荧光实时定量PCR技术及其在水产养殖研究中的应用

第２８卷第６期　２　０　０　７年１　２月　海洋水产研究　

ＭＡＲＩＮＥ　ＦＩＳＨＥＲＩＥＳ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　Ｖｏ１．２８，ＮＯ．６　

Ｄｅｃ．，２００７　

荧光实时定量ＰＣＲ技术及其在水产养殖研究中的应用　任伟成　王崇明　李　簧　（　中国海洋大学，青岛２６６００３）　（　中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛２６６０７１）　

摘要　荧光实时定量ＰＣＲ技术是近年来快速发展起来的一门新技术，它是核酸探针技术、荧光共　振能量传递技术（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ）和ＰＣＲ技术的有机结合。与常　规ＰＣＲ相比，它具有特异性更强、有效解决ＰＣＲ污染问题、自动化程度高、能较准确定量等特点。本　文综述了荧光实时定量ＰＣＲ技术的基本原理及几种广泛应用的荧光化学方法，并概述了荧光实时　定量ＰＣＲ技术在水产养殖研究领域的应用现状，并对荧光实时定量ＰＣＲ技术的应用前景进行了　展望。　关键词　荧光实时定量ＰＣＲ　水产养殖　中图分类号　Ｑ７５　文献识别码　Ａ　文章编号　１０００—７０７５（２００７）０６—００９７—０７　

Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ—Ａ　ｒｅｖｉｅｗ　

ＲＥＮ　Ｗｅｉ—ｃｈｅｎｇ　ＷＡＮＧ　Ｃｈｏｎｇ—ｍｉｎｇ　ＬＩ　Ｙｕｎ　（　Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６００３）　（　Ｙｅｌｌｏｗ　Ｓｅａ　Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｆｉｓｈｅｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６０７１）　

ＡＢＳＴＲＡＣＴ　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ（Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｕｎｄｅｒ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｎ　ｒｅｃｅｎｔ　ｙｅａｒｓ．Ａｓ　ａｎ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｂｅｓ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ）ａｎｄ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ＰＣＲ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｅｘｃｅｅｄｅｄ　ｔｈｅ　ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄ　ｂｙ　ａｌｌｏｗｉｎｇ　ｆｏｒ　ｈｉｇｈ　ｓｅｎｓｉｂｉｌｉｔｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ａｕｔｏｍａ—　ｔｉｏｎ，ａｎｄ　ａｖｏｉｄｉｎｇ　ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ＰＣＲ．Ｔｈｉｓ　ｒｅｖｉｅｗ　ｃｏｖｅｒｓ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｃ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｓｅｖ—　ｅｒａｌ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｕｓｅｄ　ｗｉｄｅｌｙ　ｉｎ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ．ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｕｒ—　ｒｅｎｔ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉｎ　ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅ　ｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅ　ａｎｄ　ｆｕｔｕｒｅ　ｐｒｏｓｐｅｃｔ　ｏｆ　ａｐｐｌｉ—　ｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｗｅｒｅ　ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．　ＫＥＹ　ＷｏＲＤＳ　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ　

自１９８３年Ｋａｒｙ　Ｍｕｌｌｉｓ发明聚合酶链式反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）以来，ＰＣＲ技术就作为　一种重要的基因诊断方法以其简便、迅速、灵敏等优点在分子生物学等很多领域得到了迅速的应用和发展。但　是传统的ＰＣＲ技术在具体的实际应用中出现了一些问题，如不能准确的定量、容易交叉污染、出现假阳性或假　

国家高技术研究与发展项目（２００６ＡＡ１００３０７）和山东省科技攻关项目（２００４ＧＧ２２０５１１５）共同资助　＊通讯作者。Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｃｍ＠ｙｓｆｒｉ．ａｃ．ｃｎ，Ｔｅｌ：（０５３２）８５８２３０６２　收稿日期：２００６—０８—２２；接受日期：２００６—１］一Ｏ１　作者简介：任伟成（１９８１一），男，博士研究生，主要从事水产动物病害研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｒｅｎｗｅｉｃｈｅｎｇｌ９８１＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ，Ｔｅｌ：（０５３２）８５８２３０６２　

维普资讯 http://www.cqvip.com ９８　海洋水产研究　第２８卷　阴性的结果等。为了克服传统ＰＣＲ的某些缺点，２０世纪９０年代中期，美国Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｓｙｓｔｅｍｓ公司率先推出　了荧光实时定量ＰＣＲ，从而实现ＰＣＲ技术从定性到定量的飞跃。Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ基本克服了传统ＰＣＲ缺点，　并以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点而备受推崇，逐渐成为分子生物学　研究的重要工具。本文就此技术及其在水产养殖中的应用进行综述。　

１　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ技术的基本原理　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ是一种在ＰＣＲ反应体系中加入荧光基团，运用Ｔａｑ酶的５’。３’外切酶活性和荧光能量传　递技术，巧妙地把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧光信号的积累来实时监测整　个ＰＣＲ进程，最后通过标准曲线对未知核酸模板进行定量分析的方法。在ＰＣＲ过程中，通过借助荧光信号来　实时检测ＰＣＲ产物，建立实时扩增曲线，准确地确定域值循环数（ＣＴ值），计算起始核酸浓度，做到了真正意义　上的定量。根据最终得到的数据不同，Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ可以分为相对定量和绝对定量两种。相对定量常见于　比较两个或多个样品中基因表达水平的高低变化，得到的结果是比率；而绝对定量则需要使用标准曲线来确定　样品中核酸的拷贝数或浓度。　

