｓｂａｓｅｄｏｎａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＪ，１９９１，２８０：３０９－３１６．［１３］ＨｅｎｒｉｓｓａｔＢａｉｒｏｃｈＡ．Ｎｅｗｆａｍｉｌｉｅｓｉｎｔｈｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｌｙｃｏｓｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅｓｂａｓｅｄｏｎａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏ⁃ｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，１９９３，２９３：７８１－７８８．［１４］ＮｇｕｙｅｎＴＴ，ＮｇｕｙｅｎＨＡ，ＡｒｒｅｏｌａＳＬ，ｅｔａｌ．Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｆｒｏｍＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓＤＳＭ２００８１：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２，６０（７）：１７１３－１７２１．［１５］ＬｕＬＬ，ＸｉａｏＭ，ＬｉＺＹ，ｅｔａｌ．Ａｎｏｖｅｌｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｎｇβ－ｇａｌ⁃ａｃｔｏｓｉｄａｓｅｆｒｏｍＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅＢ５［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，４４（２）：２３２－２３６．［１６］ＬｉＹＭ，ＬｕＬＬ，ＷａｎｇＨＭ，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆａβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｆｏｒｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，７５（１８）：５９３８－５９４２．［１７］ＬｉＹＭ，ＷａｎｇＨＭ，ＬｕＬＬ，ｅｔａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ⁃ｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｗｉｔｈｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ２－３７－４－１［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，１５８（１）：１９２－１９９．［１８］ＷａｎｇＫ，ＬｉＧ，ＹｕＳＱ，ｅｔａｌ．Ａｎｏｖｅｌｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ⁃ｄｅｒｉｖｅｄβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ：ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇ，ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，８８（１）：１５５－１６５．［１９］ＺｈａｎｇＸ，ＬｉＨ，ＬｉＣＪ，ｅｔａｌ．Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｔｈｅｉｓｏ⁃ｌａｔｉｏｎｏｆａｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｗｉｔｈｈｉｇｈｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｇａ⁃ｌａｃｔｏｓｅａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｆｒｏｍｓｏｉｌｓａｍｐｌｅｓｏｆＴｕｒｐａｎＢａｓｉｎ［Ｊ］．ＢＭＣＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１３：２３７．［２０］陆文伟，孔文涛，孔健，等．发酵乳杆菌β－半乳糖苷酶转糖基活性研究［Ｊ］．山东大学学报：理学版，２００８，４３（７）：８３－８７．ＬｕＷＷ，ＫｏｎｇＷＴ，ＫｏｎｇＪ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｂｅｔａ⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍＫ４［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２００８，４３（７）：８３－８７．（责任编辑㊀刘昌来）９３。
