高效液相色谱法教学【全】
高效液相色谱法教案
高效液相色谱法教案
一、课时安排
课时安排 | 教学内容
1 | 液相色谱基础知识介绍
2 | 实验工艺要求及操作细节介绍
3 | 数据分析与结果评价
二、教学目标
1. 掌握高效液相色谱的原理及实验步骤；
2. 学会如何用高效液相色谱检测物质的实验方法；
3. 能够正确评价液相色谱的结果和数据分析；
4. 掌握液相色谱在实际生产中的应用。
三、教学内容
1. 高效液相色谱的原理及实验步骤：
介绍高效液相色谱的操作原理，建立色谱柱，确定检测射入方式，调节pH值，控制升温排量率，调节流速等步骤；
2. 实验工艺要求及操作细节介绍： 通过理论讲解及实际操作，让学生熟练掌握操作和实验注意事项；
3. 数据分析与结果评价：
通过给出的数据让学生灵活分析，结合实际情况，来判断实验的成果是否达到要求，进行正确评价。
四、活动组织
以理论讲解结合实实操作的方式，依次完成操作过程和检测结果，批改数据分析结果，综合实验结果判断实验成果。
实验四 高效液相色谱法测定水体中的苯酚及α-萘酚
- 1 - 高效液相色谱法测定水体中的苯酚和α-萘酚
一、实验目的
1、了解色谱法的分离原理，初步学会使用高效液相色谱仪；
2、利用高效液相色谱仪分离测定水体中的苯酚及α-萘酚。
二、实验原理
1、色谱法的分离原理
溶于流动相中的各待测组分经过色谱柱固定相时，由于各组分与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸收、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出，达到分离的目的，又称色层法、层析法。
2、高效液相色谱仪使用原理
高效液相色谱仪由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成四个系统即高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。
储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。
正是根据物质的定性与定量关系，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。
3、苯酚及α-萘酚的分离原理及标准溶液准备
对于一些组分比较简单的已知范围的混合物，或无已知物的情况下，可以利用保留值定性。保留值的大小取决于分配系数之比，即与组分的性质、固定液的性质及柱温有关，与固定液的用量、柱长、流速及填充情况无关。在一定操作条件下，用对照品配成不同浓度的对照液，定量进样，用峰面积或峰高对对照品的量（或浓度）做校正曲线，求回归方程，然后在相同条件下分析试样，计算含量，这种方法称为校正曲线法。通常截距近似为零，若截距较大，说明存在一定的系统误差。本实验，苯酚的波长为270nm，α-萘酚的波长为295nm。使得两种物质 - 2 - 的吸收峰达最大值，最终选定在254nm条件下。分别配置单样和混合液浓度为100mg/L、80mg/L、60mg/L、40 mg/L、20mg/L标准溶液，分别进样，记录保留时间和出峰面积，用于定性分析。绘制标准曲线，用于定量分析，计算出样品浓度。
高效液相色谱讲义
1
高效液相色谱法
色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分 离植物色素时采用。后来逐渐发展了柱色谱法，纸色谱法，气相色谱法，高效液相色谱法。高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。
高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率 和实现了自动化 操作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器。
一、分离原理及分类。二、HPLC与GC差别 三、HPLC与经典LC区别 四、高效液相色谱仪流程图。五、HPLC特点.
一、液相色谱分离原理及分类
和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。
二、HPLC与GC差别
相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测
主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：
12《仪器分析》高效液相色谱法(3课时)
武汉软件工程职业学院教案（理论教学首页）
第 1 页 章节名 称 第三篇、色谱分离技术
授 课安 排 授 课
时 数 3 授 课时 间
授 课
方 法 讲授 授 课
教 具
教 学目 的 1、了解高效液相色谱法特点
2、了解高效液相色谱仪
教 学重 点 高效液相色谱法特点
教 学
难 点 高效液相色谱仪
项目十九 现代高效液相色谱仪的认知
一、高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪70年代初发展起来的一种新型分离分析技术。在常压下操作的液相色谱，分离一个样品往往长达几小时至几十小时，因此工作效率很低。人们曾对这种经典液相色谱法试用了柱前加压或柱后减压的办法来提高流速，以缩短分离时间，但是结果失败了。根据液相色谱理论，因为随着流动相流速的提高，板高则增大，所以柱效会显着降低。随着生产技术的提高，人们制成了细小（<10μm）而高效的填充物，从而使柱效大大提高。但是随着填充物粒度的减小，柱压降显着增大，为了得到合理的流动相流速，使用了高压；输液泵，使流速达到1～10 mL/min。从而使分析一个多组分样品只需几分钟到几十分钟时间。随着高效固定相、高压泵和高灵敏度检测器以及电子技术和计算机技术的应用，70年代以来逐步实现了液相色谱分析的高效、高速、高灵敏和自动化操作。因此人们常称它为高效液相色谱或现代液相色谱，以区别于经典液相色谱。
与气相色谱相比高效液相色谱具有如下特点：
1．分析范围广 气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。
2．可选择的流动相多 气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。
第十八章高效液相色谱法
第十八章高效液相色谱法
Document number【SA80SAB-SAA9SYT-SAATC-SA6UT-SA18】
第十八章 高效液相色谱法
15.外标法测定黄芩颗粒剂中黄芩苷含量：色谱柱为Zirchrom C8柱（20cm×，5um）；流动相为乙腈-甲醇-水（含%三乙胺，磷酸调）（28：18：54）；以黄芩苷对照品配成浓度范围为～ml的对照品溶液。进样，测得黄芩苷峰面积，以峰面积和对照品浓度求得回归方程为：A=××103，r=.精密称取黄芩颗粒，置于50ml量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1ml于10ml量瓶中，30%甲醇定容到刻度，摇匀即得供试品溶液。平行测定供试品溶液和对照品溶液（ml），得峰面积分别为4250701，5997670.
