wb转膜条件公式
WB操作步骤及经验
1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O 至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/L Tris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL 调节PH值，而不用Tris.CL。
5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH太低时，聚合反应受到抑制。
AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。
PH8.39、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水至总量1L。
WB操作步骤-自己整理
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法）人工肝实验室学习姚瑶（一）目的蛋白提取：（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。
2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。
共洗三次，每次十分钟。
3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。
4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。
（可不做）5、4℃，12000转离心10min。
6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。
（2）组织中总蛋白的提取：1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。
冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。
3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定：1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。
2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。
3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。
4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。
5、37℃水浴30min。
6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。
7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。
（三）SDS-PAGE电泳：（1）清洗玻璃板（2）灌胶与上样：1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
wb的基本原理和操作流程
wb的基本原理和操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!一、基本原理WB 是一种用于检测蛋白质的技术，其基本原理是通过电泳将蛋白质从细胞或组织中分离出来，然后将其转移到膜上，再用特异性抗体检测膜上的蛋白质。
参考westernblotting
Western blot原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因1.双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。
在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。
硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。
双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。
双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。
干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。
可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
2.Lowry法：此法是双缩脲法的进一步发展。
小麦植物样本wb操作流程
小麦植物样本wb操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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wb转膜时间过长条带的变化
wb转膜时间过长条带的变化
WB（Western blotting，蛋白质印迹法）转膜时间过长可能会导
致条带出现一些变化，具体变化可能因实验条件和蛋白质的性质而异，但通常会出现以下情况：
1. 条带变弱或消失：转膜时间过长可能导致蛋白质从凝胶中迁移
到膜上的效率降低，从而使条带的强度变弱或完全消失。
2. 条带扩散：如果转膜时间过长，蛋白质可能会在膜上扩散，导
致条带变宽，清晰度降低。
3. 背景增加：转膜时间过长可能会增加非特异性结合，导致背景
噪音增加，使目标条带的识别变得困难。
为了获得最佳的结果，转膜时间通常需要根据实验条件和蛋白质
的特性进行优化。
一般来说，转膜时间应该在适当的范围内，以确保
蛋白质有效地转移到膜上，同时尽量减少条带的扩散和背景噪音。
如果你发现转膜时间过长导致条带异常，可以尝试缩短转膜时间、优化转膜缓冲液的成分、调整蛋白上样量等方法来改善结果。
同时，也要确保其他实验步骤的准确性，如凝胶电泳、抗体孵育等，以获得可靠的 Western blotting 结果。
WB原理流程 ppt课件
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20
背景太高
原因
膜没有均匀浸湿 2. 膜或者缓冲液污染 3. 封闭不充分 4. 抗体与封闭剂出现交 叉反应 5. 抗体浓度过高
1. 1. 2.
对 策
3. 4.
转膜前用转移缓冲液将膜 完全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
细胞裂解液： 0.5ml水+0.5ml裂解液+10μl蛋白酶抑制剂+ 10μl 泛酸钠+ 1μl pepstain
有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。
通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
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5
蛋白样品制备的注意事项：
细胞数量达5×106个时就可以做WB。 将细胞裂解液再离心，收集上清液，加 loading煮样5min
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺
30%（29:1） SDS（10%） Tris-HCL 四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸铵形成自由基而加速丙烯
酰胺和双丙烯酰胺的聚合）
（Arc-Bis）。
过硫酸铵(APS)（提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由 基）
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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项：
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抗体保存注意事项：
1.收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装和保存！ 2.对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在 -200C。 2.1 分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于 10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到 蒸发以及管壁吸附的影响。 2.2 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液 保存在40C，避免再冻起来！ 2.3 绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。 3.大部分抗体收到后40C短暂保存1-2周对抗体活性是没有影 响的。 4.长期保存，加入叠氮纳，防止细菌污染 任何时候，绝对避免反复冻融！
WB操作步骤-自己整理
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法）人工肝实验室学习姚瑶（一）目的蛋白提取：（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。
2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。
共洗三次，每次十分钟。
3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。
4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。
（可不做）5、4℃，12000转离心10min。
6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。
（2）组织中总蛋白的提取：1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。
冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。
3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定：1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。
2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。
3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。
4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。
5、37℃水浴30min。
6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。
7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。
（三）SDS-PAGE电泳：（1）清洗玻璃板（2）灌胶与上样：1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
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wb转膜条件公式
摘要：
1.WB 转膜的概述
2.WB 转膜的条件公式
3.WB 转膜的实际应用
正文：
一、WB 转膜的概述
WB（Western Blot）转膜是一种常用的生物技术实验方法，主要用于将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳转移到尼龙膜上。
这一过程是蛋白质研究、表达和检测的关键步骤，为后续的蛋白质鉴定和分析提供了重要的基础。
二、WB 转膜的条件公式
WB 转膜的条件公式通常包括以下几个关键因素：
1.转膜液：转膜液的成分和浓度对蛋白质的转移效率至关重要。
一般采用含有20% 甲醇、7% 醋酸和1%SDS 的缓冲液作为转膜液。
2.转膜时间：转膜时间与蛋白质的大小、电泳分辨率以及转膜液的浓度等因素有关。
通常情况下，转膜时间为60-90 分钟。
3.转膜温度：适宜的转膜温度有利于蛋白质的快速转移。
一般采用40-50℃的恒温箱进行转膜。
4.电压：适当的电压可以保证蛋白质在电场作用下快速转移。
通常电压设置为100-200V。
5.尼龙膜：尼龙膜的选择对蛋白质的转移效果和检测灵敏度有很大影响。
常用的尼龙膜有PVDF、硝化纤维素等。
三、WB 转膜的实际应用
WB 转膜在生物科学研究中具有广泛的应用，主要包括：
1.蛋白质表达水平分析：通过比较不同实验组和对照组的蛋白质转膜结果，可以评估蛋白质表达水平的差异。
2.蛋白质亚基分析：通过转膜实验可以检测蛋白质亚基的存在和相对比例。
3.蛋白质修饰分析：WB 转膜可以用于检测蛋白质的翻译后修饰，如磷酸化、糖基化等。
4.蛋白质互作研究：通过转膜实验可以筛选与目标蛋白质相互作用的蛋白质。
总之，WB 转膜作为蛋白质研究中的关键技术手段，其条件公式的掌握对于实验的成功与否至关重要。