实验七DNS法测定纤维素酶活力
实验七D N S法测定纤
维素酶活力
Document number【SA80SAB-SAA9SYT-SAATC-SA6UT-SA18】
实验七 DNS法测定纤维素酶活力
一、试剂耗材
实验共分为6组，在每组的实验台上需要配置以下试剂和耗材：
25mL比色管(容量瓶或离心管也可)10支；试管架1个；50mL容量瓶；移液枪（移液管）1000μL 1把；5000μL1把，对应枪头若干；DNS 溶液100mL；
1mg/mL葡萄糖标准溶液100mL；%羧甲基纤维素钠水溶液50 mL，滴管数支，烧杯100 mL 2个。
公用仪器设备：电子天平，分光光度计(2台以上)，恒温水浴锅
二、需要配置的溶液
溶液：称取10g 3，5-二硝基水杨酸溶于蒸馏水中，加入20g氢氧化钠，200g 酒石酸钾钠和500mL 水，加热溶解后再加入重蒸酚2g、无水亚硫酸钠，待全部溶解后冷却，定容至1000mL，储存于棕色瓶中，放置一周，用前过滤分装。
L乙酸乙酸钠缓冲液配置：（1000毫升）参考缓冲液配置手册
3. 1mg/mL葡萄糖标准溶液:称取1g葡萄糖,用蒸馏水溶解,并定容到1000mL.分装
4. %羧甲基纤维素钠溶液：用L pH 的乙酸乙酸钠缓冲液配置。
测定纤维素酶活实验方法总结及优化方案
DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案 目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。 目前实验室采用测酶活方法： 1、葡萄糖标准曲线制作： 530nm比色。 2、酶活测定方法：
考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。 单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000 1 )/(???=酶活力 n ：稀释倍数； K ：曲线斜率； T ：反应时间，min ； 1000：mg 换算成ug. 以下是近期所做的实验结果： 葡萄糖标准曲线 两种产纤维素酶细菌不同测试结果
测定结果 实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。 根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。 刚果红染色法：常用的刚果红染色法有两种， 一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板 时就加入刚果红。方法一在长出茵落的培养基上，覆盖质量浓度为1 mg ／mI。的CR溶液，10～15 min后，倒去CR溶液，加入物质的量浓度为l mol／I。的NaCI溶液，15 min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的 茵落周围将会出现透明圈。 方法二配制质量浓度为10 mg／mI。的CR溶液，灭菌后，按照每200 mI。培养基加入1 mI。的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长 出茵落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。 两种刚果红染色法的比较刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经 有超过20年的历史，课本中给出了两种方法。 方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间 发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。 方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于在纤维素 粉和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出
抗氧化酶活性等测定方法
叶绿体得提取 一、试剂配置 １、PＢS提取液:每L水依次加入MES(１9５.2×0。05=９、7６g)、山梨糖醇(0。33×182。2＝60。1２6g)、ＮaCｌ(０、０10×58.5=0、５85g)、MgCｌ(０.002×95=0、19g)、EDＴA(292、２5×０.0０２=０、５84５g)、KH2PO４(２00×0.0005=０、１g);使用时加入ASＡ—Nａ(１98。1×0、00２=0、３962g); 2、悬浮液:将ＰBS提取液中得MES换为238。３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS(238、3×０。05=11。915ｇ); ３、8０%Pｅrｃoｌ:8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:４0ｍl原液＋60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ｍl(3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ), 悬浮液100ml(３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml); 8０％Percol ２０0ml;40%Percｏl 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS(50mM MES PH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mM NaＣl,2mMＭgCｌ２,２ｍM EＤTA,０.5 mMKH2PＯ４,2mM ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎) 3、滤液20００g ３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成; 4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(５０mM HＥPＥS pＨ7。6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM NaＣl,2mM MgＣl2,2mM EDTA,0。5mMKH2PＯ４,2mM ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、２000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80％Peｒcｏl(原液按100％算)铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl 40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)１500ｇ2-3mｉn(用
土壤纤维素酶测定方法