解：标样标样AAcc 599767042507018.6110/样c %4.17%1001255.01050%6样cw
16．校正因子法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量：ODS色谱柱；甲醇-水（60：40）流动相；检测器UV280nm；对硝基甲苯为内标物。
（1）校正因子的测定：取对硝基甲苯（内标物）、炔诺酮和炔雌醇对照品适量，用甲醇制成10ml溶液，进样10ul，记录色谱图。重复三次。测得含ml内标物、ml炔诺酮和ml炔雌醇的对照品溶液平均峰面积列于表18-6。
（2）试样测定：取本品20片，精密称定，求出平均片重（片）。研细后称取（约相当于炔诺酮），用甲醇配制成10ml供试品溶液（含内标物ml）。测得峰面积列于表18-6。
表18-6 复方炔诺酮片中各成分及内标物平均峰面积（uv·s）
炔诺酮
炔雌醇 内标物
对照品溶液
供试品溶液 ×106
×106 ×105
×105 ×105
×105
解：02.3)10587.6/(100733.0)10043.1/(10035.0A/mA/mf55ss醇醇醇
高效液相色谱培训课件
培 训 课 件
年月
目 录
……..液相色谱的理论部分
……..液相色谱的操作部分（三聚氰胺的检测）
……..色谱柱的安装
…….. 三聚氰胺检测卡的使用
…….. 水解蛋白的检测
.…….灰分的测定
…….马弗炉的使用
……..食品中蛋白质的测定
……仪器回收率的测定
……的使用
……..塑化剂的检测
一、高效液相色谱的理论部分
一、 色谱定义
1、 色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术。
2、 流动相：携带样品流过整个系统的流体。
3、 固定相：静止不动的一相，色谱柱。
二、 色谱的分类
1、 高效液相色谱。、气相色谱。、薄层色谱。、毛细管电泳。
三、 色谱优点
1、 同时分析。、分离性能好。、灵敏度高（—）。、进样量小（—μ）。
四、 色谱要求
1、 水：专门的纯水机或超纯水机，理想的用水应为18.2MΩ 超纯水，并通过μ的滤膜，除去热源、有机物、无机离子等。不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水。
2、 有机溶剂：色谱纯，用前需要有机膜过滤，超声。
3、 缓冲盐：水系膜过滤，超声，冷藏，易长菌。使用前后必需要用：的甲醇水过渡，不能直接使用纯有机溶剂。否则会造成腐蚀、磨损、阻塞等现象。使用前后，需要用纯水冲洗泵头清洗管路，易受细菌和霉菌的影响。
4、 脱气（超声）：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡。泵中气泡使液流波动，改变保留时间各峰面积；柱中气泡使流动相绕流，峰变形；检测器中的气泡产生基线波动。
五、 高压梯度洗脱：用两台高压输液泵将两种溶剂输入。避免分析时间长，分离度差，在最短时间内获得最佳的分离。
六、 柱温箱，我们设定的柱温为40℃，这样是为了分析结果重现性好，提高柱效，降低柱压，保证检测稳定性。
七、 分析柱的维护
1、 在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下（）冲洗，长时间未用的分析柱也要同样处理。
2、 定期作用强溶剂冲洗柱子。
3、 我们使用的流动相主要是缓冲盐，要先用：的甲醇水溶液冲洗，再用有机溶剂冲洗。
高效液相色谱法讲义(包含讲义和实验)
高效液相色谱仪在基础有机化学实验产物分析中的应用
第一部分：基础理论部分
一、色谱法简介
1. 色谱法简史
1906年俄国植物学家茨维特（Tswett）首次提出“色谱法”（Chromatography）的概念。他在论文中写到：“（原文）植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，后用纯石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，就像光谱一样，称之为色谱图。”
2. 色谱法分类
色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。根据物质的分离机制的不同，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。
（1）吸附色谱
吸附色谱利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。
（2）分配色谱
分配色谱是利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。分配色谱的色谱过程本质上是组分分子在固定想和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。
（3）离子交换色谱
离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。
（4）凝胶色谱