大肠埃希菌的检验原理
大肠埃希菌的检验原理
大肠埃希菌的检验原理主要是基于大肠埃希菌能够产生酶、产生特定代谢产物以及具有一定生理特征等方面进行检测。
1. 酶的检测：大肠埃希菌能够产生β-半乳糖苷酶和大肠埃希菌酶等酶。
常用方法是利用含有染色底物的培养基，如培养基中加入苔藓素和半乳糖时，大肠埃希菌能够分解底物产生酶，使底物变色。
这样可以通过颜色变化来判断培养基中是否存在大肠埃希菌。
2. 代谢产物的检测：大肠埃希菌在产酸过程中会产生大量的氢离子，降低培养基的pH值，可以使用酚红指示剂来检测pH值的变化。
另外，大肠埃希菌还会产生气体，如二氧化碳和氢气，在含有较少营养物质的培养基上可以形成气泡。
这些变化可以作为大肠埃希菌存在的判断依据。
3. 生理特征的检测：大肠埃希菌有一些特有的生理特征，如能够产生胆红素，对产酸、反应pH等均有一定特殊性。
对大肠埃希菌进行生理生化反应、鉴定和分析可以通过不同试剂和培养基来进行。
综合上述三个方面的检测方法，能够较准确地鉴定出是否存在大肠埃希菌。
当然，最常用的方法是利用尿液或食物中的大肠埃希菌进行培养，并在培养基上观察酶活性、产酸、产气等特征变化。
酶底物法(科立得)检测总大肠菌和大肠埃希 菌(或粪大肠菌)技术参数
酶底物法（科立得）检测总大肠菌群和粪大肠杆菌（或大肠埃希菌）一、适用范围：用于水样中的总大肠菌群和粪大肠杆菌（或大肠埃希菌）的同步定量分析。
二、工作环境：(a)室内使用：环境温度 -10°C～50°C(b)电源供给：220V±10%，50HZ(c）相对湿度：25%～85%，无凝结三、原理：1，大肠菌群细菌能特异性产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），该生物酶可以分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，β-半乳糖醛苷），使培养液呈黄色。
（注：检测粪大肠菌的培养温度为44.5°C;检测总大肠菌的培养温度为：36±1℃）2，大肠埃希氏菌能特异性产生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase），分解MUG（4-甲基-伞形葡萄糖苷酸，4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）,使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光。
利用该原理，来判断水样中是否含有大肠菌群及大肠埃希氏菌（或粪大肠菌）。
四、仪器技术参数：1、国产程控定量封口机# 技术指标性能（1）可靠性无漏液，无破孔（2）噪音 <50 dba @ 2 ft.（3）重量 <17公斤.（4）处理速度 <15秒/样品（5）预热时间 <15分钟（6）加热温度(内辊) 200°C +/- 10°C（7）外罩温度 <40°C（8）工作电压 220V±10%（9）工作环境温度 -10°C～50°C（10）带51孔及97孔定量盘橡胶托垫2、紫外灯（1）6W 365 nm长波紫外灯，含灯管.（2）尺寸：(9 cm x 7 cm x 27 cm)（3）电源：220V四、技术参数指标：（1）量程范围： 0－200个/100mL 或0－2419个/100mL（2）绝对检出限：0个（3）培养基：ONPG-MUG（4）样品体积： 100mL（5）检测周期： 24小时五、系统配置及性能指标：本配置能够简单快捷地同时测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群（或大肠埃希菌）；应包括所有能正常分析的仪器设备及消耗品：1 、消耗品：应能保证1000个水样常规检测所需的消耗品（1）DST酶底物法24小时Colilert试剂（ ONPG-MUG培养基）：200个/盒；（2）取样瓶：独立密封包装；（3）定量盘：51孔或97孔；2 、程控定量封口机（带51孔及97孔定量盘橡胶托垫）；3 、6瓦特紫外灯，220v，366nm；。
β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达
。枯草芽孢杆菌是一
种传统的酶制剂工业生产菌株， 其遗传背景清楚， 蛋白 分泌机制健全， 生长迅速， 培养简便， 其细胞壁结构简 单， 不分泌 内 毒 素， 可直接将表达产物分泌到培养基 中， 具有较 好 的 生 物 安 全 性， 是美国食品药物管理局 （ Ｆ Ｄ Ａ ） 和中国农业部批准使用的安全菌株， 也是分泌
４ ２ ０ ｎ ｍ的 Ａ值， 以Ａ 值为纵坐标， 酶的活性单位为横坐 ４ ２ ０ 标， 采用 Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ １ ０ 软件绘制标准曲线。样品中酶活性测定
２ ０ ０ ８ ， ２ ８ （ ５ ）
陈晓月 等：β 半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达 ?
