2016.03.31毕赤酵母表达问答
毕赤酵母表达手册
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
毕赤酵母分泌表达报告
实验报告毕赤酵母分泌表达报告订单号：«订单号»客户：«客__户»日期：«日__期»目录1 材料与方法 (1)1.1 菌株的保存与培养 (1)1.2 载体构建 (1)1.3 质粒电转毕赤酵母 (1)1.4 转化子筛选 (2)1.5 转化子表达小试 (4)1.6 最优转化子扩大表达 (6)1.7 蛋白鉴定与纯化 (7)2 结果与分析 (9)2.1 转化子筛选 (9)2.2 转化子表达小试 (9)2.3 最优转化子扩大表达 (10)2.4 蛋白纯化与浓度测定 (10)1．材料与方法1.1 菌株的保存与培养大肠杆菌（Eschrichia coli）菌株TOP10于LB培养液摇菌后保存成20%的甘油菌于-80℃冷冻保存。
大肠杆菌于37℃培养箱中培养。
毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株X-33于YPD培养液摇菌后保存成25%的甘油菌于-80℃冷冻保存。
毕赤酵母于28℃培养箱中培养。
1.2 载体构建1）目的基因信号肽预测，采用SignalP 4.0和5.1预测，去除信号肽序列；2）根据毕赤酵母表达系统进行密码子优化，避开SacI酶切位点；3）基因合成至pPICZαA，目的基因紧挨着载体α-factor，C端带上6×His。
1.3 质粒电转毕赤酵母1.3.1 目的载体线性化1）按下表配制载体酶切体系：组分体积（ul）质粒（5-10 ug）6 ug10×buffer 5SacI 1 ulddH2O 补到502）37℃酶切过夜；3）琼脂糖凝胶电泳检测，以未酶切的质粒作为对照；4）检测酶切成功后，65℃ 20 min灭活。
1.3.2 线性化载体纯化回收1）按下表配置载体纯化体系：组分体积（ul）酶切产物50核酸助沉剂103 M NaAc，pH=5.2 6无水乙醇1652）-20℃静置35 min以上；3）4℃ 12000 rpm离心15 min，弃上清，此时可以观察到壁上有白色沉淀；4）加入400 ul预冷的80%乙醇重悬沉淀；5）4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清，开盖干燥；6）加入10 ul ddH2O溶解沉淀。
巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及应用
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有一个外源基因 /65 等。通用的整合载体多含有 ! "#$ 启动子 ， 和一个从 ! "#$ 基因上拷贝下来的 终 表达框、 多克隆位点（ %&’ ） ， 作 为 筛 选 标 记 的 ()*+ 基 因 和 在 细 菌 中 进 行 复 制 起 止序列（ 77） 始点和选择标记（ 如 )89:5 复 制 起 始 点 和 抗 氨 苄 青 霉 素 基 因 ） 以 使外源基因能以同源重组的方式整 及 ! "#$ *;的非编码区序列， 合到染色体的 ! "#$ 部位（ 表 5） 。
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毕赤酵母表达操作手册(PDF精译版)
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
毕赤酵母表达系统使用心得
毕⾚酵母表达系统使⽤⼼得Pichia酵母表达系统使⽤⼼得甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为⼈熟知，并⼴泛应⽤于外源蛋⽩的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量⾼，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到⾼表达的。
不少⼈在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分⽤户在使⽤EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕⾚酵母表达的经典试剂盒过程中的⼼得体会。
其中Xiang Yang是来⾃美国乔治城⼤学（Georgetown University）Lombardi癌症中⼼（Lombardi Cancer Center），部分⽤户来⾃国内。
+ 表⽰优胜于；- 表⽰不如；= 表⽰差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使⽤简单，表达量⾼，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋⽩有时会出现蛋⽩切割问题全⾯产品报告及⼼得体会：巴斯德毕⾚酵母（Pichia pastoris ）是⼀种能⾼效表达重组蛋⽩的酵母品种，⼀⽅⾯由于其是属于真核⽣物，因此表达出来的蛋⽩可以进⾏糖基化修饰，另⼀⽅⾯毕⾚酵母⽣长速度快，可以将表达的蛋⽩分泌到培养基中，⽅便蛋⽩纯化。
毕⾚酵母表达载体pPICZ 在多克隆位点（MCR ）3'端带有his-tag 和c-myc epitopes ，这些tag 有利于常规检测和纯化，⽽且在MCR5'端引⼊了alpha factor （α-factor ）⽤以增加表达，并且在表达后α-factor 可以⾃动被切除。
在进⾏克隆的时候，如果你选择的是EcoRI ，那么只需在⽬标蛋⽩中增加两个氨基酸序列即可完成。