凝胶色谱的原理比较特殊，类似于分子筛。待分离组分在进入凝胶色谱后，会依据分子量的不同，进入或者不进入固定相凝胶的孔隙中，不能进入凝胶孔隙的分子会很快随流动相洗脱，而能够进入凝胶孔隙的分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现了根据分子量差异对各组分的分离。调整固定相使用的凝胶的交联度可以调整凝胶孔隙的大小;改变流动相的溶剂组成会改变固定相凝胶的溶涨状态，进而改变孔隙的大小，获得不同的分离效果。
第三章 高效液相色谱法
第三章 高效液相色谱法
第一节 高效液相色谱法的特点
以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法
引入气相色谱法的理论，在技术上采用新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化
一、 经典液相柱色谱法与高效液相色谱法的比较
经典液相色谱 高效液相色谱
常压或减压 高压，40~50MPa
填料颗粒大，75～600μm 填料颗粒小，2 ～ 50μm
柱效低，2 ～ 50 块/m 柱效高,40000 ~ 60000 块/m
分析速度慢，1～20小时 分析速度快，0.05～1.0 h
色谱柱只用一次 色谱柱可重复多次使用
不能在线检测 能在线检测
二、气相色谱法与高效液相色谱法的比
相同：兼具分离和分析功能，
均可以在线检测
主要差别：分析对象的差别、
流动相的差别、
操作条件差别
分析对象的差异
GC 能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品
高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测
占有机物的20%
HPLC 溶解后能制成溶液的样品
不受样品挥发性和热稳定性的限制
分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测
用途广泛，占有机物的80%
流动相差别
GC： 流动相为惰性气体
组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用
HPLC：流动相为液体
高效液相色谱测定法
高效液相色谱测定法
高效液相色谱测定法（High Performance Liquid
Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和定量技术，可以用于分离和测定复杂的混合物。它基于物质在流动相（溶剂）和固定相（色谱柱上的填料）之间的相互作用的差异，利用流动相的流动将待测样品分离成不同的组分。通过分析组分的保留时间和色谱峰的峰面积或峰高，可以定量不同组分的含量或浓度。
高效液相色谱测定法具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、重复性好等优点，因此在许多分析领域得到广泛应用。它可以应用于生物医药、环境监测、食品安全等多个领域，用于分析和监测有机化合物、无机化合物、药物、天然产物、食品成分等。
高效液相色谱测定法的基本步骤包括：样品预处理、制备流动相、样品进样、流动相流动、色谱柱分离、检测器检测、结果处理等。根据样品的性质和分析要求，可以选择不同的检测器，如紫外检测器（UV）、荧光检测器、质谱检测器等。
需要注意的是，高效液相色谱测定法在操作过程中需要注意样品制备和仪器条件的优化，以提高分离效果和分析结果的准确性。此外，也需要注意流动相成分的选择、色谱柱的使用寿命等因素对分离效果的影响。
高效液相色谱使用详细操作步骤(精品资料).doc
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高效液相色谱使用操作步骤
一、泵操作面板
PUMP：运行键 START：梯度运行键 PURGE：快冲键
RESET：复位键 HOLD： 程序暂停键 STOP： 泵停止键
TIME： 程序开启键 FLOW：流速： RSVR： A B C
PROG：程序 DEL：删除程序 PMAX：最大压力
PMIN：最小压力 ENTER：确定
TIME 0 FLOW ENTER （设置流速）
TIME 0 RSVR ABC ENTER （设置溶剂）
TIME 0 PROG ENTER （设置程序）
TIME 0 % A 30 ENTER （设置比例）
TIME 0 % B 30 ENTER （设置比例）
TIME 0 % C 40 ENTER （设置比例）
DEL PROG 1 ENTER （删除程序）
1. 对于梯度泵设定举例如下：(人参皂苷的梯度)
TIME 0 PROG 1 ENTER
TIME 0 % A 81 ENTER
TIME 15 % A 81 ENTER
TIME 60 % A 65 ENTER
TIME 65 % A 0 ENTER
TIME 80 % A 0 ENTER
TIME 81 % A 81 ENTER
TIME 100 % A 81 ENTER
因为A+B之和始终是100%，所以B相就不用设了。
7．对于对照品在这种条件下只要对照品的峰全部出完后按下RESET键等20分钟即可进第二针进完针后按START键运行梯度程序。但是对样品来说一定要等峰出完后再按下RESET键等基线基走直才可进下一针。