谷胱甘肽亲和色谱介质的制备及对谷胱甘肽硫转移酶蛋白的纯化.
谷胱甘肽原料
谷胱甘肽原料1. 简介谷胱甘肽（glutathione）是一种由三个氨基酸（谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸）组成的小分子多肽。
它在生物体中广泛存在，具有重要的生理功能和抗氧化作用。
谷胱甘肽起着维持细胞内氧化还原平衡的关键作用，可清除自由基、减轻氧化应激、排除体内毒素，对维持细胞正常代谢和减轻疾病病程具有重要意义。
2. 谷胱甘肽的生物合成谷胱甘肽在生物体内主要靠两种酶来合成：谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase）和γ-谷胱甘肽转肽酶（γ-glutamylcysteine synthetase）。
谷胱甘肽合成酶将谷氨酸和半胱氨酸反应生成γ-谷胱氨酸，然后γ-谷胱氨酸再和甘氨酸反应生成谷胱甘肽。
在合成过程中，谷胱甘肽还受到一些调控机制的影响。
例如，正常情况下，细胞内的谷胱甘肽浓度较高时，谷胱甘肽合成酶会受到负反馈抑制，从而减少谷胱甘肽的生物合成。
另外，细胞内氧化应激状态的改变也会对谷胱甘肽的合成产生影响。
3. 谷胱甘肽的生理功能3.1 抗氧化作用谷胱甘肽是细胞内最重要的抗氧化剂之一，可通过捕捉自由基、还原羟基自由基和过氧自由基来保护细胞免受氧化损伤。
同时，谷胱甘肽还能够还原受氧化的维生素C和维生素E，使其重新恢复抗氧化活性。
3.2 解毒作用谷胱甘肽能与一些有毒物质结合，形成相对稳定的化合物，从而降低其毒性。
谷胱甘肽还能促进有毒物质的代谢和排除，帮助清除体内的废物和有害化合物。
3.3 免疫调节作用谷胱甘肽可以调节免疫细胞的活性，增强巨噬细胞的吞噬功能、增强T细胞的杀伤功能和增强NK细胞的活性，从而提高机体对抗感染和肿瘤的能力。
3.4 抗衰老作用谷胱甘肽能够调节细胞的DNA合成和修复，减缓DNA的氧化损伤，维护细胞的正常功能。
此外，谷胱甘肽还能通过影响细胞信号传导、减少细胞凋亡等机制，延缓细胞老化。
4. 谷胱甘肽的应用谷胱甘肽作为一种重要的药物和保健品原料，在医学、食品、化妆品等领域有广泛应用。
谷胱甘肽-琼脂糖凝胶 4B（GST 标签纯化树脂）说明书
谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B （GST 标签纯化树脂）说明书货号：P2020规格：5mL/10mL/25mL/50mL保存：4℃保存，有效期至少一年。
产品简介：pGEX 载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽S-转移酶融合，因此可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。
GSTs 是一类以谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）作为底物，通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。
由于GST 对底物的亲和力是亚毫摩尔级的，因此谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST 及其融合蛋白的纯化效率很高。
可以用含游离谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合GST 融合蛋白。
树脂用3mol/L NaCl 的缓冲液再生。
谷胱甘肽琼脂糖对GST 融合蛋白的结合能力很强（每毫升柱床体积的树脂能结合8毫克融合蛋白）。
特性:粒度：45-165µm流速：75cm/h 工作PH ：4-10耐压：0.3Mpa载量：＞5mg 谷胱甘肽S-转移酶使用说明：谷胱甘肽树脂的处理:1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆。
2.取部分匀浆放入15mL 聚丙烯管（每100mL 细菌培养物大约需要2mL 匀浆）。
3.4℃500g 离心5分钟，小心去掉上清。
4.在树脂中加入10倍柱床体积预冷的PBS ，颠倒数次混匀，4℃500g 离心5分钟，小心去掉上清。