另外pPICZ 系列选⽤的是Zeocin 抗⽣素作为筛选标记，⽽诱导表达的载体需要甲醇——甲醇⽐⼀般⽤于⼤肠杆菌表达诱导使⽤的IPTG 便宜。
猪β防御素-1在毕赤酵母中的表达及初步鉴定的开题报告
猪β防御素-1在毕赤酵母中的表达及初步鉴定的开题报告一、选题背景和研究意义猪β防御素-1是一种具有广谱抗菌活性的天然抗菌肽，在保障动物健康和食品安全方面具有重要作用。
目前，已有研究报道表明猪β防御素-1能有效抑制多种革兰阳性和革兰阴性菌的生长，但是在大肠杆菌等某些细菌上的抑菌效果并不显著。
因此，利用基因工程技术在宿主中高效表达猪β防御素-1已成为研究的重点之一。
目前，已有研究报道在大肠杆菌、酵母等宿主中成功表达猪β防御素-1并获得了一定的抗菌效果。
毕赤酵母作为一种广泛应用于工业中的微生物，其表达系统具有卓越的稳定性、高产量等优点。
因此，采用毕赤酵母为宿主表达猪β防御素-1是具有潜力和前途的研究。
二、研究内容和目的本研究旨在构建重组表达猪β防御素-1的毕赤酵母菌株，并对其表达产物进行初步鉴定。
通过PCR扩增目的基因，构建重组质粒进行转化，利用Western blot和质谱等分析技术对表达产物进行鉴定。
三、研究方法1.目的基因扩增：利用PCR技术从猪基因组中扩增猪β防御素-1基因的编码序列。
2.构建重组质粒：扩增得到的目的基因及其启动子序列和终止子序列与表达载体pYES2进行重组克隆，构建重组表达质粒pYES2-PBD1。
3.转化毕赤酵母：采用锂酸法将重组质粒pYES2-PBD1转化至毕赤酵母中。
4.高效表达目的基因：通过诱导表达及Western blot和质谱等分析技术鉴定表达产物。
四、研究意义和展望本研究采用毕赤酵母作为宿主，成功表达猪β防御素-1，为大规模生产猪β防御素-1提供了新的选择。
未来该研究可以进一步优化表达条件、探究其抗菌机制等，为猪β防御素-1的工业应用提供理论和实践基础。
毕赤酵母表达(pichia pastoris expression )实验手册(3)
毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册（3）液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。
加入Ze ocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。
2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medi um）：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol 1 M+agar 2%+ Zeocin 100 μg/ml不管是液体 YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。
2.5 MGYMinimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。
将800ml灭菌水、100ml的 10* YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。
2.6 MGYHMinimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸）在1000ml的MGY培养基中加入 10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。
2.7 RDRegeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0. 005%氨基酸）1. 将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；2. 冷却后于45℃水浴；3. 将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2 的山梨醇溶液混合。
4℃保存。
2.8 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸）在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。
毕赤酵母表达经验总结
毕赤酵母表达经验总结甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。
不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。
其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。
甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。
+++=4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。
=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低+++++ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。
