外标法标样配制
归一化法、外标法、内标法的区别
色谱定量方法一、归一化法由于组分的量与其峰面积成正比，如果样品中所有组分都能产生信号，得到相应的色谱峰，那么可以用如下归一化公式计算各组分的含量。
(7.34)若样品中各组分的校正因子相近，可将校正因子消去，直接用峰面积归一化进行计算。
中国药典用不加校正因子的面积归一化法测定药物中各杂质及杂质的总量限度。
(7.35)归一化法的优点是：简便、准确、定量结果与进样量重复性无关(在色谱柱不超载的范围内)、操作条件略有变化时对结果影响较小。
缺点是：必须所有组分在一个分析周期内都流出色谱柱，而且检测器对它们都产生信号。
不适于微量杂质的含量测定。
二、外标法用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法。
此法可分为工作曲线法及外标一点法等。
工作曲线法是用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。
在完全相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液，根据待测组分的信号，从标准曲线上查出其浓度，或用回归方程计算，工作曲线法也可以用外标二点法代替。
通常截距应为零，若不等于零说明存在系统误差。
工作曲线的截距为零时，可用外标一点法(直接比较法)定量。
外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中i组分的含量。
将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样，测得峰面积的平均值，用下式计算样品中i组分的量：W＝A(W)／(A)(7.36)式中W与A分别代表在样品溶液进样体积中所含i 组分的重量及相应的峰面积。
(W)及(A)分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面积。
外标法方法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量。
但此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。
此外，为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。
三、内标法选择样品中不含有的纯物质作为对照物质加入待测样品溶液中，以待测组分和对照物质的响应信号对比，测定待测组分含量的方法称为内标法。
色谱定量分析内标法与外标法的对比
色谱定量分析内标法与外标法的对比色谱分析的重要作用之一是对样品进行定量，而色谱法定量的依据是组分的重量或在载气中的浓度与检测器的响应信号成正比。
常见定量分析方法有面积归一化法、内标法、外标法、标准曲线法。
大家容易傻傻分不清楚的莫过于内标法和外标法了，下面我们从定义、特点等方面剖析一下它们的异同和优点。
一、内标法1.定义内标法是一种间接或相对的校准方法。
在分析测定样品中某组分含量时，选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物（内标物是样品中没有的组分），然后配制欲测组分和内标物的混合标准溶液，进样得相对校正因子。
再将内标物加入欲测组分的样品中，进样后测得欲测组分和内标物的定量参数。
2.内标物内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。
使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱柱所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。
采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。
理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质（如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等）、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。
当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。
3.选择内标物的四个要求（1）内标物应是该试样中不存在的纯物质；（2）它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离；（3）加入内标物的量应接近于被测组分；（4）色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。