１ １ ３
２ ． ２ β 半乳糖苷酶的表达和检测 ? ２ ． ２ ． １ 固体培养基中 β 半乳糖苷酶活性检测 阳性 ? ｇ ａ ｌ 的氯霉素琼脂 菌和阴性对照菌分别划线于含有 Ｘ ? ３ ７ ℃避光培养 ２ ４ｈ 后， 为充分显色， 将平板置 ４ ℃ 平板， 避光放置过夜。取出培养板观察， 可见阳性重组菌的 菌落呈现明显的蓝色， 而阴性对照菌的菌落仍为乳白 色， 没有出现颜色变化（ 图２ ａ ， ２ ｂ ） 。 ２ ． ２ ． ２ 液体培养基中 β 半乳糖苷酶的检测 液体培 ? 养基中， 每培养 ２ ｈ 取１ ｍ ｌ 细菌培养液， １ ２ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ 离心， 分别收集上清和菌体沉淀， － ２ ０ ℃保存备用。采用 β 半 ? 乳糖苷酶活性检测试剂盒分别检测培养液上清和菌体裂 解液在 ４ ２ ０ ｎ ｍ的 Ａ值， 根据标准曲线得出相应的酶的活 标注误表示（ 表１ ） 。同时设立携 性。结果采用平均值 ± 带空载体 ｐ Ｇ Ｐ Ｓ Ｔ的 Ａ Ｓ １ ７ ０ ０ 为阴性对照组（ 图３ ） 。
DH5α大肠杆菌克隆菌株
产品信息：
货号
名称
产品形式
规格
储存
P1435
DH5α Strain
100μl
-20℃
基因型：
F-φ80 lac ZΔM15 Δ(lacZYA-arg F) U169 endA1 recA1 hsdR17(rk-,mk+) supE44λ- thi -1 gyrA96 relA1 phoA
基本信息：
抗性：无
培养基：LB
菌株类别：大肠杆菌克隆菌
培养条件：37℃，有氧，LB
质粒转化：42℃热激
保存方式：20%甘油，-20℃
基本应用：用于基因克隆
备注：
菌株简介：
DH5α菌株是实验室最常用的菌株。缺失核酸内切酶(endA)，提高了质粒DNA的产量和质量；重组酶缺陷型(recA)减少插入片段的同源重组概率，保证了插入DNA的稳定性；DH5α在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和DH5α编码的lacZ△M15相结合，从而显示β-半乳糖苷酶活性(α-互补性)，使DH5α可用于蓝、白斑筛选。DH5α可以用于制作基因库、进行亚克隆，同时于DH5α具有deoR变异，可以作为较大质粒的宿主菌使用。DH5α菌株的缺点是生长缓慢，37℃需培12-14小时才能看见克隆。
β-半乳糖苷酶的诱导合成
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在环境中没有乳糖或其他 - 半乳糖苷时， 大肠杆菌合成 -半乳糖苷酶量极少，加入乳糖 2-3 分钟后，细菌大量合成 - 半乳糖苷酶，其 量可提高千倍以上，在以乳糖作为唯一碳源时， 菌体内的 -半乳糖苷酶量可占到细菌总蛋白量 的3%。
在上述二阶段生长细菌利用乳糖再次繁殖前， 也能测出细菌中 -半乳糖苷酶活性显著增高的 过程。
在环境没有乳糖存在的情况下， R 形成分 子量为 152,000 的活性四聚体，能特异性与操 纵区ｏ紧密结合，从而阻止利用乳糖的酶类基 因的转录，所以R是乳糖操纵子的阻遏蛋白；
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当环境中有足够的乳糖时，乳糖与R结合， 使R的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失 去与操纵区特异性紧密结合的能力，从而解除 了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合 成利用乳糖的酶类。
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虽然不同的启动子序列有所不同，但比较 已经研究过的上百种原核生物的启动子的序列， 发现有一些共同的规律，它们一般长 40-60bp， 含 A-T bp 较多，某些段落很相似的，有保守性， 称为共有性序列(consensus sequences)。 启动子一般可分为识别 (R ， recognition) 、 结合 (B ， binding) 和起始 (I ， initiation) 三个 区段。
2. 操纵子的基本组成
乳糖操纵子模型已被许多研究实验所证 实，对其有了更深入的认识，并且发现其他 原核生物基因调控也有类似的操纵子组织， 操纵子是原核基因表达调控的一种重要的组 织形式，大肠杆菌的基因多数以操纵子的形 式组成基因表达调控的单元。
下面就以乳糖操纵子为例子说明操纵子 的最基本的组成元件（elements）。
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[文章编号] 16712587Ⅹ(2010)0120040205
[收稿日期] 2009210228[基金项目] 吉林省科技厅重点项目资助课题(2006041721,2008043521);吉林省长春市科技局计划项目资助课题(长科技合2008254号,08YJ37