5.每毫升树脂加入1毫升冷的PBS ，制成50%匀浆，颠倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用。
制备细胞抽提物：6.每100毫升培养物的细胞沉淀重悬于4mL PBS 缓冲液中。
7.加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL,冰上放置30分钟。
8.用针筒将10mL 浓度为0.2%的TritonX-100强行注入黏稠的细胞裂解物中，剧烈振动数次混匀。
加入DNase 和RNase 至终浓度5ug/mL,4℃振动温育10分钟，4℃3000g 离心30分钟，去除不溶性细胞碎片，上清转移到一只新管中，加入DTT 至终浓度1mmol/L 。
GST蛋白纯化
GST bestarose 4FF说明书默认分类2010-01-18 09:32:34 阅读257 评论0 字号：大中小GST bestarose 4FF是专门用于纯化pGEX系列载体表达的GST标签蛋白，其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，操作简单，快速。
GST bestarose 4FF 可直接从预处理的细胞裂解物中纯化GST-tagged蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的生物活性。
GST bestarose 4FF 具有高流动性，易于放大，GST bestarose 4FF有快速方便的预装柱，Ez-Fast bestarose 4FF 1ml和5ml。
介质性能谷胱甘肽是通过10碳原子的连接臂偶联到4%高度交联的琼脂糖上。
最优的偶联作用使介质具有高GST-tagged蛋白及与谷胱甘肽相互作用蛋白的结合能力。
总的蛋白结合能力约为每毫升填料结合10mg标签蛋白，动态结合能力随着外界因素改变，如不同的目标蛋白，流速等等。
如果需要去除GST部分（天然蛋白分子量为26KD），当蛋白吸附在柱上，或在洗脱后用位点专一的蛋白酶消化，选用前种方法，可减少额外分离目的蛋白与GST步骤，消化后，目的蛋白直接用结合液洗脱即可。
表1 GST bestarose 4FF性能配体谷胱甘肽与10碳原子连接臂配体浓度 120-320μmol谷胱甘肽/ml填料蛋白结合能力≈ 10mg重组GST-tagged蛋白/ml填料，GST，Mr26000动态结合能力≈11mgGST-tagged蛋白/ml填料，Mr43000平均颗粒大小90μm组成 4%高度交联的琼脂糖最大流速* 450cm/h（15ml/min），XK层析柱，柱高5cm,水溶性缓冲液，室温纯化建议的流速** 上样：＜100cm/h（＜3ml/min ，XK层析柱）洗涤与洗脱：100-300cm/h（3-10ml/min，XK层析柱）化学稳定性所有常用的水溶性缓冲液中稳定，如：1M醋酸盐，pH7.4，6M 盐酸胍，室温，1hpH稳定性 pH3-12贮存温度 +4-30℃贮存液 20%乙醇* 水是室温的。
谷胱甘肽的实验报告
一、实验背景谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是一种非蛋白巯基化合物，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，广泛存在于生物体内。
近年来，研究表明谷胱甘肽具有多种生物学功能，如抗氧化、解毒、免疫调节等。
本实验旨在探究谷胱甘肽的抗氧化活性，为其在医药、食品等领域的应用提供理论依据。
二、实验材料与方法1. 实验材料（1）谷胱甘肽标准品（纯度≥98%）（2）维生素E标准品（纯度≥98%）（3）FeSO4·7H2O（4）EDTA-Na2（5）无水乙醇（6）蒸馏水（7）721分光光度计（8）电子天平2. 实验方法（1）标准曲线绘制①准确称取维生素E标准品10mg，置于100mL容量瓶中，加入无水乙醇溶解，定容至刻度，配制成100μg/mL维生素E标准溶液。
②分别取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL维生素E标准溶液于10mL容量瓶中，加入0.1mol/L FeSO4·7H2O溶液1.0mL，EDTA-Na2溶液1.0mL，混匀。