4.影响因素在使用内标法定量时，影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。
由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。
化学方面的因素（1）内标物在样品里混合不好；（2）内标物和样品组分之间发生反应；（3）内标物纯度可变等。
内标法外标法
一、内标法什么叫内标法?怎样选择内标物?内标法是一种间接或相对的校准方法。
在分析测定样品中某组分含量时,加入一种内标物质以校准和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响,以提高分析结果的准确度。
内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。
使用内标法时,在样品中加入一定量的标准物质,它可被色谱柱所分离,又不受试样中其它组分峰的干扰,只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值,即可求出待测组分在样品中的百分含量。
采用内标法定量时,内标物的选择是一项十分重要的工作。
理想地说,内标物应当是一个能得到纯样的已知化合物,这样它能以准确、已知的量加到样品中去,它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征,最好是被分析物质的一个同系物。
当然,在色谱分析条件下,内标物必须能与样品中各组分充分分离。
需要指出的是,在少数情况下,分析人员可能比较关心化合物在一个复杂过程中所得到的回收率,此时,他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化合物作内标,来测定感兴趣化合物的百分回收率,而不必遵循以上所说的选择原则。
在使用内标法定量时,有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的比值?影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。
由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。
化学方面的因素包括:1、内标物在样品里混合不好;2、内标物和样品组分之间发生反应,3、内标物纯度可变等。
对于一个比较成熟的方法来说,色谱方面的问题发生的可能性更大一些,色谱上常见的一些问题(如渗漏)对绝对面积的影响比较大,对面积比的影响则要小一些,但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度,那么一定有某个重要的色谱问题存在,比如进样量改变太大,样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别,检测器非线性等。
外标法定量(“曲线”相关文档)共6张
问题：能否配制相同浓度的标样，以不同体积进
样，绘制A（h）～V曲线？
仪器分析技术
任务资讯
• 以待测组分纯品为对照物，与试样中待测组分的响
• 应信号相比较进行定量的方法。
• 特点：①不需要校正因子，不需要所有组分出峰；
结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大。 • ② 外标二点法：用两个标准溶液代替标准系列。
仪器分析技术
问题：能否配制相同浓度的标样，以不同体积进
外若标标• 工 准作曲a曲线.线不的通工绘过制原作点，曲则说明线存在法系统：误差纯。 品→工作曲线，同体积样品与之比较 浓度c。前提是进入检测器样品量与峰面积成正比: A=kc (理 若标准曲线不通过原点，则说明存在系统误差。
吸收分光光度法中所学习过“标准曲线法”完全类似。 问题：能否配制相同浓度的标样，以不同体积进
想)；A=b+kc (实际)。 前提是截距为0，对照品浓度与待测组分浓度接近
吸收分光光度法中所学习过“标准曲线法”完全类似。
②特结点• 果 ：受①b进不.样需外量要、校进正标样因重子一复，性不点和需操要法作所条有：件组影分一响出大峰个。； 标准溶液浓度对比样品中待测组分含量 。 工A=作b+曲kc线(法实：际前纯)。品提→工是作曲截线，距同体为积样0品，与之对比较照浓度品c。 浓度与待测组分浓度接近
标准曲线的斜率即为绝对校正因子 以待测组分纯品为对照物，与试样中待测组分的响
若标• 准曲c线. 不通外过原标点，二则说明点存在法系统：误差用。 两个标准溶液代替标准系列。前提是选取
两点对照品的浓度，需c涵样 盖 待AA样 标测浓c标度。
仪器分析技术