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[作者简介] 许淑芬(1963-),女,吉林省长春市人,副主任技师,主要从事免疫与分子生物学实验技术的研究。[通信作者] 谭 岩(Tel:0431285668196,E2mail:tanyan49@hotmail1com)
大肠杆菌β2半乳糖苷酶ED和EA的克隆、表达及活性测定许淑芬,刘 磊,孙牧男,赵 帅,方艳秋,谭 岩(吉林大学第一医院中心实验室,吉林长春130021)
[摘 要] 目的:制备大肠杆菌β2半乳糖苷酶(β2galactosidae)酶供体(ED)和酶受体(EA)片段,获得具有全酶活性的β2半乳糖苷酶。方法:以pSV2β2galactosidasecontrolvector为模板设计引物,用PCR方法获得ED和EA片段DNA序列,插入克隆载体pGEM2T2easy中,获得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段分别插入原核表达载体pET20b
+
,并转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导表达出ED、EA融合
蛋白,以亲和层析纯化蛋白,通过ED与EA蛋白形成β2半乳糖苷酶、全酶活性试验来判断ED、EA的功能。结果:获得与pSV2β2galactosidasecontrolvector一致的ED、EA碱基序列,构建了重组表达质粒pET20b2ED及pET20b2EA,并分别转化入大肠杆菌DE3,以IPTG诱导行SDS2PAGE电泳,在相对分子质量为14000及116000处分别可见ED蛋白和EA蛋白条带,应用镍凝胶亲和层析纯化获得目的蛋白。结论:成功地制备了ED、EA蛋白,形成全酶活性的β2半乳糖苷酶。[关键词] β2半乳糖苷酶;酶受体;酶供体;免疫测定[中图分类号] R69613;Q78 [文献标志码] A
Cloning,expressionandactivityassayofED/EAofβ2galactosidaseinE1coli
XUShu2fen,LIULei,SUNMu2nan,ZHAOShuai,FANGYan2qiu,TANYan(CentralLaboratory,FirstHospital,JilinUniversity,Changchun130021,China)
Abstract:Objective Toobtainrecombinantenzymedonor(ED)andenzymeacceptor(EA)fragmentsofβ2galactosidaseinE1coliandestablishnewclonedenzymedonorimmunoassays(CEDIA)forclinicaluse1
Methods TheencodingsequencesofEDandEAfragmentswereamplifiedwithpSV2β2galactosidasecontrolvectorastemplateandinsertedintopGEM2Teasyvector,thetargetgenewaschosenbydoubledigestion,PCRandsequencing,thenEDandEAfragmentswereinsertedintotheexpressionvectorpET20b+1Thecompetentcellsof
hoststrainofBL21weretransformedbytherecombinantplasmid.TheexpressionofthetargetproteinwasinducedwithIPTGandpurifiedbyNi2+2NTAagarosecolumn.Theβ2galactosidaewithactivityisformed.Results The
clonedfragmentsofEDandEAwere100%consistentwiththatofpSV2β2galactosidasecontrolvector.TheexpressionvectorpET20b2EDandpET20b2EAwereconstructedandexpressed.ThetargetproteinwaspurifiedbyNi2+2NTAagarosecolumn.Theexpressedfusion2proteinEDfragmentwas14000andEAfragmentwas116000in
SDS2PAGEasexpected.Conclusion EDandEAproteinsarepreparedsuccessfullyandβ2galactosidasewithactivityisformed.Keywords:β2galactosidase;enzymeacceptor;enzymedonor;immunoassay