室温下放置10min。
③以蒸馏水为空白，于510nm波长处测定吸光度。
④以维生素E浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）谷胱甘肽抗氧化活性测定①准确称取一定量的谷胱甘肽标准品，加入无水乙醇溶解，配制成一定浓度的谷胱甘肽溶液。
②取1.0mL谷胱甘肽溶液于10mL容量瓶中，按照维生素E标准曲线绘制方法进行实验。
③以蒸馏水为空白，于510nm波长处测定吸光度。
④根据标准曲线计算谷胱甘肽的抗氧化活性。
三、实验结果与分析1. 标准曲线绘制以维生素E浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：y=0.066x+0.0015，R²=0.998。
2. 谷胱甘肽抗氧化活性测定取1.0mL谷胱甘肽溶液进行实验，测定吸光度为0.068。
根据标准曲线计算，谷胱甘肽的抗氧化活性为80μg/mL。
四、结论本实验结果表明，谷胱甘肽具有一定的抗氧化活性，其抗氧化活性为80μg/mL。
GST蛋白纯化
三．GST融合蛋白纯化（1）GST亲和纯化1．介质保存：20％乙醇2．所需试剂：①10×PBS（1L）：pH7.4 (4℃)150mM NaCl（87.75g），16mMNa2HPO4(57.3g)，4mM NaH2PO4(6.24g)②10×洗脱前buffer（100ml）：pH8.0 (25℃)50mM Tris（6.1g），100mM NaCl(5.8g)③洗脱buffer即凝血酶酶切buffer(500ml)：pH10.0 (25℃)加入谷胱甘肽后pH变为8.050mM Tris（3.035g），100mM NaCl(2.925g)洗脱前加1M CaCl2至终浓度2.5mM，加还原型谷胱甘肽（干粉）至终浓度20mM也有文献使用谷胱甘肽终浓度为10mM，未对比过。
8ml介质结合的融合蛋白一般用30ml洗脱buffer（加75μl CaCl2和0.12g还原型谷胱甘肽）④3M NaCl3．纯化步骤及注意事项：①PBS平衡柱子：至少5个柱体积②上样：经对比发现，上样流速需极慢才能结合，一般上样过夜（纯化原理是谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白对谷胱甘肽的亲和力）③PBS洗杂蛋白：洗到紫外监测基线平，至少1小时，时间充分的话最好用较慢流速洗2到3小时，这样洗脱下来的目的蛋白中杂蛋白较少。
④洗脱前buffer换体系：至少2个柱体积，8ml介质一般用20ml⑤洗脱buffer洗脱蛋白：洗脱速度很快，一般第2、3管浓度最大，注意收峰⑥3M NaCl再生柱子：一般会洗出一个小盐峰，再生时间不可过长，否则对柱子有伤害，5个柱体积即可（2）凝血酶酶切融合蛋白（以NGB为例）先后使用过sigma和鼎国的凝血酶，sigma的酶效率更高。
鼎国凝血酶买来为干粉，3000U每管，溶于1ml凝血酶酶切buffer（补1M CaCl2至终浓度2.5mM），分装至每管10μl共100管，30U/管。
合并GST柱下来的目的蛋白，紫外分光光度计OD595测蛋白浓度。
gst亲和柱子原理
gst亲和柱子原理
gst亲和柱子原理是基于谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase，GST）的亲和作用来分离纯化蛋白质。
gst 亲和柱子是一种预装柱，其表面有GST的特异性配体，可以与GST融合蛋白结合。
当含有GST融合蛋白的溶液流经该柱子时，融合蛋白会与柱子上的配体结合，形成稳定的复合物。
其他不与配体结合的杂质则随着流动相流出。
接下来可以使用含有谷胱甘肽的洗脱液将融合蛋白从柱子上洗脱下来，从而实现蛋白质的分离纯化。
gst亲和柱子具有高特异性和高亲和性，可以用于分离纯化各种与GST融合的蛋白质，如重组抗体片段、重组酶等。
这种纯化方法具有高分辨率、高回收率和简便操作等优点，因此在生物工程领域得到了广泛应用。
谷胱甘肽
报告者：于淼 05生物技术（3）班
谷胱甘肽