A=b+kc (实际)。 特点：①不需要校正因子，不需要所有组分出峰； 工作曲线法：纯品→工作曲线，同体积样品与之比较浓度c。 问题：能否配制相同浓度的标样，以不同体积进 外标工作曲线的绘制 ②结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大。 前提是截距为0，对照品浓度与待测组分浓度接近 问题：能否配制相同浓度的标样，以不同体积进 ②结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大。 以待测组分纯品为对照物，与试样中待测组分的响
归一化法、外标法、内标法的区别
色谱定量方法一、归一化法由于组分的量与其峰面积成正比，如果样品中所有组分都能产生信号，得到相应的色谱峰，那么可以用如下归一化公式计算各组分的含量。
(7.34)若样品中各组分的校正因子相近，可将校正因子消去，直接用峰面积归一化进行计算。
中国药典用不加校正因子的面积归一化法测定药物中各杂质及杂质的总量限度。
(7.35)归一化法的优点是：简便、准确、定量结果与进样量重复性无关(在色谱柱不超载的范围内)、操作条件略有变化时对结果影响较小。
缺点是：必须所有组分在一个分析周期内都流出色谱柱，而且检测器对它们都产生信号。
不适于微量杂质的含量测定。
二、外标法用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法。
此法可分为工作曲线法及外标一点法等。
工作曲线法是用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。
在完全相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液，根据待测组分的信号，从标准曲线上查出其浓度，或用回归方程计算，工作曲线法也可以用外标二点法代替。
通常截距应为零，若不等于零说明存在系统误差。
工作曲线的截距为零时，可用外标一点法(直接比较法)定量。
外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中i组分的含量。
将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样，测得峰面积的平均值，用下式计算样品中i组分的量：W＝A(W)／(A)(7.36)式中W与A分别代表在样品溶液进样体积中所含i 组分的重量及相应的峰面积。
(W)及(A)分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面积。
外标法方法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量。
但此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。
此外，为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。
三、内标法选择样品中不含有的纯物质作为对照物质加入待测样品溶液中，以待测组分和对照物质的响应信号对比，测定待测组分含量的方法称为内标法。
液质联用外标法和内标法
液质联用外标法和内标法
液质联用技术是一种高效的分析方法，广泛应用于生物、医药、环
境等领域。
在液质联用技术中，外标法和内标法是常用的两种定量方法。
本文将从原理、优缺点、应用等方面介绍液质联用外标法和内标法。
一、外标法
外标法是指在样品中加入已知浓度的标准物质，通过比较标准物质和
样品中目标物质的响应值，计算出目标物质的浓度。
外标法的优点是
简单易行，适用于大多数分析物。
但是，外标法的缺点是受到样品制备、仪器响应等因素的影响，容易产生误差。
二、内标法
内标法是指在样品中加入已知浓度的内标物质，通过比较内标物质和
目标物质的响应值，计算出目标物质的浓度。
内标法的优点是可以消
除样品制备、仪器响应等因素的影响，提高分析结果的准确性。
但是，内标法需要选择合适的内标物质，且内标物质的浓度应与目标物质的
浓度相近，否则会影响分析结果。
三、应用
液质联用外标法和内标法在生物、医药、环境等领域都有广泛的应用。
例如，在药物代谢动力学研究中，可以使用外标法和内标法测定药物
在体内的浓度变化；在环境监测中，可以使用外标法和内标法测定水
中有机污染物的浓度等。
总之，液质联用外标法和内标法是常用的定量方法，各有优缺点，应
根据实际情况选择合适的方法。
在实际应用中，还需要注意样品制备、仪器响应等因素对分析结果的影响，以提高分析结果的准确性。
单点外标法计算公式
单点外标法计算公式RF应该是校正值.外标法的公式应该是：含量（cx）=crAx/Ar其中：cx为样品浓度；cr为对照浓度；Ax为样品峰面积；Ar为对照峰面积。