纤维素酶 一、试剂： 1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。 2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45℃下搅拌2 h，此溶液在4℃下可存放7天。 3）还原糖试剂： 试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。 试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水，冷却后稀释至1 L。 4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。 二、仪器设备 恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶 三、操作步骤 取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（＜2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50℃下培养24 h，过滤。同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。 取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中，加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100℃水浴中加热15 min 后，立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20℃下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。 标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。c) 空白： 无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。 无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。 四、结果计算 土壤纤维素酶活性（μg·g-1·(24 h)-1）＝(C*V*f)/ dwt 式中C为样品的葡萄糖含量（μg·ml-1）；V为土壤溶液体积（30 ml）；f为稀释倍数（25）；
羧甲基纤维素酶测定原理
纤维素酶活力的测定 一、目的 学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。 二、原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C1 酶、CX 酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm 波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 （1）纤维素酶制剂 500mg （2）新华定量滤纸 50mg / 份× 4 （3）脱脂棉花 50mg / 份× 4 （4）羧甲基纤维素钠（CMC） 510mg （5）水杨酸苷 500mg 2．主要仪器 （1）722 型或其他型号的可见分光光度计 （2）恒温水浴2 台 （3）沸水浴锅 （4）电炉子 （5）剪刀 （6）万分之一分析天平 （7）恒温干燥箱 （8）冰箱 （9）试管架 （10）胶头滴管 （11）具塞刻度试管20mL×24 （12）移液管或加液器0.5 mL×3；2mL×7 （13）容量瓶100 mL×6；1000 mL×3 （14）量筒50 mL×2；100 mL×1；500 mL×1 （15）烧杯100 mL×6；500mL×3；1 000 mL×1 3．试剂（均为分析纯）
（1）浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液 将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存（可用12～15 天）。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液 准确称取DNS 6.3g 于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶液262mL，再加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠（C4H4O6KNa · 4H2O，MW=282.22）的热水溶液中，再加5g结晶酚（C6H5OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na2SO3，MW=126.04），搅拌溶解，冷却后移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。 （3）0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液A 液（0.1 mol/L 柠檬酸溶液）：准确称取C6H8O7 · H2O （MW=210.14）21.014g 于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。
酶活力测定方法
蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。 纤维素酶DNS酶活力测定方法 DNS, 活力, 纤维素酶, 测定 1 定义" |0 `. y6 t9 b" ^ 2 x 1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。 2 原理 纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。! Y" m& p' q; I& K B& e$ T( B4 } 3.试剂和溶液 3.1 1％葡萄糖标准溶液（同β－葡聚糖酶酶活测定） 3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液 取1g羧甲基纤维素钠（粘度300～600厘泊）,加入pH4.2的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M 盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4℃冰箱贮存，有效期3天。取滤液100ml，20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。4 C) c+ }( l2 R( M( p! L 3.3 DNS 试剂（同β－葡聚糖酶酶活测定）; h1 a. l3 Z3 k6 t2 | 4仪器和设备 4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃) 4.2分光光度计 含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。$ ]1 h& A) p) K 5测定步骤 5.1 标准曲线绘制. [* |! P6 u* G& u2 ^6 J4 Q 分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。1 H, `% F/ `7 X/ U. W 5.2待测酶液的制备（同β－葡聚糖酶酶活测定） 1 L- {5 h8 W; q+ V4 u2 Y 5.3 比色测定 精确吸取经待测稀释酶液0.5ml，40℃预热5min，加入经40℃预热的CMC液1.5ml（每个样品同时作3支平行试管），于40℃水浴精确反应10min，立即加入DNS试剂3.0ml终止反应，以后按标准曲线制作步骤测定样品吸光度。 同时进行空白对照测定，取稀释酶液0.5ml，先加入DNS试剂3.0ml，再加入CMC液1.5ml，其余步骤同于样品测定。 6.计算0 W+ i$ S: }( _1 o7 ], R5 m( N
土壤纤维素酶活性测定(3,5- 二硝基水杨酸比色法)