２　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ的荧光化学方法　随着Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ技术的广泛应用，化学发光材料也不断被开发。目前Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ的荧光化学方　法主要有３类：荧光染料、荧光探针和荧光引物。其基本原理简述如下：　

２．１荧光染料法　这是一种特异性ＤＮＡ结合的荧光分子检测方法，Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ发展早期就是运用这种最简单的方法。　在ＰＣＲ反应体系中加入过量的荧光染料，荧光染料特异性地掺入ＤＮＡ双链后，发射荧光信号，而未掺入双链　中的荧光染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与ＰＣＲ产物的增加完全同步。荧光染料　的优势在于不需要设计探针，使检测方法变得更简便，而且大大地降低了检测的成本。然而由于荧光染料结合　双链ＤＮＡ的特异性，因此它也能非特异的结合引物二聚体或非特异性扩增产物等双链ＤＮＡ，容易产生假阳　性结果。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（Ｍｅｌｔｉｎｇ　Ｃｕｒｖｅ）的分析软件加以解决。目前使用的荧　光染料种类很多，常用的是ＳＹＢＲ　ｇｒｅｅｎ荧光染料。　

２．２　水解探针（Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　Ｐｒｏｂｅ）　目前广泛使用的ＴａｑＭａｎ探针就是基于这一原理。ＴａｑＭａｎ探针是一种寡核苷酸探针，与待扩增序列严　格配对，探针的５’端标记荧光基团，而３’端标记淬灭基团。当探针完整时，荧光共振能量转移，荧光基团发射　的荧光信号被淬灭基团吸收；ＰＣＲ扩增时，Ｔａｑ酶的５，－－３’外切酶活性将探针酶切降解，荧光基团和淬灭基团　分离，荧光基团发射的荧光信号恢复，荧光检测系统可收集到荧光信号。即每扩增１条ＤＮＡ链，就有１个荧　光分子形成，实现了荧光信号的累积与ＰＣＲ产物形成完全同步。目前，ＴａｑＭａｎ探针已被用于基因检测、病毒　定量、细胞因子基因定量等。另外在基因组学、功能基因组学及药物基因组学等方面也有广泛的应用前景。　

２．３　杂交探针（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｂｅ）　该技术是在普通ＰＣＲ基础上增加了１对荧光单标记的探针，其中上游探针在３’端标记有供体荧光素，而　下游探针的５’端标记有受体荧光素。在ＰＣＲ反应过程中，进行到模板退火阶段时，两探针同时与待扩增的目　的ＤＮＡ序列杂交，并形成头尾结合的形式，使供体荧光素和受体荧光素距离非常接近，二者产生荧光共振能　量转移（此作用与上述水解探针的方式相反），使得受体荧光素发出荧光；当两探针处于游离状态时，则两探针　都无荧光信号产生。由于反应中运用了两个探针，因此增加了该方法的特异性。目前这一方法已被Ｒｏｃｈｅ公　司应用于Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ的生产。主要应用于病原体检测、病毒定量鉴别基因型和检测点突变等领域。　

维普资讯 http://www.cqvip.com 第６期　任伟成等：荧光实时定量ＰＣＲ技术及其在水产养殖研究中的应用　２．４分子信标（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎ）　分子信标是一种设计巧妙的高灵敏度、高特异性的单链荧光核酸探针。Ｔｙａｇｉ等（１９９６）于１９９６年率先报　道了此类具有茎环结构的新型荧光核酸探针，最初的目的是应用于定量测定靶核苷酸的量。在分子信标的茎　环结构中，环一般为１５～３０个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般５～７个核苷酸长，并相互配对形成茎的结　构。荧光基团连接于茎臂的一端，淬灭基团则连接于茎臂的另一端。当分子信标在自由状态时呈发夹结构，荧　光基团和猝灭基团靠的很近，二者发生荧光共振能量转移，荧光基团发出的荧光被猝灭基团吸收；当分子信标　与靶核酸序列结合后，分子信标的空间结构发生改变，茎部互补区被拉开，荧光基团和猝灭基团的距离增大，荧　光基团发出的荧光信号几乎１００　恢复，荧光检测系统就可以监测荧光信号的变化。目前主要应用于起始模　板浓度的定量、单核苷酸多态性（ＳＮＰ）检测、胚胎的性别判断等方面的研究。　

２．５荧光标记引物　该技术是特异性引物对中的一个引物３’端用荧光基团标记，５’端用淬灭基团标记。在没有和模板结合　时，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光基团发射的荧光被淬灭。在ＰＣＲ过程中，引物发夹结构打开，并与　模板结合使荧光基团直接掺入ＰＣＲ扩增产物中，荧光信号恢复，然后通过荧光检测系统监测荧光信号的变化。　荧光标记引物是利用荧光标记的引物实现核酸定量的一项新技术，是理想的双标记探针或ＤＮＡ结合染料的　替代物。其使用比探针便宜，敏感性比染料法高。目前常见的荧光标记引物主要有３种：ＬＵＸ引物（Ｌｉｇｈｔ　Ｕｐｏｎ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、日出引物（Ｓｕｎｒｉｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｎａｚａｒｅｎｋｏ　ｅｔ　ａ１．　１９９７）和蝎子引物（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ　Ｐｒｉｍｅｒｓ．ｗｈｉｔ—　ｃｏｍｂｅ　ｅｔ　ａ１．　１９９９）。