外标法是与内标法相对，指添加一定量的标准品（对照品）于空白检材中制成对照样品，与未知检材平行地进行样品处理并检测，根据对照样品响应值与其中所添加标准品（对照品）浓度的函数关系推算未知检材中被测组分浓度的定量方法。
例如，在色谱法中，想知道被测样品浓度。
可以用外标法首先用待测组份的标准样品绘制工作曲线，测出各峰的峰高或峰面积对应的样品浓度，绘制出标准曲线。
实际应用时，测出峰高或峰面积对应标准曲线，就可以得到样品浓度。
扩展资料：外标法在操作和计算上可分为校正曲线法和用校正因子求算法。
校正曲线法是用已知不同含量的标样系列等量进样分析，然后做出响应信号与含量之间的关系曲线，也就是校正曲线。
定量分析样品时，在测校正曲线相同条件下进同等样量的等测样品，从色谱图上测出峰高或峰面积，再从校正曲线查出样品的含量。
校正因子求算法是将标样多次分析后得到响应信号与其含量求出它的绝对校正因子，再根据公式求出待测样品中的含量。
内标法与外标法的比较：外标要求仪器重复性很严格，适于大量的分析样品，因为仪器随着使用会有所变化，因此需要定期进行曲线校正。
此法的特点是操作简单，计算方便，不需测量校正因子，适于自动分析。
但仪器的重现性和操作条件的稳定性必须保证，否则，会影响实验结果。
内标法要求挺严格的，对于内标物的选择要有一定的原则，适于分析样品量较少的情况；不要求样品里的所有组分都出峰，只要内标物和所关注的组分出峰并分离好就可以了；定量准确，对进样量和操作条件的控制不很严格，但必须准确称量试样和内标物，否则会影响实验结果。
Waters-AccqTag-方法
4.1 测算样品用量
表 4-1 列出用 AccQ·Tag 方法水解和分析的样品用量
表 4-1 样品的用量
样品
样品用量*
蛋白质
0.1~5.0 μg
4~200pmol
肽
0.02~1.0 μg 20~1000pmol
*注：基于蛋白质的平均分子量＝25000，肽的平均分子量＝1000。
4.2 水解样品
对于多数蛋白质来说，气体酸水解是最有效的水解方法，这是一种避免来自水解用酸污 染的最佳方法。
配制方法（图 2-1）如下： 1、将加热装置预热至 55℃， 2、在打开 2A 瓶之前，轻轻敲击，确保所有的 AccQ·Fluor 试剂粉末全部落在瓶底， 3、由 2B 瓶中吸取 1ml AccQ·Fluor 稀释剂并放掉，以清洗微量移液管，
注意：乙腈是易燃和有毒的化学试剂，使用时注意安全防护措施。 4、吸取 1mlAccQ·Fluor 稀释剂放入装有 AccQ·Fluor 衍生剂粉末的 2A 瓶中，加
在清洁的自动进样瓶中加入 40μL 内标储备液、40μL Waters 水解氨基酸标样和 920μL Milli-Q 水，混匀(图 3-3)。
此含内标物的校正标样中含各种氨基酸均为 100 pmol/μL(含胱氨酸为 50 pmol/μL，相 当于含半胱氨酸 100 pmol/μL)。
图 3-3 制备含内标物的校正标样
盖密封， 5、旋涡震荡 10 秒钟， 6、在加热装置上加热 2A 瓶，直至 AccQ·Fluor 衍生剂粉末全部溶解。加热时间不
超过 10 分钟。
图 2-1 配制 AccQ •Fluor 衍生剂
保存
配制好的 AccQ·Fluor 试剂在干燥器中于室温下保存一周。 AccQ·Fluor 试剂能与环境湿气反应，不用时注意密封。
HPLC外内标法测定含量
测定
(1)安装C18。反相柱，按仪器操作说明依次打开色谱仪各单元的电源。 (2)色谱条件：C18一ODS色谱柱(5um，4．6 mm×250 mm)；流动相 比例：乙腈一0．1％磷酸水(20：80，V／V)；流动相流速：1．0 mL／ min；检测波长：273 nm。 (3)换上流动相，待基线稳定后，采用进样器依次吸取浓度分别为 0．016、0．08、0．16、0．4、0．8 g／L扑热息痛和0．02、0．10、 0．20、0．50、1．0 g／L阿司匹林、内标物咖啡因浓度为0．2 g／L的 5种混合对照品溶液各10uL进样，待组分色谱峰出完后，按“停止”键 停止分析。记录各色谱峰面积(保留时间、峰面积)，以对照品峰面积与 内标物峰面积之比为纵坐标(y)，以浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，进 行回归分析，求扑热息痛和阿司匹林的线性方程。 (4)采用进样器吸取供试品溶液10uL，进样，通过保留时间确定扑热息 痛、阿司匹林、咖啡因色谱峰的位置，记录扑热息痛、阿司匹林、咖啡 因色谱峰面积(保留时间、峰面积)，并计算待测样品溶液中扑热息痛、 阿司匹林的含量。
测定