土壤纤维素酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法） 一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与?3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可 用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）甲苯 2）1%羧甲基纤维素溶液：1g羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。 3）pH5.5醋酸盐缓冲液： 0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L； 0.2mol/L醋酸钠溶液16.4gC2H3O2Na或27.22gC2H3O2Na.3H2O溶至1L； 取11ml0.2mol/L醋酸溶液和88ml0.2mol/L醋酸钠溶液混匀即成PH5.5醋酸盐缓冲液。4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml2mol/LNaOH和125ml 水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天）。 5）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，
SOD酶活性测定方法
SOD酶活性测定 所需药品： （1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配 称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。 （3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配 称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。 （4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 （5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 （6）石英砂 实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂： 试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）
纤维素酶活力测定
山东大学实验报告2011年4月20日 姓名张行润系年级2009级生科4班学号200900140177 同组者于潜科目生物化学实验题目纤维素酶活力测定—3,5-二硝基水杨酸法仪器编号105 一、实验目的 1、学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法 2、巩固使用分光光度计 二、实验原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。 本实验中酶活力定义：1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。 三、实验器材 （1）722型分光光度计（2）恒温水浴 （3）沸水浴锅 （4）电炉子 （5）剪刀 （6）分析天平（7）试管架 （8）胶头滴管 （9）具塞比色管（25mL×10）（10）移液管（2mL；5mL）（11）烧杯（500mL×3）（12）洗耳球 四、实验材料 （1）纤维素酶：0.05g酶溶解定容至50ml，取1ml再定容至100ml待测（用PH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制）； （2）3、5—二硝基水杨酸显色液； （3）0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置；（4）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）； （5）蒸馏水。 五、实验操作 1.空白管的测定：
过氧化物酶活性的测定
过氧化物酶活性的测定（比色法） 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量470 nm 处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶活性。 一、仪器、药品与材料 （一）实验材料 新鲜植物组织。 （二）仪器与用品 分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100 mL 容量瓶，吸管，高速冷冻离心机，秒表，磁力搅拌器。 （三）试剂 １．愈创木酚。 ２．30％过氧化氢。 ３．100 mmol/L 磷酸缓冲液pH 6.0。 ４．反应混合液：取100 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 6.0）50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚28 μL，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30 % 过氧化氢19 μL，混合均匀，保存于冰箱中备用。 二、实验步骤 1．称取植物材料0.1 g ，剪碎，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，残渣再用5 mL 磷酸缓冲液提取一次，以4000 rpm 低温离心15 min ，上清液即为粗酶液，定容至10 mL刻度，贮于低温下备用。 2．取2支试管，于1只中加入反应混合液3 mL 和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1支中加入反应混合液3 mL和上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释之）。迅速将两支试管中溶液混匀后，倒入比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470 nm 处测定吸光度（OD）值，每隔10S读数一次。
纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定
纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定 1.纤维素CMC酶 1.0标题 用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。 2.0范围 生产分析和质量控制部门适用。 3.0原理 纤维素CMC酶（EC3.2.1.4）水解羧基纤维素分子中β－1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。 4.0试剂 4.1无水醋酸钠(分析纯) 4.2冰醋酸(分析纯) 4.3 3.5－二硝基水杨酸 4.4无水葡萄糖 4.5四水酒石酸钾钠(分析纯) 4.6氢氧化钠(分析纯) 4.7重蒸苯酚(分析纯) 4.8无水亚硫酸钠(分析纯) 4.9叠氮化钠(分析纯) 4.10羧甲基纤维素钠 5.0仪器 5.1水浴锅(恒温)50±1℃ 5.2电热干燥箱80±1℃ 5.3 722型分光光度机计 5.4分析天平感量0.1㎎ 5.5一级玻璃制品 5.6电冰箱 6．0试剂的准备 6．1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8） 溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。 溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。 以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。 6.2 DNS试剂: 溶液A:称分析纯NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。 溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml热水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。 将A、B溶液混合，定容至5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。 6.3 CMC溶液：用羧甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。 7．0标准曲线制作： 7.1无水葡萄糖80℃烘干至恒重。 7.2准确称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。 7.3标准葡萄糖曲线制作