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2016.03.31毕赤酵母表达问答1.信号肽切割位点和目的基因核苷酸序列5’端的设计酶切位点问题1.1目的蛋白N端不要增加氨基酸：a-信号肽在kex2 和ste13处进行切割，若要目的蛋白不增加额外氨基酸，则需要在kex2对应核苷酸序列前的XhoI 作为酶切位点，并补齐信号肽切割所需的序列（酶切位点下游的信号肽对应的核苷酸序列）1.2目的蛋白N端可增加氨基酸。
则可以选用其他的酶切稳点，保证下游不出现移码突变就行了。
（具体参考具体酶切位点切割点，及其上游核苷酸数有否保证刚好是3的倍数）。
2.目的基因核苷酸序列3’端的设计酶切位点设计、终止密码子设计2.1如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；3.载体构建问题3.1pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选，对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的3.2pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表。
PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），3.3位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接；3.4虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）；3.5有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确，这可是致命的问题；3.6无论pPICZ还是pPICZα都有TGA（终止密码子），但是pPICZ系列没有ATG（起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利；3.7如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；3.8 Pichia的密码子与酿酒酵母的相似，有关基因表达偏好密码子的问题有人认为没有必要更换，有人认为一定要换，个人认为以产量为主要目的的可以考虑更换基因密码子，而如果片段过长就比较麻烦，不过有许多真核保守蛋白其实是和酵母密码子相似的；3.9克隆菌株需要有recA，endA，试剂盒带有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意带有筛选抗生素Zeocin的培养基要用低盐培养基（NaCl减半），这主要是因为怕影响到抗生素作用（Zeocin平板要避光保存）；3.10测序引物可以用α-factor信号引物，也可以用5'AOX1引物；3.11如果需要高量表达，可以考虑做克隆的时候串联基因片段进行表达，另外也可以在转化酵母的时候重复转化。
3.12目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr这样的序列，因为这个序列是激活蛋白水解酶的作用底物，会影响表达，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x这样的序列（x=任何氨基酸），因为这些序列容易受到容酶体的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser这样的氨基酸。
除此之外许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录，也需要多加注意。
4.毕赤酵母类型选择问题4.1赤酵母类型其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而GS115与X33一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培养基中生长缓慢，但是也有利于翻译后加工，比如形成二硫键，糖基化等等，另外SMD1168则是基因组中的Pep4基因发生突变，造成蛋白水解酶活性的丧失，可以保护表达产物免受降解，促进表达量的提高。
4.2 表达形式与毕赤酵母选择胞内表达，应尽量用Mut－细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多(约占Pp 总分泌蛋白量的30-90%。
而对于分泌蛋白的表达，无论是甲醇利用慢(Mut-)还是甲醇利用快(Mut+)的细胞都可应用。
一般手册都会建议同时在这几种菌株中进行转化，这主要是因为不同的基因在不同的酵母菌中可能表达量截然不同，因此在最开始的时候建议多用几种酵母菌实验。
4.3传代对转化率、表达量等影响原始酵母菌一定要保存好，传代多次后会影响其转化率和表达量，所以一方面分多管分装保存于-80℃，另一方面如果出现了转化或者表达的问题，在其它方面都没有出错的前提下可以考虑重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。
5.转化质粒问题5.1转化质粒要求由于酵母菌转化对转化质粒的要求较高，量也较大（5-10ug），要准备好足够量的质粒，并且不要忘记也要同时准备空载体以做对照。
5.2转化质粒提纯要求在线性化之后的质粒就可以进纯化回收。
选择合适的纯化回收试剂盒，优化回收步骤，目的提高回收效率，获得更多的线性化质粒，同时减少回收质粒中的其他残留，例如残留的酒精对于转化的影响颇大。
5.3是否线性化问题在转化前质粒需要进行线性化，这主要是为了增加重组率（EasySelect试剂盒表达量高的一个重要原因也就在于其原理是将目的片段整合到载体上，大大的增加了目的片段的表达）。