(1)安装C18反相柱，按仪器操作说明依次打开色谱仪各单元的电源。 (2)色谱条件。C18一ODS色谱柱(53um，4．6 mm×250 mm)；流动相 比例：甲醇-0．5％冰乙酸水(1：1)；流动相流速：1．0 mL／min；检 测波长：238 nm。 (3)换卜流动相，待基线稳定后，采用进样器依次吸取浓度分别为 0．004，0．02，O．04，0．1，0．2，0．4 g／L的栀子苷对照品溶 液各10仙L进样，待组分色谱峰出完后，按“停止”键停止分析。记录 栀子苷色谱峰面积(保留时间、峰面积)，以栀子苷进样浓度(g／L)为横 坐标，色谱峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归分析。 (4)采用进样器吸取栀子样品溶液10¨L，进样，通过保留时间确定栀子 苷色谱峰的位置，记录栀子苷色谱峰面积(保留时间、峰面积)，并计算 栀子药材中栀子苷的含量。
【气相色谱定量分析方法】
【气相色谱定量分析方法】一、归一化法当试样中所有组分都能流出色谱柱，且在色谱图上都显示色谱峰时，建议你用归一化法计算组分含量。
所谓归一化法是以样品中被测组分经校正过的峰面积（或峰高）占样品中各组分经校正过的峰面积（或峰高）之和的比例来表示样品中各组分的含量的定量方法。
设试样中有几个组分，各组分的质量分别为m1、m2……m n在一定条件下测得各组分峰面积分别为A1、A2、……A n，则组分i的质量分数W i可按下式计算：式中各组分的校正因子均采用相对质量校正因子。
若试样中组分是同分异构体或同系物，各组分f<’值很接近，可以不用校正因子，将面积直接归一化，这样式5-28可简化为：（5-29）当色谱峰狭窄，峰形对称，操作条件稳定，各组分色谱半峰宽不变时，建议你用峰高归一化法计算组分含量，即：（5-30）式中f i'(h)为峰高校正因子，必须自行测定，测定方法与峰面积校正因子相同。
归一化法简便、准确，进样量的多少与测定结果无关，操作条件的变化对结果影响也较小，但如果试样中的组分不能全部出峰，则不能采用这种方法。
二、内标法若试样中所有组分不能全部出峰；或只要求测定试样中某个或某几个组分的情况时，你可以考虑采用内标法定量。
所谓内标法就是将一定量选定的标准物（称内标物S）加入到一定量试样中，混合均匀后，在一定操作条件下注入色谱仪，出峰后分别测量组分i和内标物S的峰面积（或峰高），按下式计算组分i的含量。
（5-31）式中、分别为组分i和内标物S的质量校正因子；A i、A s分别为组分i 和内标物S的峰面积。
也可以用峰高代替面积，则：(5-32)式中、分别为组分i和内标物S的峰高校正因子。
内标法中，常以内标物为基准，即=1.0则式5-31可以写为：(5-33)式（5-32）可改为：(5-34)内标法的关键是选择合适的内标物，对于内标物的要求是：１．应是试样中不存在的纯物质；２．内标物的性质应与待测组分性质相近，以使内标物的色谱峰与待测组分色谱峰靠近并与之完全分离；３．内标物与样品应完全互溶，但不能发生化学反应；４．内标物加入量应接近待测组分含量。
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外标法标样配制
1、 目的：检测单品出峰时间，保存单品色谱图原始数据。
2、 原理：外标法测定。
3、 实验仪器和器皿：
① 气相色谱仪
② 天平
③ 100ml 容量瓶 5 个、10ml 移液管 4 根、烧杯 10ml 5 个、
玻璃棒 5 根、滤纸、洗耳球、滴管。
4、 实验步骤
① 配制母液：取一干燥 100ml 容量瓶，称重，去皮；秤取样
品约 1g， 结果精确到 0.0001g； 用甲醇稀释至刻度；容量瓶
贴上标签 1。
② 取一支干燥的 10ml 移液管、100ml 烧杯一个，将母液倒入
50ml 至 100ml 的烧杯，用母液润洗移液管 2～3 次；用润洗后
的移液管移 取 10ml 母液至一干燥的 100ml 容量瓶中，用甲醇
稀释至刻度；容 量瓶贴上标签 2。
③ 重复②的步骤，移取 2 号容量瓶 10ml 至一干燥的 100ml
容量瓶， 用甲醇稀释至刻度；容量瓶贴上标签 3。
④ 重复②的步骤，移取 3 号容量瓶 10ml 至一干燥的 100ml
容量瓶， 用甲醇稀释至刻度；容量瓶贴上标签 4。
⑤ 重复②的步骤，移取 4 号容量瓶 10ml 至一干燥的 100ml
容量瓶， 用甲醇稀释至刻度；容量瓶贴上标签 5。
5、 计算
5.1 母液：秤取样品质量为 Mg，稀释至 100ml； M*10 3 mg /
(100*10 -3)L=M*10 4 ppm
5.2 2号容量瓶：M*10 4 ppm *（10/100）= M*10 3 ppm
以此类推至 5 号溶液
3 号溶液：M*10 2 ppm ，
4 号溶液：M*10 1 ppm ,
5 号溶液： M ppm 。
6、气相色谱的检测
6.1 取 6 个干燥的气相色谱样品瓶，编号“空”、“1、2、3、4、5”；
空瓶中用甲醇润洗后装入甲醇,1、2、3、4、5 样品瓶里装入配
制的标 液 1、2、3、4、5，将所有样品瓶装入色谱仪内，用外
标法进行测定。
6.2 打印色谱图，记录样品出峰时间，纯度。