纤维素酶活力的测定
纤维素酶活力的测定 1.纤维素酶活力单位定义 在37?,pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液 中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u. 2.测定原理 纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还 原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与 酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力. 3.试剂与溶液 除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水. 3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml: 称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解,定容至100ml. 3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L: 吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml. 3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L: 称取三水乙酸钠1.36g.加水溶解,定容至100ml. 3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L: 称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml. 3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5: 称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定 溶液的pH值.如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至 5.5. 3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v)
实验四 固体纤维素酶滤纸酶活力(FPA)的测定方法
实验四固体纤维素酶滤纸酶活力(FPA)的测定方法 一目的 了解纤维素酶的种类和测定原理，掌握其活力的测定方法。 二、原理 纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物(滤纸)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。通过在540 run测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的滤纸酶活力。以此代表纤维素酶的酶活力。 酶活定义 以滤纸为底物，在一定反应条件（50℃，pH4.8，恒温1h）下，以水解反应中每小时催化底物水解形成1μmol葡萄糖的酶量为一个单位（U）。 三、试剂和溶液 (一) 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 1 DNS试剂 2柠檬酸缓冲液，0. 05 mol/L pH 4.8(适用于酸性纤维素酶) 称取一水柠檬酸4.83 g,溶于约750 mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g,用水定容至1000 mL。调节溶液的pH到(4.8士0.05)备用。 注:也可采用pH4.8乙酸缓冲溶液:称取三水乙酸钠8. 16 g,溶于约750 ml,水中，加入乙酸2.31 ml,，用水定容至1 000 ml.调节溶液的pH到(4.8士0.1)备用 3葡萄糖标准贮备溶液（4mg/ml） 称取于(103士2)℃下烘千至恒重的无水葡萄糖4.0g,精确至0. 1 mg，用水溶解并定容至1000ml。（4mg/ml） 上述系列浓度应根据需要自行调整。 5快速定性滤纸(杭州新华一号滤纸)沪15 cm(每批滤纸，使用前用标准酶加以校正)。 (二) 仪器 除普通实验室仪器外，还应有: 1分光光度计 2酸度计精度10.01 pH 3恒温水浴(50士0.l)0C 4分析天平感量0.1 mg 5磁力搅拌器 6秒表或定时钟 7沸7k洛(可用800W申炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成) 8具塞刻度试管25 mL 四、操作步骤 4.1绘制标准曲线 按表A. l规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液(A.2.5)、缓冲溶液(A.2.2或A.2.3)和DNS试剂(A.2.1)于各管中(每管号平行作3个样)，混匀。 将标准管同时置于沸水浴中，反应10 min。取出，迅速冷却至室温，用水定容至25 mL.盖塞，混匀。用10 mm比色杯，在分光光度计波长540 nm处测量吸光度。以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。线性回归系数应在0.9990以上时方可使用(否则须重做)。
纤维素酶活力测定方法_张瑞萍
测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘 要 用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙 词: 测试 纤维素酶 活度中图分类号: TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1 实验方法 1.1 化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2 FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3 针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2 结果与讨论 2.1 显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖 H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2 最大吸收波长的确定 选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1 D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3 底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4 葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印 染(2002No .8) www .cdfn .com .cn