• 谷胱甘肽 谷胱甘肽(glfftathione)是由 是由Hopkins发现并命名，1929 发现并命名， 是由 发现并命名 年Hopkins及Kendall等各自独立的发现其为含有甘氨酸 及 等各自独立的发现其为含有甘氨酸 的三肽。谷胱甘肽化学名为： 的三肽。谷胱甘肽化学名为：N-(N-L-r-Glutamyl-Lcysteninyl)glycine，即N(N-L-r-谷氨酰 半胱氨酰 甘氨 谷氨酰-L-半胱氨酰 ， 谷氨酰 半胱氨酰)甘氨 酸。谷胱甘肽可分为还原型谷胱甘肽 (reduced glutathione，GSH)和氧化型谷胱甘肽 ， 和氧化型谷胱甘肽 (oxidizided glutathione，GSSG)。 ， 。
GSH的代谢过程 的代谢过程
• 谷胱甘肽在体内的代谢过程现已基本清楚。进入血液循环 谷胱甘肽在体内的代谢过程现已基本清楚。 可被一些组织直接吸收入细胞， 的GSH可被一些组织直接吸收入细胞，也可被组织细胞 可被一些组织直接吸收入细胞 膜上的r-谷氨酰转肽酶 谷氨酰转肽酶(rGT)降解为 谷氨酰氨基酸 氨基 降解为r-谷氨酰氨基酸 膜上的 谷氨酰转肽酶 降解为 谷氨酰氨基酸(氨基 酸来自细胞外液中的游离氨基酸)和半胱氨酰甘氨酸 和半胱氨酰甘氨酸， 酸来自细胞外液中的游离氨基酸 和半胱氨酰甘氨酸，而 后被二肽酶降解为半胱氨酸和甘氨酸或以二肽的形式转运 到细胞内后再被降解为半胱氨酸和甘氨酸。 到细胞内后再被降解为半胱氨酸和甘氨酸。 大多数哺乳动物的肾、肝脏、小肠、肺组织中有较高的 大多数哺乳动物的肾、肝脏、小肠、肺组织中有较高的r-GT 和二肽酶活性，它们是清除循环系统中 GSH的主要器官。 和二肽酶活性， 的主要器官。 的主要器官 在细胞内， 的组成氨基酸在r-谷氨酰环化转移酶 在细胞内，GSH的组成氨基酸在 谷氨酰环化转移酶、r的组成氨基酸在 谷氨酰环化转移酶、 谷氨酰半胱氨酸合成酶、 谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶催化下生成谷胱 甘肽。 甘肽。GSH的合成通过其自身对 r-谷氨酰半胱氨酸合成 的合成通过其自身对 谷氨酰半胱氨酸合成 酶的反馈抑制来调控。肝脏是体内合成GSH的主要场所。 的主要场所。 酶的反馈抑制来调控。肝脏是体内合成 的主要场所
谷胱甘肽原料药与制剂关键技术及产业化-概述说明以及解释
谷胱甘肽原料药与制剂关键技术及产业化-概述说明以及解释1.引言1.1 概述谷胱甘肽是一种重要的生物活性分子，具有抗氧化、解毒和免疫调节等多种生物学功能。
近年来，随着人们对保健品和药物研发的需求不断增加，谷胱甘肽的应用价值逐渐被关注和认识。
然而，由于谷胱甘肽的化学结构特殊性和制备工艺复杂性，该原料药和制剂的关键技术一直是制约谷胱甘肽产业化的瓶颈。
谷胱甘肽原料药的关键技术主要包括合成方法、纯化工艺和质量控制等方面。
谷胱甘肽的合成方法有化学合成和生物合成两种途径，化学合成方法包括化学反应和酶法合成等，而生物合成则利用微生物或转基因植物等生物系统通过代谢途径合成谷胱甘肽。
纯化工艺是为了提高谷胱甘肽纯度和去除杂质，主要包括溶液浓缩、沉淀析出和柱层析等技术。
质量控制则是对谷胱甘肽原料药进行物理、化学和生物学性质的检测和评估，以确保其安全性和有效性。
谷胱甘肽制剂的关键技术主要包括制剂设计、制备工艺和稳定性等方面。
制剂设计是根据谷胱甘肽的性质和药用要求，选择适合的药物给药途径、剂型和制备方法等进行设计。
制备工艺则是根据制剂设计方案，进行制剂原料的配制和制剂流程的优化，以获得高纯度和稳定性的谷胱甘肽制剂。
稳定性的研究则是对谷胱甘肽制剂进行贮存、运输和使用过程中物理、化学和生物学性质的监测和评估，以确保谷胱甘肽制剂的有效性和安全性。
在谷胱甘肽原料药与制剂的产业化过程中，关键技术的研究和进展将推动其应用领域的拓展和市场的发展。
同时，相关的政策支持和法规规范也对谷胱甘肽产业的健康发展起着积极的促进作用。
随着技术的不断创新和完善，相信谷胱甘肽原料药和制剂的产业化将迎来更广阔的发展前景。
文章结构为：引言、正文和结论三个主要部分。
引言部分主要包括概述、文章结构和目的。
在概述中，可以简要介绍谷胱甘肽原料药与制剂的重要性和应用领域。
文章结构部分应该明确列出本文的各个章节，并简要说明每个章节的内容和意义。
目的部分可以说明本文的研究目的和意义，即为了解谷胱甘肽原料药与制剂的关键技术及其产业化进程，提供相关技术和产业发展的参考。