04第36卷 第1期2010年1月吉 林 大 学 学 报 (医 学 版)JournalofJilinUniversity(MedicineEdition)Vol.36No.1 Jan.2010 美国学者[122]对β2半乳糖苷酶(β2galactosidase)的结构及α2互补特性进行了很多的基础性研究,其中α2受体和α2供体是CNBr2及M15蛋白。此后有学者提出的酶供体(enzymedonor,ED)、和酶受体(enzymeacceptur,EA)蛋白对都是在此基础上设计的。Henderson等[3]在1986年利用基因工程技术生产大肠杆菌β2半乳糖苷酶EA和ED,并利用其α2互补功能创立了克隆ED免疫分析技术。大肠杆菌β2半乳糖苷酶(E1C131211123)是由4个相同亚基组成的四聚体。每一个亚基可分成大小2个片段,大片段被称为EA,小片段被称为ED。每种片段在分开时没有酶活性,但当两者在一起时就可以形成β2半乳糖苷酶亚基,进而聚合成具有酶活性的四聚体。β2半乳糖苷酶的EA、ED这种α2互补性己被广泛用于分子生物学研究、蛋白质与蛋白质相互作用的研究、克隆ED均相免疫分析技术等[326]。本实验室在上述研究的基础上,制备了EA、ED蛋白,并在体外获得了β2半乳糖苷酶全酶活性,为进一步开展克隆酶供体免疫测定(clonedenzymedonorimmunoassay,CEDIA)技术检测小分子蛋白研究提供实验基础。1 材料与方法111 主要材料 大肠杆菌JM109、DH5α(本室保存),原核表达质粒pET20b+(TransGenBiotech公司),AMV、pGEM2T2easy载体(promega公司,美国),限制性核酸内切酶NocⅠ、SalⅠ、T4DNA连接酶(Takara公司),Trizol试剂(Ivitrogen公司),镍离子亲和层析柱(Ni2+2NTA)(Qiagen公司),质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒(Vitagene公司)。112 寡核苷酸引物设计与合成 以PSV2β2galactosidasecontrolvector为模板设计两对引物:P1,5′2GCCCATGGCCGTAGTTTTACAACG23′;P2,5′2TGTCGACTTAACAACCGTGCATCTG2CCA23′;P3,5′2TAACCATGGATCGCCCTTC2CCAACAATTGCGCAGC23′;P4,5′2CGCGGTC2GACTTATTTTTGACACCACACCAACTGG23′(划线部分为酶切位点)。委托大连宝生物工程公司合成。113 PCR扩增及测序 以pSV2β2galactosidasecontrolvector为模板,以P1、P2引物扩增ED片段,PCR参数:94℃预变性5min,94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸1min,30个循环;72℃终延伸10min。以P3、P4引物扩增EA片段,PCR参数:94℃预变性5min;94℃变性90s,55℃退火90s,72℃延伸2min,30个循环;72℃终延伸15min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并分别回收PCR产物,将纯化后的PCR产物克隆至pGEM2T2easy载体,获得克隆质粒pGEM2T2ED和pGEM2T2EA,分别转化大肠杆菌感受态细菌JM109,经过蓝白筛选、酶切鉴定、PCR鉴定初筛阳性克隆菌株,委托大连宝生物工程公司测序。114 重组表达载体的构建 将测序正确的重组克隆质粒和表达质粒pET20+分别进行双酶切和凝胶回收处理,切取的ED、EA片段经T4DNA连接酶插入pET20b
+
,构建出重组表达质粒pET20b2
ED、pET20b2EA,将重组表达质粒转化大肠杆菌DE3感受态细胞,经抗生素耐药性筛选、酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性克隆。115 ED和EA菌株的诱导表达 阳性克隆菌接种于LB固体培养基,挑选4个重组菌单菌落分别接种于2mLLB液体培养基,37℃、60r・min-1振摇过夜,次日以1∶50接种于2mLLB液体培养基中,37℃、230r・min-1振荡培养至A600值为016时,加入终浓度为1mmol・L-1的IPTG诱导
培养5h,继续培养4h,4℃、12000g离心1min,收集菌体,进行SDS2PAGE电泳。116 ED和EA蛋白纯化 诱导200mL阳性表达菌液,离心收集菌体沉淀,加入超声裂解液,
-70℃反复冻融3次,离心上清4℃保存,得到的包涵体用变性裂解缓冲液重悬。分别对裂解上清和包涵体进行SDS2PAGE电泳,经镍凝胶亲和层析法纯化目的蛋白。117 ED和EA形成β2半乳糖苷酶全酶活性测定 采用微量反应板法,总体积为200μL,含011mol・L-1PBS(pH710),1mmol・L-1MgSO4,5mmol・L-1DTT,1g・L-1ONPG,不同浓度的EA/ED蛋白,37℃反应,在不同时间读取A404值。
2 结 果211 ED和EA基因片段的克隆及测序结果 PCR扩增电泳结果见图1(ED约260bp)及图2(EA
约2940bp),测序结果与PSV2β2galactosidase
controlvector比较有98%的同源性,氨基酸无变化。212 重组表达质粒鉴定 构建出重组表达质粒
14许淑芬,等1 大肠杆菌β2半乳糖苷酶ED和EA的克隆、表达及活性测定