纤维素酶活力的测定
β-糖苷酶活力的测定（CMC） 一目的： 掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。 原理： 纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠（CMC-Na）中分解出还原糖，还原糖又同3，5-而硝基水杨酸发生反应，产生一种黄橙混合色，用分光光度计可测定其色度，计算酶活力。 二试剂： 1．3，5-而硝基水杨酸显色剂（又称DNS试剂）：称取10g3,5-而硝基水杨酸，溶于蒸馏水中，加入20g分析纯NaOH，200g酒石酸钾钠，加税500ml,升温溶解后，加入重蒸酚2g,无水亚硫酸钠,加热搅拌，待全部溶解后，定容至1000ml。贮存于棕色瓶中，室温保存，放置一周后使用。 2．L 醋酸-醋酸钠缓冲液：称取结晶醋酸钠（H2O），醋酸（CH3COOH），用蒸馏水溶解，并定容至1000 ml，配好后用pH计矫正。 3．1mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在70℃、600nm汞柱下干燥5h至恒重），用少量蒸馏水溶解并定容至100ml，冰箱中保存备用。 4．代测酶液：称取酶粉（或吸取酶液），先用少量的L 醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再加上述缓冲液溶解，如此反复捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，40℃水浴锅中浸提1h，用四层纱布或脱脂棉过滤，滤液供测定用。 5．底物：%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，配制方法为城区羧甲基纤维素钠（Sigma公司生产），准确至,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存，有效期3d。 三仪器： 分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。 四方法步骤： 1．标准曲线的绘制 分别吸取, , , , , , 的1mg/ml葡萄糖液于7支20ml的比色管中，分别用蒸 馏水补充体积至,各加3，5-而硝基水杨酸,在沸水浴中煮沸5min，冷却后 分别用蒸馏水定容至20ml，摇匀。以2ml蒸馏水加DNS溶液,按上述同样 操作为空白调零，在540nm处比色。标准曲线绘制个试管所含物质的体 积见下表。以吸光度A值为纵坐标，葡萄糖毫克数W(mg)为横坐标绘制出 标准曲线（理论上此线应过原点）。
纤维素酶活力的测定Measurement of Cellulase Activities
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产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定模板
本科开放项目 题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 学生姓名： 指导教师： 学院： 专业班级： 2016年3月
产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 摘要 纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。 关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株
目录 第1章绪论 (1) 1.1 实验原理 (1) 1.2 实验仪器及试剂 (1) 1.2.1 实验材料 (1) 1.2.2 实验仪器 (1) 1.2.3 培养基 (2) 第2章实验步骤 (3) 2.1 采样培养 (3) 2.2 初筛 (3) 2.3 复筛 (3) 2.4 酶活的测定 (3) 2.4.1原理 (3) 2.4.2溶液配制 (3) 2.4.3实验步骤 (4) 第3章实验结果 (6) 3.1 标准曲线的绘制 (6) 3.2 菌株复筛结果 (6) 3.3 测定纤维素酶活力结果 (7) 结束语 (8) 参考文献 (9)
蛋白酶活力测定方法
酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活）
简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml） 特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化： 提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。
各种酶活力测定方法及注意事项
碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感 因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。 以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制： 碱性蛋白酶测定方法 根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法 以下是方法
碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。 2.2.6.1 标准曲线的绘制 （1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。 表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表 Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form 管号酪氨酸标准溶液的浓度/ （μg/mL） 取 100 μg/mL 酪氨酸标准 溶液的体积/（mL） 取水的体积/ （mL）
0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 （2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用 液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10 mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。 图 2-1 L-酪氨酸标准曲线 Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve 根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。其 K 值应在 95-100 范围内。上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。 2.2.6.2 测定方法 （1）计算方法 X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1） 式中，X —样品的酶活力，μ/g； A —样品平行实验的平均吸光度； K —吸光常数； 4 —反应试剂的总体积，mL； 10—反应时间 10 min，以 1 min 计； n —稀释倍数。 （2）测定方法 ①先将干酪素溶液放入 40 ℃±0.2 ℃恒温水浴中，预热 5 min。 ②按下列程序操作，进行测定。 于 680 nm 波长，用 10 mm 比色皿测其吸光度。