5.4线性化位点问题线性化位点个人认为也会影响到表达量，对于基因片段不大的蛋白可以考虑用几个线性化位点同时进行转化筛选，但是如果片段大，就有可能供选择的机会少，而且也有可能遇上没有合适的线性化位点的情况，这个时候也不是说不能进行表达，但是准备的质粒就要增加10倍，另外也可以进行部分酶切（即先进行预实验，掐定时间和酶量保证被切开的质粒有部分是在线性化位点切开而基因片段保存完好）。
6.电转化问题6.1 转化酵母最好每次都从平板上挑酵母菌，用培养过的酵母放置时间不要超过一个星期；6.2酵母生长状态按照电转化说明书的OD，尽量保证这个时候的酵母比较新鲜，转化率才比较高；6.3冰上操作整个感受态制作过程中一定要在冰上操作，离心最好也用冷冻离心机，这是影响转化的关键。
为了进一步保证这一点，无菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和电转杯都要预冷；6.4电转仪需要预热准备感受态的时候就可以把电转仪打开了，电转后山梨醇的加入要快。
这个过程要快，电转后可以看看时间，如果时间过短（比如<4ms）就可能说明杂质较多，会影响转化率；6.5转化后温育目的是为了增加同源重组，增加存活率。
需要注意不要感染了大肠杆菌，再加入培养基30℃摇一段时间，可以取部分涂板或者也有人将菌短暂离心，弃去上清，剩余全部涂板以保证转化率。
7.挑选单克隆问题7.1在protocol中用了许多篇幅来指导这一步，包括如何去通过平板筛选，观测生长速率来确定Mut表现型等。
这个过程需要3到5天，而我一般只用用了4个小时进行PCR（AOX引物）筛选。
7.2酵母细胞破壁一般通过培养菌然后进行沸水和-20℃冷冻循环过程裂解细胞在目的蛋白片段比较合适的范围以内是可以得到好的结果的，但是有时候片段过长，模壁就会阻碍扩增，所以我们实验室会用蜗牛酶（很便宜的酶来的）来帮助溶菌，我看许多实验室也会这么做，不过加入的时间不同而已，其次也有奢侈的用试剂盒的。
7.3破壁后PCR模板量个人建议模板真的不要加太多了，按照说明书的上的5ul我觉得还是多了，而且建议总体积不用这么大，当然加入模板的量也与自己培养菌的浓度以及用来冻融的菌数量有关。
7.4假阳性和假阴性结果在Mut-和Mut+情况是不一样的，如果用的是5'AOX引物，KM71H会出现3.6kb的片段，而Mut+则会出现AOX1基因原本长度的片段——大约长2.2kb，因此如果的基因片段长度相似，要注意区分。
建议PCR过程中使用多对引物进行反应，包括目的基因的，α-factor的，5'AOX的，都可以，反正各种对照多了有利于比较。
8.表达问题8.1 筛选问题一次毕赤酵母的表达就需要起码一周的时间，我个人建议如果在筛选完3批以上就可以放弃这一批转化的酵母菌，另外调整进行重新转化8.2培养基转换时间你的克隆在YPD培养基中培育到OD600值达到6.0，就可以离心收菌。
用表达培养基（比如BMMY）重悬沉淀，在30oC 培育过夜。
8.3小批量表达问题5ml体系。
生长慢型，生长快型，阴性对照（空质粒），阳性对照（可以是曾经表达成功的重组子）和没有进行转化的酵母菌的单克隆。
8.4转换培养基操作BMGY中培养到OD值2-6，离心收菌（如果怕污染或者麻烦，可以放置酵母菌一段时间，一半为20-30分钟，让菌沉淀下来，小心倾倒去上清培养基获得菌），转入BMMY中诱导表达，这些步骤都需要在超净工作台里进行。
8.5是否染菌问题如果要区分是否染菌，可以取一些到显微镜下观察，或者闻气味（酸甜的是酵母），观颜色（乳白色的是酵母）。
有可能会在没有达到4天的时间培养基就干了，所以可以适当补充一些，以及在摇床里放置盛有无菌水的深口瓶，来保持摇床里湿度。
8.6诱导无甲醇添加问题诱导物甲醇注意要在超净台中打开，可以分装到灭过菌的瓶子中（当然甲醇是不能灭菌的，而且也要注意在用酒精灯过甲醇瓶口的时候要小心，如果真的引起爆炸那可就损失大了）。
另外如果觉得每天添加甲醇麻烦，也有人用一次性注射器透过纱布添加甲醇，这个方法可能会造成染菌，慎选。
8.7诱导后通氧问题酵母在无氧和有氧的情况下都可以存活，但是在甲醇诱导的情况下毕赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧气量对于这基因的表达影响重大，但是由于害怕感染大肠杆菌，纱布裹的也不能太少，最好专辟出一个摇床进行三十度酵母表达，这样可以考虑将纱布减少到3—5层，同时需要注意的是摇瓶内菌液体积不要超过10-30%。
8.8取样SDS-PAGE分析问题样品不一定要1煮过冻存，但应避免反复冻融，最好分装保存。
另外为了防止蛋白在分泌出来的过程就降解了（特别是小分子蛋白），也可以通过调节培养基pH值抑制蛋白水解酶的活性（这一方面说明书讲解得详细），还可以加入酪蛋白氨基酸等保护物质，竞争性抑制蛋白水解酶的活性来防止表达产物降解。
8.9样品浓缩问题分泌型培养基，由于培养基中的蛋白浓度低，PAGE胶一般是检测不出来的（除非你的表达蛋白量非常大）。
浓缩方法有TCA法，硫酸氨盐析，PEG沉淀，透析，超滤等等。
另外跑胶的时候同时对照酵母胞内蛋白，以防没有分泌出来。
如果小到20kD以下，可以考虑用tricine胶8.10样品纯化问题如果选用的载体是带有信号肽的，分泌表达好纯化，但实际上毕赤酵母本身还是有本底表达的，而且有时候会造成假阳性，最后表达过程需要用Western blot或者Elasa，通常都是用WB。
如果本身蛋白没有合适抗体（如果是利用从大肠表达出来的蛋白做出的抗体也有可能与用真核系统表达出来的蛋白无法发生免疫作用），可以选用anti-myc或者anti-his的，前提当然是你的蛋白没有提前终止。